Морфология и физиология вирусов микробиология. Вирусы. Морфология и физиология вирусов. Структура сложных вирусов

Вирусы являются самыми мелкими из всех микроорганизмов. Для них принято измерение в миллимикронах и в ангстремах. Для определения таких размеров частиц применяется несколько методов. Так, взвесь вирусов пропускают через особые фильтры из коллодия, имеющие очень мелкие поры определенной величины. Фильтрование производят через несколько фильтров с разной величиной пор. Разница между диаметрами пор последнего фильтра, пропустившего вирусные частицы, и фильтра, уже не пропустившего вирусные частицы, указывает средние размеры вирусных частиц. При сверхскоростном центрифугировании (50 и более тысяч оборотов в минуту) величина вирусных частиц определяется по специальной формуле в зависимости от числа оборотов и времени осаждения частиц. При этом происходит и очистка вируса от посторонних веществ. Для этого подбирают такие скорости, при которых выпадают посторонние частицы, сначала крупные, а потом самые мелкие. При наиболее высокой скорости получают лишь частицы вируса.

Человек увидел вирусы только после 1940 г., когда был построен и усовершенствован электронный микроскоп. При увеличении в десятки и сотни тысяч раз удалось изучить форму, величину, а также строение частиц некоторых вирусов.

Было найдено, что как величина, так и форма отдельных особей (элементарных частиц) разных видов вирусов довольно разнообразны. Имеются крупные вирусы (например, вирус орнитоза, оспы, трахомы и др.), вирусы средних размеров (гриппа, чумы, бешенства) и мелкие (вирус полиомиелита, кори, ящура, энцефалитов, вирусы многих растений). В таблице приводятся размеры некоторых вирусов, определенные разными способами, в миллимикронах (по В. М. Жданову и Шен).

Самые крупные вирусы приближаются по своим размерам к самым мелким бактериям, а самые мелкие вирусы близки к крупным белковым молекулам.

По внешнему виду одни вирусы имеют шарообразную форму (вирус гриппа), другие - кубовидную форму (вирус оспы), третьи - вид палочки. Вирус табачной мозаики (ВТМ) имеет вид тонкой шестигранной палочки длиной 300 ммк и в диаметре 15 ммк.

При многих вирусных инфекциях (оспа, бешенство, трахома и др.) наблюдаются в цитоплазме или ядре клетки организма хозяина особые, специфические для каждой инфекции внутриклеточные тельца - включения. Они довольно крупные, и их можно видеть в световой микроскоп.

В большинстве случаев включения представляют собой скопление элементарных телец, вирусных частиц, как бы их колонию. Наличие их в клетках помогает при диагностике некоторых заболеваний.

Одним из своеобразных свойств многих вирусов растений является их способность образовывать кристаллы. Д. И. Ивановский первый наблюдал в листьях табака, пораженных ВТМ, включения, называемые теперь кристаллами Ивановского. Они состоят из элементарных частиц вируса табачной мозаики. Кристаллы вируса можно растворять, как растворяют сахар, соль. Из раствора этот вирус можно выделить в аморфном, некристаллическом, состоянии. Осадок можно вновь растворить, затем снова превратить в кристаллы. Если растворить кристаллический вирус в тысячу раз, то капля такого раствора вызовет у растения мозаичную болезнь. Из вирусов человека и животных пока получены кристаллы вируса полиомиелита. Каждый кристалл состоит из миллионов вирусных частиц.

Химический состав вирусов был изучен прежде всего у возбудителя табачной мозаики. Этот вирус представляет собой чистый нуклеопротеид, т. е. состоит из белка и нуклеиновой кислоты. Вирусный нуклеопротеид табачной мозаики имеет огромный молекулярный вес (40-50 млн.).

Вирусная частица имеет сложное строение. Нуклеиновая кислота находится внутри вирусной частицы, она окружена белковой оболочкой. В вирусной частице обычно содержится одна молекула нуклеиновой кислоты.

Вирусы растений содержат рибонуклеