Dalam kondisi in vitro. Tahap kunci perbanyakan tanaman IN VITRO. Metode penelitian imunologi

V. V. Rogovaya, M. A. Gvozdev

FITUR PROPAGASI MIKROKLONAL BUDAYA BATU DALAM KONDISI IN VITRO

Makalah ini menyajikan tinjauan yang mengkaji ciri-ciri metode perbanyakan mikroklonal tanaman buah batu dalam sistem in vitro. Perhatian khusus diberikan pada metode perbanyakan dengan tunas ketiak dan metode regenerasi tunas bawahan dari eksplan daun ceri, ceri manis, persik dan aprikot. Masalah kesehatan tanaman dari berbagai patogen dan pengujian bahan tanaman tanaman buah batu untuk mengetahui adanya infeksi virus dipertimbangkan.

Untuk pertama kalinya, perbanyakan mikroklonal dilakukan oleh ilmuwan Perancis Georges Morel pada anggrek pada tahun 50-an abad kedua puluh. Dalam karyanya, ia menggunakan teknik budidaya meristem apikal tanaman. Tanaman yang diperoleh dengan cara ini bebas dari infeksi virus.

Di negara kita, penelitian tentang kesehatan tanaman dengan menggunakan metode meristem dan mikropropagasi klonal dimulai pada tahun 60an di Institut Fisiologi Tumbuhan. K. A. Timiryazev Akademi Ilmu Pengetahuan Uni Soviet.

Perbanyakan mikroklonal adalah produksi tanaman secara in vitro yang secara genetik identik dengan eksplan aslinya (suatu metode perbanyakan tanaman secara vegetatif dalam kultur in vitro). Mikropropagasi didasarkan pada sifat unik sel tumbuhan somatik - totipotensi - kemampuan sel untuk sepenuhnya mewujudkan potensi genetik seluruh organisme.

Saat ini, berbagai metode perbanyakan mikroklonal tanaman pertanian (terutama perbanyakan vegetatif) dalam sistem in vitro menjadi semakin relevan: perbanyakan dengan tunas ketiak dan tunas tambahan, morfogenesis tidak langsung, dan embriogenesis somatik.

Penggunaan metode ini memungkinkan untuk:

Mempercepat proses seleksi, sehingga waktu untuk memperoleh produk yang dapat dipasarkan berkurang menjadi 2-3 tahun, bukan 10-12;

Menerima dalam waktu singkat sejumlah besar bahan sehat dan bebas virus yang secara genetik identik dengan tanaman induk;

Bekerja dalam kondisi laboratorium dan memelihara tanaman yang tumbuh aktif sepanjang tahun;

Perbanyak tanaman tanpa kontak dengan lingkungan luar, yang menghilangkan dampak faktor abiotik dan biotik yang merugikan;

Memperoleh jumlah tanaman maksimum per satuan luas;

Dalam waktu singkat diperoleh tanaman dalam jumlah besar yang sulit diperbanyak atau tidak dapat diperbanyak secara vegetatif;

Dengan menanam tanaman dengan fase juvenil yang panjang, peralihan perkembangan dari fase juvenil ke fase reproduktif dapat dipercepat;

Mengawetkan bahan tanaman dalam jangka waktu lama (1-3 tahun) secara in vitro (tanpa berpindah ke media segar),

Membuat bank untuk penyimpanan jangka panjang bentuk-bentuk tanaman berharga dan organ-organnya masing-masing;

Mengembangkan metode kriopreservasi bahan yang diolah secara in vitro.

Tahapan mikropropagasi tanaman buah batu dan pengujian adanya infeksi virus

Proses mikropropagasi melibatkan beberapa tahap. Yang utama adalah:

Tahap 1 - pengenalan eksplan ke dalam kultur in vitro;

Tahap 2 - mikropropagasi;

Tahap 3 - proses rooting tunas mikro;

Tahap 4 - peralihan tanaman berakar dari kondisi steril ke kondisi tidak steril.

Langkah penting dalam metode mikropropagasi tanaman in vitro adalah budidaya tanaman uterus bebas virus di rumah tanam atau kotak terisolasi di rumah kaca musim dingin, dalam kondisi yang tidak dapat diakses oleh pembawa virus. Tanaman donor eksplan untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam kultur in vitro harus diuji keberadaan infeksi virus, mikoplasma dan bakteri menggunakan metode diagnostik PCR atau hibridisasi molekuler atau enzim-linked immunosorbent assay (ELISA).

Metode ELISA memungkinkan untuk mendeteksi dengan cepat sebagian besar virus yang menginfeksi buah batu: virus kerdil plum, virus bintik cincin nekrotik pada buah batu, virus potyvirus plum Sharki, non-povirus keriting daun ceri. Klon yang ditemukan bebas dari virus kontak melalui ELISA kemudian dilakukan pengujian dasar, yang meliputi uji serologis yang dikombinasikan dengan uji pada tanaman indikator. Tanaman yang diuji bebas virus dan patogen teregulasi lainnya dimasukkan ke dalam kategori klon dasar “bebas virus”. Jika terdeteksi adanya infeksi, tanaman aslinya dapat direhabilitasi. Untuk meningkatkan kesehatan tanaman buah batu dari virus, sangat disarankan untuk menggabungkan metode termoterapi udara kering dan kultur in vitro. Jika dengan menggunakan kultur meristem apikal yang terisolasi tidak mungkin untuk menghilangkan virus yang diuji, metode kemoterapi digunakan berdasarkan pengenalan bahan kimia ke dalam media nutrisi yang menghambat perkembangan infeksi virus pada tanaman secara in vitro.

Terkadang, untuk mendeteksi mikroflora bakteri secara aktif, media diperkaya dengan berbagai bahan tambahan organik, misalnya kasein hidrolisat, yang memicu perkembangan mikroorganisme saprofit. Infestasi dinilai secara visual setelah 7-10 hari. Eksplan yang “bersih” ditempatkan pada media nutrisi untuk budidaya selanjutnya. Pada tahap ini juga dilakukan penggunaan media tanpa zat pertumbuhan.

Pengenalan kultur in vitro dan mikropropagasi tanaman buah batu

Pada perbanyakan mikro klonal tanaman buah batu, tunas apikal dan lateral, serta ujung meristematik biasanya digunakan sebagai sumber eksplan. Isolasi meristem apikal dilakukan sesuai dengan metode yang berlaku umum setelah sterilisasi bertahap bahan tanaman.

Untuk mikropropagasi buah batu, berbagai media digunakan: untuk mikropropagasi ceri - Pierik, Gautre, White, Heller, untuk ceri dan plum - media Rosenberg, dimodifikasi untuk tanaman buah-buahan dan untuk plum - media Lepoivre dan B5. Namun yang paling cocok untuk perbanyakan mikroklonal buah ceri, ceri manis dan plum adalah media nutrisi Murashige-Skoog (MS).

Tergantung pada tahap perbanyakan mikroklonal tanaman buah batu, 6-benzylaminopurine (6-BAP) ditambahkan ke media nutrisi dengan konsentrasi 0,2-2 mg/l. Pada tahap pengenalan ke dalam kultur in vitro, konsentrasi sitokinin yang lebih rendah digunakan - 0,2 mg/l BAP. Untuk menginduksi perkembangbiakan tunas ketiak agar diperoleh jumlah tunas yang maksimal, dibudidayakan tanaman mikro cherry dengan penambahan BAP dengan konsentrasi 0,5-2 mg/l, tanaman mikro plum - 0,5-1 mg/l BAP.

Proses rooting tunas mikro

Tahap rooting memerlukan perhatian khusus. Proses perakaran pucuk tanaman buah batu secara in vitro bergantung pada karakteristik varietas, jumlah penyaluran yang dilakukan, konsentrasi dan jenis auksin, serta cara penerapannya. Untuk mendapatkan tanaman mikro tanaman buah batu yang terbentuk sempurna, 6-BAP, yang mengganggu proses rhizogenesis, dikeluarkan dari media, dan auksin, terutama asam β-indolyl-3-butyric (IBA), dimasukkan ke dalam media. Telah ditetapkan bahwa konsentrasi optimal IBA dalam media nutrisi berada pada kisaran 0,5-1 mg/l. Adanya IBA dalam medium pada konsentrasi 2 mg/l menyebabkan terbentuknya akar hipertrofi.

Pengenalan bersama obat ribav (1 ml/l) dan fitohormon tradisional auksin [IBA dan β-indolylacetic acid (IAA) masing-masing 0,5 mg/l] ke dalam media perakaran meningkatkan persentase perakaran pucuk sejumlah varietas batu tanaman buah-buahan.

Dalam studi perbandingan penginduksi pembentukan akar: IAA, IAA dan asam a-naftilasetat (NAA), efisiensi IAA yang tinggi pada konsentrasi 6,0 mg/l terungkap. Jumlah terbesar dari potongan mikro ceri berakar diperoleh pada media yang mengandung NAA. Namun pada saat yang sama, pertumbuhan kalus yang intensif terjadi di daerah basal pucuk, sehingga menyulitkan pemindahan tanaman tabung reaksi yang berakar ke kondisi yang tidak steril.

Untuk perakaran tanaman buah batu tabung yang efektif, tidak hanya jenis stimulator yang sangat penting, tetapi juga metode penerapannya. Selain memasukkan auksin ke dalam media nutrisi, untuk menginduksi rhizogenesis, digunakan perendaman awal pucuk dalam larutan berair steril IBA (25-30) mg/l dengan pemaparan 12-24 jam. Percobaan menunjukkan bahwa perlakuan potongan mikro dengan larutan IBA dalam air lebih efektif daripada memasukkan regulator ini ke dalam media kultur. Kemunculan besar-besaran akar petualang pertama ketika perlakuan awal dengan penginduksi rhizogenesis diterapkan terjadi pada hari ke 20-25. Cara lain untuk menginduksi rhizogenesis adalah dengan perlakuan pada pucuk tanaman buah batu dengan serbuk talk auksin yang mengandung IBA dengan konsentrasi 0,125%, 0,25% dan IAA dengan konsentrasi 0,25%, 0,5%. Saat menggunakan bubuk hormonal, efisiensi tinggi dan kemampuan manufaktur dari penggunaan penginduksi rhizogenesis dicatat. Namun penggunaan bubuk talk IMC dengan konsentrasi auksin yang berbeda menunjukkan kekhususan varietas dalam perakaran potongan mikro plum.

Proses rhizogenesis terjadi paling intensif pada media MS dan White yang dimodifikasi. Menurut data lain, media terbaik untuk pembentukan akar adalah media dengan unsur makro menurut Heller dengan penambahan vitamin dan media MS setengah encer dengan kandungan sukrosa tereduksi 15 mg/l dan kecuali meso-inositol, yang mendorong pembentukan jaringan kalus. Namun sebagian besar penelitian menggunakan media Murashige dan Skoog untuk mengakarkan tunas mikro tanaman buah batu.

Metode mikropropagasi

Ada beberapa metode perbanyakan tanaman secara mikroklonal secara in vitro:

Metode perbanyakan dengan tunas ketiak;

Metode perbanyakan dengan tunas tambahan;

Morfogenesis tidak langsung;

Embriogenesis somatik.

Untuk semua jenis regenerasi in vitro, dapat dibedakan empat kelompok faktor yang menentukan keberhasilannya: genotipe dan kondisi tanaman induk asli; kondisi dan metode budidaya; komposisi media nutrisi; ciri-ciri memasukkan eksplan ke dalam kultur steril.

Pengaruh genotipe terhadap efisiensi mikropropagasi

Genotipe memiliki pengaruh paling signifikan terhadap efisiensi mikropropagasi. Respon tanaman terhadap kondisi budidaya aseptik bergantung pada karakteristik varietas dan dijelaskan oleh perbedaan kemampuan regeneratif varietas tanaman buah dan beri. Misalnya, ketika mikropropagasi klonal digunakan untuk mempercepat perbanyakan varietas ceri baru, sifat-sifat varietas ditemukan menjadi faktor dominan dalam kemampuan tanaman untuk melakukan mikropropagasi.

Perbedaan varietas muncul baik pada tahap proliferasi maupun pada tahap pembentukan akar.

Di antara eksplan varietas yang berbeda dari jenis tanaman buah yang sama, tingkat respons yang berbeda terhadap zat pengatur tumbuh yang termasuk dalam medium sering diamati, yang tampaknya mencerminkan, sampai batas tertentu, kandungan zat pertumbuhan endogen, yang merupakan karakteristik yang ditentukan secara genetik. spesies atau varietasnya. Pada saat yang sama, realisasi potensi morfogenetik dalam kultur embrio in vitro, pada hibrida antara spesies Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa, terutama ditentukan oleh genotipe dan pada tingkat lebih rendah bergantung pada komposisi. dari media nutrisi.

Kondisi budidaya

Faktor lain yang menentukan keberhasilan mikropropagasi tanaman adalah kondisi budidayanya. Kondisi optimal untuk budidaya tanaman buah batu adalah: suhu 22-26 °C untuk ceri dan 26-28 °C untuk plum, penerangan 2000-5000 lux untuk ceri dan 3500 lux untuk plum dengan fotoperiode 16 jam. Tanaman mikro harus ditanam di ruang iklim atau ruang terkendali.

Perlu dicatat bahwa pada varietas ceri pada tahap proliferasi, peningkatan koefisien reproduksi dan peningkatan proporsi tunas yang cocok untuk rooting dapat dicapai dengan mengganti komposisi mineral media nutrisi dan penggunaan lampu cahaya biru (LP 1 ). Tunas tanaman buah batu dalam jumlah besar - hingga 30 - dapat terbentuk jika regeneran berorientasi horizontal. Untuk meningkatkan laju perbanyakan pada tahap pertama, konglomerat tunas dan pucuk tanaman buah batu tidak dapat dibagi menjadi unit-unit tersendiri, tetapi dipindahkan seluruhnya ke media hara segar. Bila menggunakan teknik ini, faktor perkaliannya meningkat tajam dan bisa mencapai 40-70 per lintasan, tergantung varietasnya.

Cara perbanyakan dengan tunas ketiak: morfogenesis tidak langsung

Metode perbanyakan mikroklonal yang paling dapat diandalkan adalah metode regenerasi tanaman melalui pengembangan tunas ketiak. Keuntungan metode ini adalah reproduksi genotipe asli yang relatif cepat, sekaligus menjamin stabilitas fenotipik dan genotipe tertinggi. Potensi metode mikropropagasi in vitro ini diwujudkan dengan menambahkan sitokinin ke dalam media nutrisi, yang menghambat perkembangan tunas apikal batang dan merangsang pembentukan tunas aksila.

Proses perbanyakan mikroklonal buah ceri menggunakan metode kultur meristem apikal terisolasi didasarkan pada fenomena menghilangkan dominasi apikal, yang mendorong perkembangan selanjutnya dari meristem yang ada dan menjamin homogenitas genetik bahan tanam.

real. Penghapusan dominasi apikal dicapai dengan menambahkan sitokinin. Banyak varietas ceri dicirikan oleh aktivitas mitosis yang tinggi pada puncaknya, yang berkontribusi pada pembentukan konglomerat tunas bercabang dan tunas mikro lateral.

Stabilitas genetik bahan yang diperoleh secara in vitro bergantung pada model reproduksi. Proses perkembangbiakan tanaman buah batu berhubungan dengan perkembangbiakan meristem ketiak. Stabilitas genetik merupakan sifat integral dari meristem, yang dapat dipertahankan secara in vitro jika meristem dibudidayakan dalam kondisi yang menghambat pembentukan kalus. Jika digunakan media yang merangsang pembentukan kalus, variabilitas genetik dapat terjadi.

Untuk memperoleh tingkat reproduksi yang lebih tinggi, media nutrisi seringkali diperkaya, selain obat yang bersifat sitokinin, dengan zat dari golongan auksin, yang merangsang perkembangan jaringan kalus. Kombinasi kedua obat ini digunakan untuk menginduksi organogenesis pada jaringan kalus. Dalam sistem tunas kalus, struktur tunas yang terorganisir dapat mempengaruhi proses organogenesis, merangsang meristematisasi sel-sel kalus, yang dapat menimbulkan organ-organ dengan sifat-sifat yang berubah. Memvariasikan kandungan zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke media kultur saja untuk mencapai proliferasi sel yang maksimal dapat mempengaruhi stabilitas genetik bahan yang dihasilkan.

Cara perbanyakan dengan tunas tambahan dan morfogenesis tidak langsung

Tunas petualang disebut tunas yang muncul langsung dari jaringan dan sel eksplan tumbuhan, yang biasanya tidak membentuknya. Tunas Adventitious (atau Adventitious) terbentuk dari zona meristem, paling sering terbentuk sekunder dari jaringan kalus. Tunas petualang dapat muncul dari jaringan meristem dan non meristem (daun, batang). Pembentukan tunas tambahan pada banyak spesies tanaman disebabkan oleh tingginya rasio sitokinin terhadap auksin dalam media nutrisi.

Regenerasi pucuk, akar atau embrioid dari sel tumbuhan somatik eksplan dapat terjadi melalui regenerasi tidak langsung - pembentukan kalus dan pembentukan tunas, atau melalui regenerasi "langsung", ketika sel eksplan mampu beregenerasi tanpa pembentukan jaringan kalus.

Tunas petualang dapat terbentuk pada eksplan daun, tangkai daun, akar dan organ tanaman lainnya dari berbagai jenis tanaman buah batu dan buah-buahan. Memperoleh tunas langsung dari eksplan dalam beberapa kasus digunakan untuk kloning tanaman, namun hal ini dapat mengakibatkan tanaman secara genetik tidak stabil. Oleh karena itu, metode permudaan tanaman ini dapat digunakan untuk menginduksi tanaman yang mempunyai genetik yang beragam.

Tunas regeneratif dapat diinduksi dari berbagai bagian helai daun, namun jaringan mempunyai kemampuan regenerasi paling besar

pangkal daun, karena sel meristematik paling aktif terletak di zona helaian daun ini. Perlu juga diperhatikan bahwa potensi morfogenetik daun meningkat seiring letaknya di bagian atas batang. Tunas petualangan beregenerasi lebih baik dari jaringan meristematik muda daun yang sedang berkembang. Namun, bila daun yang lebih tua digunakan, tunas yang diubah secara genetik lebih mungkin terjadi.

Untuk meregenerasi tunas tanaman buah batu seperti ceri, ceri manis, persik, aprikot, dari eksplan awal (daun utuh dan ruasnya), digunakan berbagai media: Murashige-Skoog (MB), Lloyd dan McCown (WPM), Driver dan Kuniyuki (DKW), Kuren dan Lepoiv-ra (QL).

Untuk percobaan regenerasi cherry sekunder, media Lloyd dan McCown untuk tanaman berkayu - Woody Plant Medium (WPM), yang dilengkapi dengan berbagai stimulan pertumbuhan, paling sering digunakan. Dari sitokinin, 6-BAP, thidiazuron (TDZ) terutama digunakan, dan auksin - NAA, IBA, asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D).

Penting untuk dicatat bahwa di kalangan peneliti asing tidak ada konsensus mengenai efektivitas penggunaan TDZ dalam regenerasi tunas dibandingkan dengan BAP, pada jenis eksplan (daun utuh, dengan potongan melintang atau tersegmentasi) dan pada metode budidaya. eksplan (abaksial atau adaksial permukaan ke atas).

Persentase regenerasi yang tinggi diamati pada eksplan daun ceri utuh (dengan potongan melintang sepanjang pelepah daun), yang ditempatkan permukaan abaksial (bawah) ke atas pada media WPM yang dilengkapi dengan 2,27 atau 4,54 |M TDZ + 0,27 |M NUK.

Di sisi lain, penelitian menunjukkan bahwa BAP lebih efektif dibandingkan TDZ dalam regenerasi tanaman dari daun ceri dan daun ceri manis, dan juga bahwa BAP dan NAA pada konsentrasi 2 mg/l dan 1 mg/l merupakan kombinasi optimal. zat pengatur tumbuh tanaman ceri dan ceri. Frekuensi regenerasi tertinggi diperoleh pada media WPM, meskipun merangsang kalusogenesis lebih besar dibandingkan pada media MS, QL, dan DKW. Ketergantungan efisiensi pembentukan kalus pada jenis ruas daun terungkap. Dengan demikian, tingkat pembentukan kalus tertinggi terdapat pada ruas daun tengah; yang terendah - pada segmen apikal dan regenerasi langsung (tanpa pembentukan kalus) dicatat pada segmen dasar.

Regenerasi sekunder cherry hitam (Prunus serótina Ehrh.) lebih sering terjadi pada eksplan daun yang dibudidayakan pada media WPM yang dilengkapi dengan TDZ dibandingkan dengan media DKW yang dimodifikasi.

Efisiensi regenerasi petualang cherry liar (Prunus avium L.) sangat dipengaruhi oleh ukuran eksplan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ukuran eksplan daun sangat penting untuk pembentukan tunas tambahan; daun dengan panjang 3-5 mm membentuk jumlah tunas tambahan terbesar. Untuk regenerasi awal ceri liar, digunakan media WPM yang dilengkapi dengan 0,54 tM NAA dan 4,4 tM TDZ.

Perlakuan awal khusus sebelum budidaya (perendaman dengan 5 mg/L 2,4-D selama satu hari) efektif dalam menginduksi tunas-tunas tambahan dari eksplan daun ceri. Budidaya eksplan daun selanjutnya pada media agar regenerasi WP yang dilengkapi dengan TDZ 5 mg/l meningkatkan efisiensi regenerasi sekunder ceri. Eksplan daun kersen yang masih muda menunjukkan kemampuan regenerasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan eksplan yang sudah tua.

Perlu diperhatikan pengaruh signifikan inhibitor etilen terhadap regenerasi daun berbagai varietas aprikot. Misalnya, penelitian menunjukkan bahwa penggunaan inhibitor etilen (perak tiosulfat atau aminoetoksivinilglisin) bersama dengan kandungan kanamisin yang rendah meningkatkan regenerasi tambahan lebih dari 200%. Penggunaan agar murni juga meningkatkan regenerasi dari daun aprikot dibandingkan penggunaan agar gel atau agarosa. Dalam karya ini dilakukan kajian pada media LQ, DKW yang dilengkapi dengan TDZ dan NUK. Cara budidaya daun yaitu dengan permukaan adaksial terhadap medium.

Peneliti Italia telah mengembangkan metode regenerasi petualangan dari daun persik utuh, yang diinkubasi dalam gelap pada media yang dilengkapi dengan 6-BAP dan NAA. Penelitian menggunakan kombinasi makrosalt dan mikrosalt berbagai media menurut MS, Quoirin, Rugini dan Muganu, baik sitokinin - 6-BAP dan TDZ, serta metode budidaya daun - permukaan adaksial yang bersentuhan dengan media regenerasi. Kalus berkembang di pangkal tangkai daun. Tunas-tunas tambahan muncul pada kalus ini setelah dipindahkan ke media bebas auksin dan ditanam di tempat terang. Kemampuan morfogenetik kalus dipertahankan selama beberapa bulan. Dalam penelitian ini, tunas tambahan buah persik muncul melalui morfogenesis tidak langsung.

Morfogenesis tidak langsung melibatkan diferensiasi sekunder tunas dari jaringan kalus. Untuk membentuk kalus yang kemudian dibentuk tunas, digunakan berbagai eksplan. Untuk memperoleh kalus morfogenik dari tanaman tahunan, harus diambil ujung pucuk atau bagian jaringan meristematik yang diisolasi darinya. Sistem ini tidak direkomendasikan untuk perbanyakan tanaman secara in vitro karena ketidakstabilan genetik. Morfogenesis tidak langsung penting untuk mempelajari variabilitas somaklonal dan memperoleh varian somaklonal.

Di Inggris, di Departemen Fisiologi di Stasiun Percobaan Maidstone, dipelajari regenerasi tanaman dari kalus batang dan daun pada batang bawah Colt cherry. Inisiasi kalus dilakukan pada media Mu-rasige-Skoog yang mengandung 2,0-10,0 mg/l NAA. Kalus yang dihasilkan dipindahkan ke media regenerasi yang mengandung BAP dengan konsentrasi 0,5 mg/l. Tunas kalus pada batang bawah ceri ini dapat diregenerasi.

Di Laboratorium Genetika Pusat yang dinamai IV Michurin, pembentukan akar diamati pada kultur jaringan kalus yang diperoleh dari pucuk ceri tahunan. Saat disemai kembali pada media dengan zat pengatur tumbuh, terlihat munculnya formasi meristematik.

Embriogenesis somatik

Metode lain perbanyakan mikroklonal tanaman in vitro adalah embriogenesis somatik - proses pembentukan struktur mirip embrio dari sel somatik (non-reproduksi). Embrio somatik adalah struktur bipolar independen yang tidak melekat secara fisik pada jaringan, dari mana struktur terbentuk di mana puncak batang dan akar berkembang secara bersamaan.

Pembentukan embrio somatik dalam kultur sel, jaringan dan organ dapat terjadi secara langsung maupun tidak langsung. Embriogenesis somatik langsung adalah pembentukan embrio vegetatif dari satu atau beberapa sel jaringan eksplan tanpa tahap pembentukan kalus perantara. Embriogenesis tidak langsung terdiri dari beberapa tahap: penempatan eksplan dalam kultur, selanjutnya stimulasi pertumbuhan kalus dan pembentukan pra-embrio dari sel kalus, pemindahan kalus ke media nutrisi tanpa faktor pertumbuhan hingga pembentukan embrio bipolar dari pra-embrio.

Penelitian ini menyelidiki kemungkinan regenerasi tanaman dari kalus yang diperoleh dari akar batang bawah ceri. Kalus diperoleh dari akar yang dipotong atau dari tanaman utuh yang ditanam dalam kondisi steril selama mikrokloning pucuk ceri. Pada batang bawah Colt cherry, kalus yang diperoleh dari akar tanaman utuh membentuk tunas dan struktur mirip embrioid. Kalus ceri dibudidayakan pada media Murashige-Skoog yang dilengkapi dengan BAP, HA dan NAA. Frekuensi pembentukan tunas lebih tinggi dibandingkan frekuensi pohon apel yang dianalisis secara paralel. Tanaman hasil regenerasi diperbanyak melalui kultur jaringan dan ditransplantasikan ke dalam tanah. Bibit tanaman hasil regenerasi yang diperoleh dari batang bawah kalus kersen tidak berbeda fenotipenya dengan batang bawah aslinya.

Induksi embriogenesis somatik pada varietas ceri (Prunus cerasus L.) diamati ketika eksplan dibudidayakan pada media Murashige-Skoog yang dilengkapi dengan berbagai kombinasi auksin dan sitokinin. Embriogenesis somatik terutama terjadi ketika kombinasi 2,4-D dan kinetin digunakan. Induksi embriogenesis somatik juga dicatat ketika 0,1 mg/l IBA ditambahkan ke media induktif. Penggunaan NAA atau 6-BAP mengurangi induksi embriogenesis somatik dan meningkatkan frekuensi regenerasi tidak langsung pada varietas ceri (Prunus cerasus L.).

Saat ini, cara yang paling dapat diandalkan untuk mendapatkan keturunan yang identik secara genetik adalah perbanyakan mikroklonal tanaman buah batu melalui tunas ketiak dibandingkan dengan embriogenesis somatik, perbanyakan dengan tunas tambahan, dan morfogenesis tidak langsung.

1. Polevoy V.V., Chirkova T.V., Lutova L.A. dkk Lokakarya tentang pertumbuhan dan ketahanan tanaman: Buku Teks. Sankt Peterburg, 2001.Hal.208.

2. Sorokina I.K., Starichkova N.I., Reshetnikova T.B., Grin N.A. Dasar-dasar bioteknologi tanaman. Kultur sel dan jaringan tumbuhan: Buku Ajar. 2002.Hal.45.

3. Chernets A. M., Abramenko N. M., Stakanova R. V. Pengembangan metode penyimpanan in vitro jangka panjang dari klon spesies buah dan stroberi bebas virus // Abstrak konferensi internasional: Biologi sel yang dikultur dan bioteknologi. Novosibirsk, 1988.

4. Romanova N.P., Ulyanova E.K. Tentang masalah penyimpanan meriklon stroberi secara in vitro // Buletin ilmiah dan teknis dari Lembaga Penelitian Ilmiah Produksi Tanaman dinamai N.I. Vavilov. L., 1990. Edisi. 204. hal.75-79.

5. Orlova S. Yu.Fitur biologis dan nilai pemuliaan varietas ceri di barat laut Rusia: Abstrak penulis. dis. ... cand. biol. Sains. Sankt Peterburg, 2002. Hal.20.

6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. Kriopreservasi ujung pucuk ceri dan ceri manis yang ditanam secara in vitro dengan vitrifikasi satu langkah // Scientia Horticulturae. 1997. Jil. 70.Hal.155-163.

7. Vysotsky V. A. Kultur jaringan dan organ terisolasi tanaman buah-buahan: penyembuhan dan perbanyakan mikroklonal // Biologi pertanian: Jurnal ilmiah-teoretis bulanan. M., 1983.No.7.Hal.42-47.

8. Faustov V.V., Oleshko E.V., Zharkova I.V., Asadulaev Z.M., Sharafutdinov H.

B., Ismail H. Perbanyakan ceri secara mikroklonal // Prosiding TSKhA. M., 1988. Edisi 5. hlm.131-148.

9. Bioteknologi tumbuhan: kultur sel // Terjemahan. dari bahasa Inggris V. I. Negruka / Ed. R.G.Butenko. M., 1989.Hal.233.

10. Demenko V.I., Trushechkin V.G. Perbanyakan ceri dengan metode in vitro // Biologi pertanian: Jurnal ilmiah dan teoretis bulanan. M., 1983.No.7.

11. Kashin V.I., Borisova A.A., Prikhodko Yu.N., Surkova O.Yu., Upadyshev M.T. dkk Proses teknologi untuk memperoleh bahan tanam tanaman buah dan beri bebas virus: Pedoman. M., 2001.Hal.97.

12. Shipunova A. A. Mikropropagasi klonal tanaman buah: Abstrak penulis. dis. ... cand. ilmu-ilmu pertanian. M., 2003.Hal.24.

13. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Perbanyakan mikroklonal varietas dan batang bawah tanaman buah batu: Pedoman. M., 1983.Hal.16.

14. Lane W. D. Regenerasi tanaman pir dari meristemtip pucuk // Plant Sci. Surat. 1979. Jil. 16. No.2/3. R.337-342.

15. Fossard R. A., Bourne R. A. Mengurangi biaya kultur jaringan untuk perbanyakan komersial // Kultur jaringan untuk tujuan hortikultura. Akta Hort. 1977. Jil. 78.R.37-44.

17. Oleshko E. V. Fitur mikropropagasi klonal batang bawah dan varietas ceri: Abstrak penulis. dis. ... cand. biol. Sains. M., 1985.Hal.15.

18. Haak E.R., Nuust Yu.O.Mikropropagasi klonal tanaman buah batu // Berkebun dan pemeliharaan anggur. M., 1989. No. 1. Hal. 27-29.

19. Dudchenko O. P. Regenerasi dalam budaya meristem plum terisolasi // Abstrak Konferensi Internasional “Biologi Sel yang Dibudidayakan dan Bioteknologi 2”. Novosibirsk, 1988.Hal.358.

20. Kornatsky S. A., Vysotsky V. A., Trushechkin V. G. Masalah mikropropagasi klonal tanaman buah batu // Kemajuan dalam budidaya buah di Zona Non-Black Earth RSFSR: Koleksi. ilmiah bekerja M., 1991.S.104-116.

21. Induksi morfogenesis dan seleksi jaringan tanaman buah dan beri: Pedoman / Ed. V.E.Perfilieva. 1996.Hal.73.

22. Svitaylo A. M., Bondarenko P. E., Shevchuk N. S. Mikropropagasi klonal batang bawah dan varietas tanaman buah-buahan // Abstrak Konferensi Internasional “Biologi Sel yang Dibudidayakan dan Bioteknologi 2”. Novosibirsk, 1988.Hal.346.

23. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Kornatsky S. A. Mikropropagasi klonal tanaman buah batu dalam sistem produksi bahan tanam yang sehat // Abstrak Konferensi Internasional: Biologi Sel yang Dibudidayakan dan Bioteknologi 2. Novosibirsk. 1988.hlm.319-320.

24. Hammatt N., Grant N. J. Mikropropagasi ceri liar Inggris dewasa // Kultur Sel, Jaringan dan Organ Tumbuhan. 1997. Jil. 47.Hal.103-110.

25. Dzhigadlo M. I. Penggunaan metode bioteknologi dan biofisik dalam seleksi dan pemuliaan varietas tanaman buah dan beri: Abstrak disertasi. dis. ... cand. ilmu-ilmu pertanian. Michurinsk, 2003.Hal.25.

26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. Hubungan antara konsentrasi unsur makro, serapannya dan perbanyakannya pada batang bawah ceri Gisela 5 in vitro // Kultus Organ Jaringan Sel Tumbuhan. 2000. Jil. 63.Hal.9-14.

27. Kornatsky S. A. Fitur mikropropagasi klonal plum dalam sistem bahan tanam yang ditingkatkan: Abstrak disertasi. dis. ... cand. ilmu-ilmu pertanian. M., 1991.Hal.24.

28. Dzhigadlo M.I., Dzhigadlo E.N. Reproduksi ceri dengan metode meristem apikal // Meningkatkan keragaman dan metode progresif dalam budidaya tanaman buah dan beri: Koleksi. Tula, 1988.hlm.65-68.

29. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Meningkatkan media nutrisi untuk mikropropagasi klonal ceri // Agroteknik dan studi varietas tanaman buah-buahan: Koleksi. ilmiah bekerja M., 1985.hlm.72-76.

30. Chernets A. M. Pengaruh nutrisi mineral terhadap intensitas perkembangbiakan varietas ceri in vitro // Abstrak Konferensi Internasional “Biologi Sel yang Dibudidayakan dan Bioteknologi 2”. Novosibirsk, 1988.Hal.343.

31. Nedelcheva S., Ganeva D. Reproduksi in vitro pada tiga substrat vegetatif dari genus Prunus // Rasten. Sains. 1985.Vol.22.No.8.Hal.98-104.

32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. Mikropropogasi dua kultivar plum Perancis (Prunus domestica L.) // Agronomie. 1984. Jil. 4. No.5.R.473-477.

33. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Penggunaan mikrografting dalam mikropropagasi klonal tanaman buah batu // Biologi pertanian. M., 1988.No.4.Hal.75-77.

34. Plaksina T.V. Penggunaan bioteknologi dalam pemuliaan ceri di Altai // Materi konferensi ilmiah dan praktis yang didedikasikan untuk peringatan 70 tahun NIISS dinamai demikian. M. A. Li-savenko: Masalah pembangunan berkelanjutan hortikultura di Siberia. Barnaul, 2003. hlm.108-110.

35. Vysotsky V. A. Pengaruh beberapa zat pengatur tumbuh pada pucuk meristematik terisolasi dari kismis hitam // Penanaman buah dan pertumbuhan buah beri di zona non-chernozem: Koleksi. M.1979. Jilid IX. hal.101-107.

36. LutovaL. A. Bioteknologi Tumbuhan Tingkat Tinggi: Buku Ajar. Sankt Peterburg, 2003.Hal.227.

37. Vysotsky V. A. Tentang stabilitas genetik selama mikropropagasi klonal tanaman buah dan beri // Biologi pertanian. 1995. Nomor 5. Hal. 57-63.

38. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Regenerasi akar, pucuk dan embrio: aspek fisiologis, biokimia dan molekuler // Biologia Plantarum. Jil. 39. Nomor 1. 1997. R. 53-66.

39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Regenerasi tanaman dari daun kultivar ceri asam manis // Scientia Horticulturae. 2002. Jil. 93.Hal.235-244.

40. Bhagwat B., David Lane W. Regenerasi tunas in vitro dari daun ceri manis (Prunus avium) “Lapins” dan “Sweetheart” // Kultur Sel, Jaringan dan Organ Tumbuhan. Belanda. 2004. Vol. 78. P. 173 -181.

41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Regenerasi tunas petualang pada buah persik // Laporan Sel Tanaman. 2002. Jil. 20.Hal.1011-1016.

42. Takashina T., Nakano H., Kato R. Kultur regenerasi tanaman yang efisien dari eksplan daun ceri manis yang ditanam secara in vitro // Acta Horticulturae: Kongres Hortikultura Internasional XXVI: Genetika dan Pemuliaan Buah dan Kacang Pohon. R.622.

43. Burgos L., Alburquerque N. Inhibitor etilen dan konsentrasi kanamisin yang rendah meningkatkan regenerasi tambahan dari daun aprikot // Laporan Sel Tanaman. 2003. Jil. 21.Hal.1167-1174.

44. Hammatt N., Grant N. J. Regenerasi tunas dari daun Prunus serotina Ehrh. (ceri hitam) dan P. avium L. (ceri liar) // Laporan Sel Tumbuhan. 1998. Jil. 17.Hal.526-530.

45. Hibah Neil J., Hammatt Neil. Perkembangan tunas petualang dari daun ceri liar (Prunus avium L.) // Hutan Baru. Belanda. 2000. Jil. 20.Hal.287-295.

46. ​​​​James D. E., Possey A. J., Ma1hotro S. B. Organogenesis pada kalus yang berasal dari jaringan batang dan daun batang bawah apel dan ceri // Kultus Organ Jaringan Sel Tumbuhan. 1984. Jil. 3. Nomor 4.

47. Tyulenev V. M., Naftaliev N. M., Osipova L. V., Rastorguev S. L. Mikropropagasi klonal dari genotipe tanaman buah-buahan yang berharga // Abstrak Konferensi Internasional “Biologi Sel yang Dibudidayakan dan Bioteknologi 2”. Novosibirsk, 1988.Hal.320.

48. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner dan Watkins R. Regenerasi tanaman dari kultur jaringan kalus dari akar ceri Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) dan akar apel M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Ilmu Hortikultura. Inggris. 1984. Jil. 59. No.4.Hal.463-467.

49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Embriogenesis somatik dan organogenesis dari kotiledon embrio yang belum matang dari tiga kultivar ceri asam (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000. Jil. 83.Hal.109-126.

V. Rogovaia, M. Gvozdev

MIKROPROPAGASI KLONAL IN VITRO BUDAYA BUAH BATU

Tinjauan ini difokuskan pada tahapan utama dan metode mikropropagasi klonal in vitro pada kultur buah batu. Penekanan khusus diberikan pada teknik perbanyakan tunas tambahan dan metode regenerasi tunas tambahan dari eksplan daun ceri asam, ceri, persik dan aprikot. Beberapa aspek pengujian bahan tanaman untuk infeksi virus telah ditinjau serta masalah-masalah tertentu dalam pelestarian stabilitas genetik tergantung pada model perbanyakan.

Dalam hibridisasi jauh, metode kultur jaringan terisolasi seperti fertilisasi in vitro, embriokultur (menumbuhkan embrio terisolasi pada media nutrisi buatan), mikropropagasi klonal dari hibrida yang berharga, serta produksi haploid dan kriopreservasi in vitro digunakan.

Fertilisasi in vitro (mengatasi ketidakcocokan terprogram) dilakukan dalam hal tidak mungkin melakukan pembuahan antara pasangan terpilih dalam kondisi alami. Hal ini disebabkan oleh beberapa sebab: 1) fisiologis (ketidaksesuaian waktu pematangan serbuk sari, dll); 2) morfologis (tabung serbuk sari pendek atau menghalangi pertumbuhannya pada berbagai tahap perkembangan, dll.). Fertilisasi in vitro dapat dilakukan dengan dua cara: a) budidaya ovarium pada media nutrisi agar-agar buatan dengan serbuk sari siap pakai yang diaplikasikan; b) ovarium dibuka dan potongan plasenta dengan bakal biji dipindahkan ke media nutrisi, di dekat tempat atau langsung pada jaringan plasenta serbuk sari yang sudah jadi dibudidayakan. Anda dapat menentukan secara visual apakah fertilisasi in vitro telah terjadi atau tidak dengan melihat ukuran bakal biji yang meningkat pesat. Embrio yang terbentuk, pada umumnya, tidak memasuki keadaan tidak aktif, tetapi segera berkecambah dan menghasilkan generasi hibrida. Fertilisasi plasenta in vitro memungkinkan untuk mengatasi ketidakcocokan persilangan varietas tembakau budidaya N. tabacum dengan spesies liar N. rosulata dan N. debneyi dan memungkinkan diperolehnya hibrida tembakau interspesifik dalam percobaan M. F. Ternovsky dkk (1976) , Shinkareva (1986) .

Mengatasi ketidakcocokan pasca nikah. Ketidakcocokan postgamous selama hibridisasi jauh terjadi setelah pembuahan. Hal ini sering kali mengakibatkan terbentuknya benih yang kecil dan tidak berkecambah. Penyebabnya mungkin karena perbedaan waktu perkembangan embrio dan endosperma. Karena perkembangan endosperma yang buruk, embrio tidak mampu berkecambah secara normal. Dalam kasus seperti itu, embrio diisolasi dari butiran kecil yang matang dan ditumbuhkan dalam media nutrisi.

Menumbuhkan embrio dalam media nutrisi buatan disebut embriokultur. Media untuk menumbuhkan embrio dewasa bisa sederhana, tanpa penambahan zat aktif fisiologis (misalnya media White) atau media lain yang mengandung garam mineral dan sukrosa. Dengan persilangan yang lebih jauh, gangguan perkembangan embrio sudah dapat diamati pada tahap awal, yang tercermin dari kurangnya diferensiasi dan pertumbuhan yang lambat. Dalam hal ini, kultur embrio terdiri dari dua tahap - pertumbuhan embrionik embrio, di mana diferensiasinya berlanjut, dan perkecambahan embrio yang tumbuh. Tahap pertama membutuhkan media yang lebih kompleks dengan kandungan sukrosa yang tinggi, dengan penambahan berbagai asam amino, vitamin dan hormon.

Penggunaan embriokultur dalam pemuliaan baru-baru ini menjadi sangat penting untuk memperoleh hibrida jarak jauh dari biji-bijian, sereal, dan tanaman pertanian lainnya. Kemungkinan meningkatkan hasil hibrida gandum-gandum hitam dengan menumbuhkan embrio yang belum matang, serta menggunakan kultur embrio untuk mengatasi ketidakcocokan postgamous selama hibridisasi gandum dengan rumput gandum hitam, telah ditunjukkan.

Metode embriokultur semakin banyak digunakan dalam hibridisasi tanaman sayuran interspesifik. Untuk bawang merah, metode telah dikembangkan untuk menumbuhkan embrio gagal secara in vitro dari benih hibrida dari berbagai tahap embriogenesis, dan menumbuhkan embrio dari hibrida interspesifik yang subur sebagian. Kultur embrio yang diisolasi digunakan dalam pemuliaan tomat dan tanaman sayuran lainnya.

Regulasi hormonal pertumbuhan dan perkembangan embrio tomat dipelajari secara in vitro. Kemungkinan penggunaan embriokultur untuk memperoleh hibrida bunga matahari jauh dibahas, faktor-faktor yang mengendalikan pertumbuhan dan perkembangan embrio bunga matahari in vitro yang diisolasi pada waktu berbeda setelah penyerbukan dipelajari.

Kultur embrio terisolasi sebagai metode tambahan untuk hibridisasi jarak jauh digunakan tidak hanya untuk mengatasi ketidakcocokan postgamous, tetapi juga untuk tujuan mikropropagasi hibrida yang berharga. Dalam hal ini mikropropagasi terjadi melalui kalusogenesis, induksi morfogenesis dan produksi tanaman regenerasi dari jaringan kalus. Teknik kloning embrio yang belum matang memungkinkan perbanyakan genotipe tanaman yang berharga pada tahap awal siklus hidup. Kemungkinan lain penggunaan kultur embrio adalah penggunaannya dalam seleksi sel.

Mikropropagasi klonal dari hibrida jauh. Embriokultur memungkinkan untuk menumbuhkan tanaman hibrida dari embrio yang rusak. Namun, hasil tanaman hibrida rendah, dan tanaman hibrida sering kali mandul. Kadang-kadang, misalnya, ketika membiakkan soba, sulit untuk mereproduksi genotipe unik pada keturunannya karena penyerbukan silang pada tanaman. Oleh karena itu, para peneliti seringkali dihadapkan pada tugas untuk memperbanyak dan melestarikan tanaman yang dihasilkan. Metode mikropropagasi klonal membantu dalam hal ini. Hibrida diperbanyak dengan mengaktifkan perkembangan meristem tunas ketiak (dengan stek pucuk steril), tunas bawahan atau regenerasi tanaman dari jaringan kalus, khususnya diperoleh dengan budidaya embrio.

Memperoleh haploid in vitro dan menggunakannya dalam pemuliaan. Peran tanaman haploid dalam pemuliaan sangatlah penting. Menggunakannya memungkinkan Anda dengan cepat menemukan kombinasi yang diinginkan dan mengurangi waktu untuk membuat variasi. Haploid digunakan untuk menghasilkan garis homozigot yang stabil. Juga lebih mudah menggunakan haploid untuk mutagenesis, karena pemilihan mutasi resesif lebih mudah pada tingkat haploid.

Pada tumbuhan diploid, mutasi jarang mempengaruhi kedua gen alel pada kromosom homolog. Individu tersebut biasanya heterozigot (kedua gen tersebut berbeda), dan hanya gen dominan (tetapi bukan gen resesif) yang terpengaruh. Karena mutasi lebih sering bersifat resesif daripada dominan, mutasi ini cukup sulit diidentifikasi. Pada tumbuhan haploid, yang hanya mengandung satu dari setiap pasang kromosom homolog, mutasi segera muncul. Seleksi pada tingkat haploid memungkinkan seleksi langsung tidak hanya terhadap sifat dominan tetapi juga resesif.

Individu haploid bersifat steril, tetapi dimungkinkan untuk menggandakan set kromosomnya secara artifisial menggunakan colchicine dan mendapatkan tanaman homozigot diploid.

Haploid dapat muncul secara spontan, namun frekuensi kemunculan spontannya sangat rendah. Secara artifisial, dengan menggunakan metode in vitro, tanaman haploid dapat diperoleh dalam jumlah besar. Ada tiga cara untuk memperoleh haploid dengan menggunakan metode kultur jaringan terisolasi:

androgenesis – produksi tanaman haploid pada media nutrisi buatan dari kepala sari dan mikrospora yang terisolasi.

ginogenesis – produksi tanaman haploid pada media nutrisi buatan dari bakal biji yang diisolasi;

partenogenesis adalah produksi haploid dari embrio hibrida di mana kromosom ayah telah hilang karena ketidakcocokan kromosom orang tua.

Embrioid haploid yang terbentuk sebagai hasil eliminasi kromosom genom ayah dibudidayakan pada media nutrisi buatan dan diperoleh tanaman haploid. Varietas jelai Istok dan Odesskaya-15 diperoleh dengan menggabungkan metode partenogenetik dengan kultur embrio terisolasi dalam waktu empat tahun, bukan 10-12 tahun biasanya. Dengan menggunakan metode kultur antera dari varietas dan hibrida gandum lunak dan durum, NPO Elita Povolzhya selama empat tahun menghasilkan lebih dari 2,5 ribu galur dihaploid yang bercirikan homogenitas dan stabilitas.

Perkembangan teknologi untuk memperoleh haploid melalui budidaya kepala sari gandum, barley, jagung, winter rye, dan kentang terus berlanjut. Dalam kultur antera, ada dua kemungkinan pembentukan tanaman haploid. Yang pertama adalah pembentukan tanaman melalui embriogenesis pada butiran serbuk sari. Dalam hal ini, embrioid muncul dari butiran serbuk sari individu di dalam kepala sari. Mereka berkecambah dan menghasilkan tanaman haploid. Yang kedua adalah pembentukan kalus dari sel antera. Selanjutnya, sebagai hasil morfogenesis, tumbuhan mengalami regenerasi dari sel kalus. Dalam hal ini tanaman yang dihasilkan tidak selalu haploid dan seringkali berbeda ploidinya. Tidak sepenuhnya jelas apakah mereka terbentuk dari sel haploid yang dipoliploid atau dari sel yang menyatu.

Haploid yang diperoleh secara in vitro dapat digunakan tidak hanya dalam seleksi praktis, tetapi juga dalam rekayasa genetika, serta seleksi sel. Butir serbuk sari dalam beberapa kasus merupakan objek yang lebih cocok untuk eksperimen transformasi genetik daripada protoplas.

Kriopreservasi tanaman

Kriopreservasi sel tumbuhan somatik dalam nitrogen cair (suhu – 196° C) merupakan arah baru dalam bioteknologi yang mulai berkembang luas sejak awal tahun 70-an abad ke-20. Tujuan dari teknologi ini adalah untuk melestarikan kumpulan gen dalam kultur in vitro, serta untuk menyediakan genotipe yang memiliki karakteristik yang diinginkan kepada pemulia kapan saja: serbuk sari yang diperlukan untuk hibridisasi; benih unik dan tunggal, termasuk benih yang tidak tahan terhadap dehidrasi; sel-sel hibrida yang ditransformasikan, bermutasi, dari spesies tanaman berbeda yang mampu melakukan morfogenesis in vitro; embrio zigotik dan somatik, dll. Saat ini, kondisi kriopreservasi telah dikembangkan untuk kultur sel lebih dari 30 spesies, kultur kalus (sekitar 10 spesies), protoplas terisolasi (8 spesies), pelestarian meristem (25 spesies) dan ujung batang (13 spesies). Prioritas dalam arah ini adalah milik Institut Fisiologi Tumbuhan dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia dan, khususnya, departemen kultur jaringan dan morfogenesis, yang dipimpin oleh Prof. R.G.Butenko.

Saat melakukan pekerjaan kriopreservasi, pertama-tama perlu mempertimbangkan kekhasan sel tumbuhan: memilih sel kecil dengan vakuola kecil dan kadar air rendah; mengembangkan pendekatan untuk pembekuan dan pencairan sel tumbuhan selanjutnya dalam setiap kasus. Selama kriopreservasi terdapat beberapa kesulitan yang dihadapi, salah satunya terkait dengan perlindungan sel dan jaringan beku dari tekanan osmotik dan kerusakan mekanis struktur akibat pembentukan dan pertumbuhan kristal es di dalam sel. Pada saat yang sama, perlu untuk memilih kondisi yang tepat yang menjamin kelangsungan hidup sel yang tinggi selama pencairan dan reklamasi.

Terlepas dari berbagai penelitian yang dilakukan ke arah ini, mereka masih menguraikan teknik umum yang mendasari kriopreservasi: perlakuan sel sebelum pembekuan, penggunaan krioprotektan, kepatuhan terhadap rezim pembekuan tertentu dalam kisaran dari 0 hingga –40° C (dalam kasus yang jarang terjadi, turun hingga -70° C), serta tindakan pencegahan khusus saat mencairkan benda.

Proses kriopreservasi biasanya dimulai dengan mempersiapkan kultur sel untuk dibekukan. Hal ini dapat dicapai dengan beberapa cara, dengan melibatkan budidaya sel pada media nutrisi yang mengandung berbagai zat aktif osmotik: manitol atau sorbitol pada konsentrasi 2–6%, asam amino, dan di antaranya, pertama-tama, prolin, yang penting bagi tubuh. pengikat air dalam sel tumbuhan sudah dikenal luas, begitu pula asam γ-aminobutyric.

Pemilihan krioprotektor, zat yang mengurangi kerusakan sel akibat tekanan osmotik dan mekanis, dilakukan secara empiris berdasarkan prinsip toksisitas paling rendah dan efek optimal. Di antara semua krioprotektor yang dikenal, zat yang mudah menembus sel dibedakan: dimetil sulfoksida (DMSO, 5–10%), gliserol (10–20%), serta polivinilpirolidon (PVP) dengan berat molekul tinggi yang tidak menembus, dekstran, polietilen glikol (PEG) dengan berat molekul 6000.

Yang sangat penting selama kriopreservasi adalah mode pembekuan yang dipilih dengan benar dari 0 hingga –40 °C. Sebagai aturan, untuk semua objek, laju pembekuan diatur pada 0,5–1 °C per menit dan semua pekerjaan ini dilakukan pada peralatan khusus yang menyediakan pembekuan perangkat lunak. Perangkat tersebut diproduksi oleh biro teknologi desain khusus dengan produksi percontohan di Institut Cryobiology dan Cryomedicine (Kharkov).

Jadi, pembekuan lambat dan penggunaan krioprotektan memungkinkan sel dibebaskan dari air bebas, dan pada suhu –40° C sel mengalami dehidrasi total, yang memungkinkan dilakukannya pembekuan lebih lanjut, yaitu merendam ampul berisi bahan tanaman di dalamnya. nitrogen cair.

Penyimpanan bahan dalam nitrogen cair praktis tidak terbatas. Misalnya, cryobank dari Institut Fisiologi Tumbuhan dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia menyimpan sel wortel yang telah berada dalam nitrogen cair selama sekitar 20 tahun, sel meristem kentang selama lebih dari 10 tahun, dll.

Pencairan dan pengujian viabilitas sel setelah penyimpanan dalam nitrogen cair merupakan langkah terakhir dalam teknologi kriopreservasi. Jika pembekuan dilakukan secara perlahan, bertahap, maka pencairan harus dilakukan secepat mungkin. Untuk melakukan ini, ampul ditempatkan dalam penangas air dengan suhu 40° dan terkadang 60° C dan disimpan sampai kristal es terakhir benar-benar hilang.

Untuk menentukan kelangsungan hidup sel setelah pencairan, metode paling sederhana, tercepat dan paling memuaskan digunakan - pewarnaan dengan pewarna vital (0,1% fenosafranin atau larutan Evans biru 0,25%), sebagai akibatnya sel-sel mati ternoda, tetapi sel-sel hidup tidak. Kriteria terakhir, tentu saja, adalah dimulainya kembali pertumbuhan dan pembelahan sel selama reklamasi pada media nutrisi buatan setelah pencairan.

Secara eksperimental ditunjukkan bahwa sel setelah disimpan dalam nitrogen cair tidak kehilangan kemampuan untuk membelah, regenerasi tanaman, produktivitas sintesis metabolit sekunder (sel produsen), dll tidak menurun. Oleh karena itu, Institut Fisiologi Tanaman dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, bersama dengan LSM budidaya kentang, mengembangkan metode kriopreservasi meristem dari empat varietas kentang dan menunjukkan kemungkinan meregenerasi seluruh tanaman dari 20% meristem yang disimpan, yang bila ditanam di lapangan, tidak berbeda dalam segala hal, termasuk tingkat pertumbuhan dan produktivitas, dengan tanaman tabung konvensional (S. Manzhulin et al., 1982). Anda dapat mempelajari lebih lanjut tentang teknik kriopreservasi dari review karya A. S. Popov.

Oleh karena itu, teknologi yang terkait dengan kriopreservasi objek tumbuhan terus berkembang dan ditingkatkan. Tidak diragukan lagi, teknologi ini memiliki masa depan, karena saat ini cryobank dapat sangat memudahkan pekerjaan para pemulia, memberi mereka kesempatan untuk memanfaatkan secara luas kumpulan gen varietas, termasuk seleksi lama dan spesies liar, serta spesies tanaman yang terancam punah.

Untuk percobaan in vitro, darah lengkap dari 11 sukarelawan manusia yang sehat secara klinis dan 36 pasien dengan cedera termal digunakan.

2.3. Metode penelitian

2.3.1. Metode penelitian imunologi

2.3.1.1. Penilaian aktivitas sekresi sel mononuklear darah tepi secara spontan dan terinduksi secara in vitro

Objek penelitian adalah darah vena yang diambil dari sukarelawan sehat dan pasien cedera termal pada waktu perut kosong, pada pagi hari. Darah distabilkan dengan heparin dengan kecepatan 10 U/ml. Fraksi sel mononuklear diisolasi menggunakan metode gradien dengan kepadatan 1,077 g/ml dengan cara sentrifugasi (400 g 45 menit) menggunakan Ficoll dan Verografin. Untuk membentuk medium dengan kepadatan 1,077 g/cm3, digunakan larutan Ficoll-400 9% (b/v) (DiaM, Moscow) dan urografin resmi 60% (Schering, Jerman). Cincin opalescent sel mononuklear diambil dari interfase dengan pipet Pasteur dan dicuci tiga kali dengan sentrifugasi dengan medium 199 pada 689 g selama 5-7 menit. Sel yang dicuci dan diresuspensi dibawa ke konsentrasi 1 · 10 7 sel/ml. Kelangsungan hidup mereka dinilai dengan pewarnaan dengan larutan tripan biru 0,2%; kelangsungan hidup setidaknya 98%.

Budidaya sel dilakukan pada 5% karbon dioksida di udara pada suhu 37 0 C selama 1 jam. Dalam kondisi steril, isi sel disedot, diikuti dengan pencucian dua kali untuk menghilangkan sel-sel yang tidak melekat dengan larutan Hanks. Kemudian 250 μl serum janin sapi 10% dan 80 μg/ml gentamisin ditambahkan ke masing-masing sumur. Selanjutnya sel dikultur selama 72 jam, dalam termostat pada 5% karbon dioksida di udara, pada suhu 37 0 C, dan ditentukan konsentrasi sitokin dalam supernatan.

2.3.1.2. Penelitian imunitas bawaan

Penentuan jumlah leukosit dan formula leukosit. Jumlah leukosit dalam darah tepi ditentukan dengan metode melanger yang diterima secara umum di ruang Goryaev. Rumus leukosit dihitung dalam apusan darah yang difiksasi dengan metil alkohol dan diwarnai dengan biru II-eosin menurut Romanovsky-Giemsa. 200 leukosit dihitung dengan diferensiasi eosinofil, basofil, metamielosit, neutrofil pita dan tersegmentasi, limfosit, dan monosit. Kuantitasnya dinyatakan dalam nilai relatif (%) dan absolut (109/l).

Aktivitas fungsional fagosit dipelajari menurut tes NCT dan fagositosis.

Studi tentang kapasitas penyerapan fagosit darah tepi dilakukan pada model penyerapan partikel lateks. Untuk menilai fagositosis, 200 μl darah dicampur dengan 20 μl suspensi partikel lateks polistiren monodisperse (diameter 1,7 μm). Setelah inkubasi 60 menit pada suhu 37 0 C, dibuat sediaan dari suspensi, dikeringkan, difiksasi dengan metanol dan diwarnai dengan Azur II - eosin menurut Romanovsky-Giemsa. Dengan menggunakan mikroskop perendaman, kami memperhitungkan aktivitas fagositosis - % sel yang menangkap setidaknya satu partikel lateks, intensitas fagositosis - jumlah mikrosfer lateks yang diserap dalam 100 sel yang dihitung, dan jumlah fagosit - jumlah mikrosfer lateks yang diserap. mikrosfer lateks per fagosit.

tes NST dilakukan dengan mempertimbangkan intensitas reduksi nitroblue tetrazolium (NBT) oleh fagosit menjadi bentuk tidak larut - diformazan menurut metode A.N. Mayansky dan M.E. Wixman (1979). Tes NBT spontan dan terinduksi dilakukan.

0,1 ml larutan 0,2% nitroblue tetrazolium yang diencerkan secara standar dalam buffer fosfat 0,1 M (pH 7,4) ditambahkan ke tabung reaksi dengan 0,2 ml darah. Untuk mengevaluasi uji NBT yang diinduksi, 20 μl suspensi partikel lateks polistiren monodisperse (diameter 1,7 μm) (seri yang diinduksi) atau 20 μl NaCl 0,9% (seri spontan) ditambahkan ke setiap sumur. Setelah inkubasi 30 menit pada suhu 37 0 C, 3 ml asam klorida 0,1% ditambahkan ke dalam campuran reaksi untuk menghentikan reaksi. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Cairan supernatan dibuang, dan apusan dibuat dari sedimen. Setelah kering, sediaan difiksasi dengan metanol dan diwarnai dengan larutan safranin 0,1% selama 5 menit. Dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 90x10x1,5, % sel yang memulihkan NBT dan intensitas reaksi berdasarkan aktivitas restorasi NBT ditentukan, dimana sel-sel positif NBT dibagi menjadi 3 kelompok:

1 – sel dengan butiran diformazan di sitoplasma dengan luas total kurang dari 1/3 luas inti;

2 – sel dengan butiran diformazan di sitoplasma lebih dari 1/3 area inti;

3 – sel dengan butiran diformazan melebihi ukuran nukleus.

Untuk memperoleh koefisien intensitas reaksi, jumlah sel kelompok pertama yang dinyatakan dalam persentase dikalikan 1, kelompok kedua dengan 2, kelompok ketiga dengan 3, hasilnya dijumlahkan dan dibagi 100.

Sel menua tidak hanya secara in vivo, tetapi juga in vitro. Selain itu, dalam kondisi in vitro, peran hiperoksia, yang merupakan faktor alami dan, tampaknya, satu-satunya faktor penuaan dalam kondisi ini, sangat jelas terlihat.
1.8.1. Sebagaimana diketahui, budidaya sel di luar tubuh dilakukan dalam wadah khusus (labu) pada tekanan atmosfer dan, oleh karena itu, pada pO2, secara signifikan melebihi nilai yang biasanya ditetapkan di dalam tubuh. Biasanya, pO2 dalam cairan inkubasi mendekati pO2 udara. Molekul O2 berdifusi bebas melalui lapisan tipis media nutrisi dalam botol ke dalam sel dan pO2 tinggi terbentuk di dalamnya, yang tidak mungkin dilakukan secara in vivo atau, dalam hal apa pun, melebihi nilai yang diizinkan.
Dari sudut pandang konsep penuaan oksigen-peroksida, kondisi in vitro tampaknya lebih dari cocok untuk mempelajari proses penuaan sel, karena dalam kondisi ini proses tersebut terjadi lebih intens, dengan kecepatan yang dipercepat dan, yang sangat penting, dalam “ bentuk murni”, yaitu dengan tidak adanya pengaruh sistem tubuh, yang terjadi selama penuaan in vivo. Keadaan ini segera menempatkan banyak teori penuaan pada kategori sekunder atau murni spekulatif, karena perubahan terkait usia terjadi atau dapat terjadi tanpa penerapan ketentuan yang didalilkan di dalamnya. Pentingnya fenomena penuaan sel in vitro disebabkan oleh fakta bahwa dalam kondisi “sederhana” inilah kita akan dapat lebih memahami dasar-dasar fisikokimia penuaan dan esensi biologi dari proses ini secara umum. dengan cepat dan dengan sedikit kesulitan.
Namun saat ini, tidak ada konsensus mengenai penyebab umum dan mekanisme penuaan kultur sel dan penuaan sel dalam organisme multiseluler, sebagaimana dibuktikan dengan sudut pandang yang berlawanan dalam literatur (Kapitanov, 1986). Kanungo (1982), misalnya, meskipun ia percaya bahwa penyebab penuaan suatu organisme adalah penuaan sel-selnya, pada saat yang sama ia percaya: “kondisi in vitro tidak sesuai dengan kondisi fisiologis dan sifat-sifat sel mungkin diubah. Meskipun penelitian in vitro memberikan beberapa informasi berguna tentang sel itu sendiri, namun manfaatnya terbatas jika dikaitkan dengan penuaan organisme secara keseluruhan.” Kita hanya bisa setuju sebagian dengan pernyataan di atas. Memang, penuaan sel in vitro tidak dapat mencerminkan seluruh spektrum kompleks perubahan terkait usia yang terjadi pada seluruh organisme di semua tingkatan dan, terlebih lagi, sangat ditentukan oleh sistem berbagai hubungan di dalamnya, termasuk hubungan umpan balik. Ketika diterapkan pada kondisi in vitro, sejumlah prinsip penuaan yang muncul pada tingkat organisme kehilangan maknanya (lihat bagian 1.1.2), namun beberapa di antaranya tetap berlaku dalam kultur sel. Ini, khususnya, adalah sifat multifokal dari proses penuaan, yaitu. perkembangan kerusakan di berbagai bagian sel atau dalam siklus molekuler yang berbeda, dan penuaan heterokroni di antara sel-sel dari jenis budaya yang sama. Selain itu, dalam kondisi ini, prinsip penuaan sel yang tidak dapat diubah, tidak diatur, dan berkelanjutan akan terlihat lebih jelas.
Kekurangan di atas dalam studi penuaan sel di luar tubuh tampaknya tidak mendasar, mengingat salah satu tugas utama gerontologi adalah menetapkan faktor lingkungan utama utama yang menentukan penuaan semua organisme hidup. Kami yakin, faktor tersebut adalah hiperoksia di atmosfer bumi, sehingga kehidupan sel in vitro dapat dianggap sebagai model eksperimental yang tepat untuk mempelajari pengaruh faktor fisik khusus ini terhadap penuaan sel. Kandungan O2 yang biasa di udara adalah 18-21% dan tingkat ketidakseimbangan yang tinggi (PO - AO) dan proses peroksigenase memiliki efek penghambatan pada elemen subseluler, pada proses fisiologis dan metabolisme normal. Akibatnya, sel-sel tersebut secara bertahap memudar, dan sebagian besar sel mati karena sitolisis oksidatif atau mekanisme apoptosis oksigen-peroksida (lihat bagian 7.1).
Terdapat lebih dari cukup bukti yang menunjukkan peran utama kelebihan pO2, ROS dan LPO dalam mengurangi kelangsungan hidup sel in vitro dan efek perlindungan dari berbagai faktor antioksidan (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner et al. , 1998). L-carnosine baru-baru ini diklasifikasikan sebagai salah satu yang terakhir. Menambahkan konsentrasi fisiologis ke media standar meningkatkan umur fibroblas manusia secara in vitro dan memperlambat proses penuaan fisiologis di dalamnya. Sel-sel yang dimasukkan dalam media biasa dalam waktu lama setelah dipindahkan ke media yang mengandung karnosin menunjukkan efek peremajaan. Isomer optik D-carnosine tidak memiliki sifat ini (Halliday dan McFarland, 2000).Pada saat yang sama, selama budidaya jangka panjang, persentase sel tertentu tidak hanya tidak terdegradasi, tetapi juga beradaptasi dengan kondisi oksidatif beracun, "mencapai" bahwa parameter intraseluler Δ (PO - AO) tidak meningkat ke nilai ΔA2 atau ΔC yang tinggi, tetapi mungkin berhenti pada tingkat ΔK yang sedikit lebih rendah, yang diperlukan untuk transformasi ganasnya. Kasus keganasan sel “spontan” dalam kultur dan kemungkinan mekanismenya dibahas secara terpisah di Bab 4.
1.8.2. Pertimbangan di atas dapat dianggap sebagai bagian dari prinsip teoretis kami tentang penyebab dan konsekuensi penuaan sel in vitro. Untuk mengkonfirmasi dan mengembangkan ketentuan-ketentuan ini, adalah wajar untuk memanfaatkan beberapa fakta yang sudah diketahui, yang isi dan maknanya dapat dengan mudah “disesuaikan” dengan konsep oksigen-peroksida dari penuaan sel. Mari kita mulai dengan fakta bahwa kondisi konvensional yang dijelaskan di atas untuk kultur sel, yang bersifat racun bagi sel, dapat dikurangi dengan mengurangi konsentrasi O2 dalam lingkungan gas secara artifisial. Pada saat yang sama, efek penghambatan hiperoksia dan laju penuaan sel akan menurun. Perlu juga diingat bahwa konstanta biologis yang terkenal seperti batas Hayflick ternyata merupakan nilai variabel tergantung pada kandungan O2 di lingkungan gas, dan dalam kondisi stres oksidatif, batas ini menurun, dan dengan a penurunan pO2, sebaliknya justru meningkat (Chen et al., 1995).
Memang, memelihara kultur fibroblas di atmosfer dengan kandungan O2 rendah (10%) akan memperpanjang umurnya sebesar 20-30%. Hal yang sama terjadi pada sel paru-paru manusia dan tikus (Packer dan Walton, 1977). Periode kelangsungan hidup proliferasi fibroblas diploid manusia IMR90 dengan tingkat populasi awal yang berbeda meningkat dua kali lipat ketika kandungan O2 dalam medium menurun menjadi 1,6 atau 12%. Periode pada 1% O2 ini meningkat sebesar 22%, dan kembalinya budaya dari lingkungan dengan 1% O2 ke lingkungan dengan 20% O2 dengan cepat menyebabkan penuaan. Dalam kultur fibroblas diploid dari pasien dengan sindrom Werner (penuaan dini), durasi viabilitas replikasi juga meningkat seiring dengan penurunan pO2 (Saito et al., 1995). Perlambatan penuaan kondrosit embrio ayam yang dikultur ditunjukkan pada kandungan O2 8% di atmosfer dibandingkan dengan kontrol (18%), dan sel-sel percobaan mempertahankan karakteristik “muda” lebih lama dan memiliki tingkat proliferasi yang lebih tinggi (Nevo dkk., 1988). Di bawah pengaruh berbagai antioksidan, laju proliferasi kultur sel juga meningkat, dan penuaannya melambat (Packer dan Walton, 1977; Obukhova, 1986), yang menegaskan apa yang telah dikatakan di atas: efek oksidan yang berlebihan menekan proliferasi sel dan menyebabkan percepatan penuaan.
Dalam percobaan dengan kultur sel, relatif mudah untuk menguji pengaruh mekanisme yang bergantung pada O2 untuk mengatur jumlah enzim pernapasan (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) dan mitokondria (Ozernyuk, 1978) . Menurut mekanisme ini, dengan peningkatan tingkat hiperoksia yang halus dan lambat, kandungan enzim tersebut dan jumlah mitokondria akan meningkat secara bertahap, dan dengan hipoksia, sebaliknya, akan menurun. Memang benar, ketika kultur fibroblas ditumbuhkan dalam media dengan kandungan O2 yang berkurang, konsentrasi sitokrom menurun secara signifikan (Pius, 1970). Di sini, tentu saja, proses objektif adaptasi sistem pernapasan terhadap tingkat pO2 intraseluler terlibat. Namun, dalam fenomena ini, kecepatan adaptasi tidak kalah pentingnya, yang bergantung pada intensitas penuaan sel yang dikultur. Tampak jelas bahwa dalam proses evolusi biologis, organisme multiseluler juga beradaptasi secara bertahap terhadap peningkatan pO2 di atmosfer bumi. Pada saat yang sama, di dalam sel, mekanisme adaptasi “mitokondria” dapat dianggap paling efektif: jumlah enzim rantai pernapasan dan mitokondria itu sendiri bervariasi menurut sistem yang mengatur dirinya sendiri sehingga menjamin integritas dan fungsi yang relatif normal. sel ketika pO2 intraseluler berubah dalam batas tertentu yang terbukti secara evolusi.
Situasi yang sangat berbeda muncul ketika sel dengan cepat dipindahkan dari organisme hidup ke kondisi in vitro. Perpindahan mereka secara tiba-tiba ke dalam keadaan hiperoksia sama saja dengan menimbulkan gangguan mendadak yang signifikan, yang secara umum mereka tidak siap menghadapinya. Bagaimana kultur sel primer bereaksi terhadap gangguan tersebut? Rupanya, selama periode awal tertentu, media kultur menimbulkan “stres” bagi sel, dan keadaan sel itu sendiri selama periode ini sangat mengejutkan. Kemudian beberapa waktu dihabiskan untuk mempersiapkan dan melaksanakan “peristiwa” adaptif yang bersifat antioksidan yang mungkin terjadi dalam kondisi ekstrim ini. Mungkin karena yang terakhir, pada awalnya dimungkinkan tidak hanya untuk menghindari degradasi oksidatif, tetapi juga untuk menciptakan kondisi untuk merangsang proses proliferasi, mengurangi ketidakseimbangan intraseluler yang awalnya tinggi dan jelas “sitotoksik” ΔC (PO - AO) menjadi yang diperlukan. untuk mitogenesis oksidatif. Namun tahapan kehidupan budaya primer ini tidak bisa tidak dibatasi oleh lingkungan hiperoksik yang terus menerus menindasnya. Dalam situasi ini, mekanisme adaptif itu sendiri mulai dinonaktifkan, pertumbuhan sistem antioksidan menurun, dan selanjutnya terjadi regresi. Pada tingkat PUT yang tinggi, mitokondria pertama-tama mengalami kerusakan (lihat bagian 1.3), yang jumlahnya akan terus meningkat sebagai tindakan adaptif jika terjadi peningkatan pO2 secara bertahap di lingkungan gas.
Ketidakmampuan mekanisme adaptif sel untuk dengan cepat dan sepenuhnya menetralkan hiperoksia yang terjadi secara tiba-tiba, di satu sisi, dan tingginya kerentanan unit mitokondria di bawah tekanan peroksidatif, di sisi lain, menentukan proses degenerasi sel yang ireversibel setelah terjadinya “ tingkat kritis” kerusakan di dalamnya. Penting untuk dicatat di sini sekali lagi: perubahan destruktif pada mitokondria sebagai konsumen utama O2 dan dalam hal ini sebagai yang utama, tingkat perlindungan anti-oksigen dalam sistem antioksidan sel tidak memberikan harapan untuk bertahan hidup bagi sebagian besar sel dalam kondisi yang keras. vitro, karena dalam hal ini adaptasi itu sendiri terganggu - mekanisme aktif untuk mengurangi tingkat pO2 dan LPO intraseluler. Pertimbangan di atas sepenuhnya konsisten dengan peran utama perubahan mitokondria dalam memulai mekanisme penuaan, namun didalilkan dalam kaitannya dengan fibroblas yang dikultur secara in vitro (Kanungo, 1980).
Stres peroksidatif dan efek toksik in vitro dapat lebih ditingkatkan jika katalis PUT, seperti ion Fe2+ atau Cu2+, dimasukkan ke dalam media kultur. Memang benar, penambahan tembaga sulfat pada konsentrasi 60 mg/l ke dalam media budidaya menyebabkan penurunan umur rata-rata rotifer secara signifikan sebesar 9%, serta peningkatan jumlah MDA yang jauh lebih nyata dibandingkan dengan penambahan tembaga sulfat pada konsentrasi 60 mg/l ke dalam media budidaya. kontrol. Penulis percobaan ini (Enesco et al., 1989) secara logis percaya bahwa penurunan harapan hidup terjadi karena percepatan proses pembentukan radikal bebas oleh ion tembaga. Konsentrasi tembaga sulfat yang ditunjukkan ternyata optimal, karena konsentrasi yang lebih tinggi (90 dan 180 mg/l) terlalu toksik bagi rotifer, dan konsentrasi yang lebih rendah (30 mg/l) tidak efektif.
Dengan demikian, percepatan penuaan dan degradasi oksidatif sel yang ireversibel selama perubahan lingkungan yang tajam dari in vivo ke in vitro adalah konsekuensi dari kurangnya kesiapan sel untuk menerima peningkatan tajam paparan oksigen tanpa konsekuensi negatif yang serius. Jika transisi tajam ke kondisi baru digantikan oleh transisi yang “lunak”, misalnya multi-tahap dan diperpanjang seiring berjalannya waktu, maka kita dapat berharap bahwa kemampuan bawaan sel untuk beradaptasi terhadap hiperoksia yang meningkat secara bertahap dalam kasus ini akan sepenuhnya hilang. diwujudkan. Selain itu, pada prinsipnya, dengan cara ini dimungkinkan untuk mencapai adaptasi sel tidak hanya terhadap tingkat O2 biasa 18-21% di atmosfer, tetapi juga terhadap lingkungan hiperoksik yang diciptakan secara artifisial yang secara signifikan melebihinya. Untuk mendukung hal di atas, kami mengacu pada fakta yang sangat meyakinkan yang diperoleh Welk dkk. (Valk dkk., 1985). Sebagai hasil adaptasi bertahap terhadap peningkatan konsentrasi O2, mereka memperoleh rangkaian sel ovarium hamster Cina yang tahan terhadap kandungan O2 tinggi dan mampu berkembang biak bahkan pada 99% O2 di atmosfer. Semua tahap pertahanan - anti-oksigen, anti-radikal, dan anti-peroksida - ternyata disesuaikan dengan hiperoksia yang begitu signifikan dan proses-proses yang bergantung padanya (untuk rincian lebih lanjut tentang hasil ini, lihat Bab 4).
1.8.3. Pertimbangan yang disajikan tentang kekhasan perubahan ketidakseimbangan prooksidan-antioksidan dalam sel yang dikultur sebagai faktor aktif utama dalam penuaan dan transformasinya dapat direpresentasikan secara grafis (lihat Gambar 11). Kurva 1, yang mencerminkan perubahan-perubahan ini selama pergerakan cepat sel ke dalam media in vitro, membedakan tiga tahap berurutan waktu, yang tampaknya sesuai dengan fase adaptasi (laten), fase pertumbuhan logaritmik, dan fase diam yang dikenal dalam literatur. . Dalam hal ini, penuaan kultur sel biasanya dikaitkan dengan proses dalam fase diam, di mana seiring waktu mereka mengalami berbagai perubahan serupa dengan yang diamati pada sel dalam organisme yang menua (Kapitanov, 1986; Khokhlov, 1988). Secara khusus, selama penuaan sel in vitro, enzim berubah dan terjadi aneu- dan poliploidisasi (Re-macle, 1989). Seperti sel in vivo, sel yang dikultur mengakumulasi butiran lipofuscin seiring bertambahnya usia (Obukhova dan Emanuel, 1984), menunjukkan terjadinya proses peroksidasi dan gangguan oksidatif pada struktur lipid dan protein. Fakta-fakta ini dan sejumlah fakta lainnya dapat konsisten dengan hipotesis tentang mekanisme penuaan oksigen-peroksida (radikal bebas). Yang terpenting, mekanisme ini didukung oleh data bahwa ketika konsentrasi antioksidan meningkat, umur sel in vitro lebih lama, dan ketika berkurang, umur sel menjadi lebih pendek dibandingkan dengan kontrol. Hasil tersebut diperoleh, misalnya, dengan mengubah kandungan GSH pada fibroblas manusia (Shuji, Matsuo, 1988), katalase dan SOD pada neuron yang dikultur (Drukarch et al., 1998).
Sedangkan untuk kurva 2 yang mendatar dan relatif mulus pada Gambar. 11, maka sifatnya yang demikian dijelaskan oleh fakta bahwa setiap peningkatan kecil yang dibuat secara artifisial dalam komponen pro-oksidan dari ketidakseimbangan Δ (PO - AO) dalam sel diikuti, dengan beberapa penundaan, oleh peningkatan adaptif yang sesuai dalam antioksidan. komponen di dalamnya. Pengulangan berulang dari tindakan ini memastikan adaptasi dan kelangsungan hidup sel dengan peningkatan tingkat hiperoksia secara bertahap dan bertahap.
Dalam kedua kasus ini, mari kita perhatikan varian yang menyebabkan apa yang disebut keganasan sel “spontan” (lihat Bab 4). Fenomena ini, dari sudut pandang kami, hanya dapat diwujudkan dalam sel yang ketidakseimbangannya mencapai nilai K yang secara stabil memenuhi ketimpangan (lihat bagian 1.1.2)
ΔP (PO – AO), atau lebih tepatnya, dengan mempertimbangkan ketidakseimbangan “apoptosis”, – rasio (lihat paragraf 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) Dengan bantuan prosedur tersebut, garis kontinu dari sel-sel yang ditransformasi dan tumor pada akhirnya terbentuk, yang mampu bertahan lama di luar tubuh. Dalam konteks masalah yang kami pertimbangkan, yang lebih penting adalah memutuskan pendekatan untuk mempelajari hubungan antara penuaan dan karsinogenesis. Salah satunya, yaitu studi tentang proses munculnya sel tumor selama penuaan kultur sel normal (Witten, 1986), tampaknya merupakan cara yang paling alami dan oleh karena itu lebih disukai.

mendekati. Ketika ketidakseimbangan Δ (PO - AO) terjadi pada interval antara ΔK dan ΔC, sel dapat menjalani apoptosis tipe A2 (lihat bagian 7.1.1).
Menurut teori telomer, penuaan replikasi sel, termasuk in vitro, dikaitkan dengan pemendekan telomer setelah setiap mitosis, hingga panjang minimum tertentu, yang mengakibatkan hilangnya kemampuan sel tersebut untuk membelah (lihat bagian 1.4. 3 dan 1.4 .4). Analisis terhadap literatur yang diketahui mengenai masalah ini menunjukkan bahwa postulat ini tidak dikonfirmasi dalam beberapa kasus. Hal ini dicontohkan oleh penelitian Carman et al. (Carman et al., 1998), dilakukan pada sel diploid Syria hamster embrionik (SHE). Sel-sel ini, setelah 20-30 siklus penggandaan, menghentikan proliferasi dan kehilangan kemampuan untuk memasuki fase S setelah stimulasi serum. Pada saat yang sama, sel SHE mengekspresikan telomerase sepanjang siklus hidup replikasi, dan ukuran rata-rata telomer tidak berkurang. Ternyata sel in vitro terkadang menua melalui mekanisme yang tidak berhubungan dengan hilangnya telomer.
Bagi kami, dalam hal ini, kondisi hiperoksia di lingkungan budidaya membuat penyesuaian tersendiri. Jika dalam keadaan peningkatan kadar sedang, ROS dan peroksidasi sering kali menjalankan fungsi positif, mengaktifkan tahapan individu dari sinyal mitogenik, replikasi, transkripsi, dan proses lainnya (ini telah dibahas di beberapa paragraf sebelumnya dan disebutkan di beberapa paragraf berikutnya), kemudian dalam kasus stres oksidatif yang intens, konsekuensi negatif juga tidak dapat dihindari. Misalnya, beberapa makromolekul, termasuk yang terlibat dalam mitogenesis, dapat dimodifikasi, yang, terlepas dari aktivitas telomerase dan panjang telomer, akan menghambat proliferasi dan/atau menyebabkan beberapa kelainan lain, bahkan menyebabkan kematian sel.
Meskipun demikian, dua alasan penuaan sel in vitro - akumulasi kesalahan dalam kondisi mempertahankannya dalam kultur dan pemendekan telomer - masih menjadi penyebab yang paling mungkin. Dipercaya bahwa dalam kedua kasus, sistem protein p53 dan Rb diaktifkan, dan ketika fungsinya terganggu, terjadi transformasi sel (Sherr dan DePinho, 2000). Dalam pengertian yang lebih umum, kita melihat hal berikut: dalam kondisi budidaya hiperoksia toksik, sel normal, penuaan, kemungkinan besar mengalami apoptosis A1, dan sel tumor mengalami apoptosis A2. Jika terjadi masalah pada mekanisme apoptosis, apoptosis akan mengalami transformasi neoplastik, sedangkan apoptosis akan mengalami sitolisis oksidatif (lihat bagian 7.1.1).
Alasan tambahan yang berkontribusi terhadap intensifikasi proses penghancuran oksidatif dalam sel in vitro adalah panas, sebagai faktor lingkungan yang terus beroperasi. Memang, dengan menggunakan metode yang sangat sensitif (dijelaskan oleh penulis Bruskov et al., 2001), ditunjukkan bahwa ROS dihasilkan dalam larutan air di bawah pengaruh panas. Sebagai hasil dari aktivasi termal O2 atmosfer yang terlarut dalam air, terjadi serangkaian reaksi
O2 → 1O2 → O → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
ROS yang dihasilkan tampaknya berkontribusi terhadap kerusakan termal pada DNA dan molekul biologis lainnya melalui “auto-oksidasi”.
Terakhir, kami mencatat cara lain untuk mengintensifkan proses penuaan sel in vitro menggunakan prosedur anoksia - reoksigenasi, yang menurut pendapat kami, hasilnya paling jelas mencerminkan esensi model penuaan oksigen-peroksida. Mekanisme penuaan dalam hal ini didasarkan pada dua efek mendasar: kontraksi adaptif (melemahnya) basis mitokondria selama periode anoksia atau hipoksia (lihat di atas); peningkatan signifikan dalam LPO dan proses penghancuran oksidatif lainnya selama reoksigenasi berikutnya karena peningkatan tajam pO2 (relatif terhadap keadaan anoksia) dan ketidakmungkinan pemanfaatan kelebihan O2 secara cepat oleh mitokondria “anoksik”. Tingkat stres peroksidatif dan, akibatnya, laju penuaan sel akan bergantung pada lamanya sel berada dalam keadaan anoksia: semakin lama periode ini, semakin baik basa mitokondria beradaptasi dengan tingkat pO2 yang rendah dan semakin signifikan sel tersebut. kerusakan akan terjadi setelah penghapusan iskemia.
Contoh penerapan penuaan sel menurut “skenario” yang ditentukan adalah fakta berikut. Hepatosit yang diisolasi dari tikus dari berbagai usia dikenai anoksia selama 2 jam dan reoksigenasi selama 1 jam. Ditemukan bahwa dalam fase reoksigenasi, hepatosit menghasilkan radikal oksigen dalam jumlah besar, yang bertanggung jawab atas kerusakan membrannya dan perubahan struktural dan fungsional lainnya yang terkait dengan penuaan, dan sel-sel tua lebih sensitif terhadap cedera reperfusi (Gasbarrini et al. ., 1998). Kami juga membahas fakta serupa di Bab 4 sehubungan dengan diskusi tentang mekanisme penuaan dan keganasan sel “spontan” dalam kultur.

Calon Ilmu Pertanian berbicara tentang kemungkinan bioteknologi. Dmitry Kravchenko dari Institut Penelitian Pertanian Kentang Seluruh Rusia.

Pertumbuhan dan perkembangan terkendali:

Peluang bioteknologi kentang di dalam vitro

Pengaturan pertumbuhan dan perkembangan tanaman merupakan tugas penting biologi modern. Studi tentang mekanisme pengaturan pada tingkat sel yang mengontrol fungsi vital dasar tumbuhan, cara mengontrol proses fisiologis, dan mekanisme pengaturan sel tumbuhan membuka prospek luas untuk memanfaatkan peluang potensial.

Mengapa Anda membutuhkan pekerjaan? secara in vitro ?

Metode bioteknologi terkait dengan budidaya dalam kondisidi dalam vitro , telah menjadi bagian integral dari proses teknologi reproduksi tanaman sumber untuk produksi benih kentang asli. Untuk peningkatan kesehatan menggunakan metode meristem apikal dan percepatan perbanyakan kulturdi dalam vitro Untuk memperoleh bahan awal yang sehat sebanyak-banyaknya untuk selanjutnya melakukan proses produksi benih, perlu dilakukan optimalisasi dan intensifikasi proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman kentang pada kedua kondisi tersebut.di dalam vitro , dan saat menerima umbi mini yang sehat.

Mengapa Anda perlu mengelola proses pertumbuhan? Mari kita sebutkan bidang utama pekerjaan dengan tanaman kentangdi dalam vitro :

— perbaikan varietas kentang dari virus dan infeksi lainnya (metode meristem apikal dalam berbagai kombinasi dan modifikasi);

— pengenalan budayadi dalam vitro eksplan diperoleh dari tanaman kentang yang sehat sempurna;

— perbanyakan varietas kentang secara mikroklonal dalam proses produksi benih asli;

— memperoleh mikrotuber kentang;

— pemeliharaan koleksi genotipe kentang dalam jangka panjang;

— seleksi-genetik dan penelitian lain yang memerlukan bahan untuk pelaksanaannyadi dalam vitro .

Iona Skulachev

Mari kita pertimbangkan kemungkinan mengendalikan proses pertumbuhan tanamandi dalam vitro pada tahap penyembuhan dan perbanyakan mikroklonal.

Pada tahap memperoleh regeneran dari eksplan meristematik, indikator tingkat kelangsungan hidup suatu objek, intensitas proses morfogenesisnya dan waktu regenerasinya sangat penting. Untuk meningkatkan parameter ini, kami merekomendasikan penggunaan produk nano kelas baru dengan sifat geroprotektif - ion Skulachev. Disintesis di Lembaga Penelitian Biologi Fisika dan Kimia dinamai A.N. Persiapan Belozersky (MSU dinamai M.V. Lomonosov).SkQ (Ion Skulachev) merupakan senyawa kation trifenildesilfosfonium dan analog kloroplas plastokuinon. Mereka mengatur keseimbangan intraseluler spesies oksigen reaktif dan berbeda dalam kemampuan penetrasi dan rasio aktivitas anti dan prooksidase.

Menambahkan obatSkQ1 ke dalam media nutrisi buatan pada konsentrasi nano 2,5 nM meningkatkan tingkat kelangsungan hidup eksplan meristem varietas dengan musim tanam lebih pendek sebesar 16–43% dan varietas dengan musim tanam lebih panjang sebesar 7–13%.

Pada saat yang sama, terjadi peningkatan yang signifikan dalam aktivitas morfogenik dan intensitas pertumbuhan eksplan, akibatnya waktu regenerasi tanaman mikro dari jaringan meristem berkurang sebesar 24– 30 hari.

Setelah transplantasi ke media nutrisi baru, tanaman mikro diperoleh dari regeneranSkQ1 , ditandai dengan pertumbuhan yang lebih cepat dan parameter biometrik yang lebih baik. Dalam hal serangkaian indikator, tanaman yang diperoleh di media memimpin: dalam pertumbuhan awal meristem dan dalam pertumbuhan tanaman selanjutnya.

Bahkan lebih cepat

Jadi, 50 hari setelah isolasi meristem saat menggunakan obatSkQ1 Tanaman lengkap diperoleh, cocok untuk pemotongan lebih lanjut dan pengujian infeksi laten virus menggunakan metode ELISA. Dan 15-20 hari setelah pemotongan, tanaman yang tumbuh kembali dapat ditanam di tanah rumah kaca atau lahan terbuka untuk menilai kekhasan varietas dan memperoleh umbi mini. Akibatnya, total waktu mulai dari isolasi meristem hingga penanaman tanaman sehat di tanah dapat dikurangi menjadi 65–80 hari. Output kuantitatif dari jalur ini juga meningkat, yang berarti kemungkinan pemulihan berhasil.

Sistem otomatis Fitotron TF 600 memungkinkan Anda memperoleh hasil serupa tanpa menggunakan zat perangsang pertumbuhan tambahan, dan dalam kombinasi dengannya, aktivitas morfogenik regeneran meningkat sebesar 12-21%, waktu untuk mendapatkan tanaman awal yang sehat berkurang sebesar 7–14 hari.

Selain itu, saat ini sedang dilakukan penelitian mengenai pengaruh radiasi cahaya berbagai komposisi spektral terhadap pengurangan infeksi virus pada tanamandi dalam vitro .

Mempercepat pemotongan

Setelah menerima tanaman regenerasi awal yang sehat, tahap reproduksi penting berikutnya adalah perbanyakan lebih lanjut. Tantangannya adalah meningkatkan volume bahan awal dengan cepat sambil mempertahankan potensi pertumbuhan energi dan produktivitas yang tinggi, serta status bebas patogen.

Proses perbanyakan mikroklonal sebaiknya dibagi menjadi 2 tahap yaitu percepatan stek dan pemotongan terakhir sebelum tanam pada kondisisecara alami . Percepatan stek harus benar-benar menjamin tingkat perbanyakan yang maksimal dalam jangka waktu yang ditentukan oleh program produksi benih. Pada tahap terakhir, perlu dibentuk tanaman yang selanjutnya akan beradaptasi paling baik dengan kondisi pertumbuhan di tanah dan akan menghasilkan umbi mini standar dengan hasil tinggi. Oleh karena itu, pada tahap mikropropagasi yang berbeda, pengatur kimia yang berbeda dan kondisi budidaya fisik yang berbeda dapat digunakan.

Berikan kondisi

Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, kami merekomendasikan penggunaan obat epin untuk mempercepat stek (epibrassinolide sintetis), yang mempercepat morfogenesis batang tanamandi dalam vitro dan meningkatkan laju reproduksi. Pada tahap terakhir pemotongan, obat fumar (asam aminofumarat dimetil ester) direkomendasikan, yang merangsang rhizogenesis pada tanaman kentang dan memiliki efek positif yang berkepanjangan, meningkatkan hasil kentang di pembibitan lapangan sebesar 9-15%.

Melalui studi menyeluruh terhadap generasi baru zat pengatur pertumbuhan yang disintesis dalam beberapa tahun terakhir, sebuah obat diidentifikasi yang, ketika ditambahkan ke media nutrisi buatan, akan meningkatkan jumlah daun tanaman mikro kentang, dan juga koefisien reproduksi, menjadi 9– 15 buah. tergantung pada varietasnya.

Namun hasil serupa dapat dicapai dengan membudidayakan tanamandi dalam vitro pada media nutrisi standar Murashige-Skoog dengan tetap mengoptimalkan seluruh parameter fisik budidaya, yang dapat disediakan oleh instalasi Fitotron TF 600.

Itu mungkin, tapi hati-hati

Dengan demikian, alat yang efektif dalam gudang manipulasi objek dalam budayasecara in vitro dimulainya penggunaan zat aktif biologis yang memiliki efek yang ditargetkan pada proses fisiologis dan mekanisme pengaturan metabolisme intraseluler. Namun, harus diingat bahwa banyak zat aktif biologis memiliki efek mutagenik yang kurang lebih jelas. Mereka harus dipilih dengan perhatian dan kehati-hatian khusus untuk bidang pekerjaan yang berhubungan dengan budayasecara in vitro , di mana stabilitas sifat-sifat varietas kentang berada pada risiko terbesar.

Di sisi lain, pengenalan solusi teknologi modern ke dalam praktik produksi benih kentang asli, seperti ruangan dengan kondisi fisik terkontrol (Phytotron TF 600 dan analognya), memungkinkan kita untuk memecahkan sebagian masalah pengendalian proses pertumbuhan tanaman.secara in vitro tanpa menggunakan regulasi kimia.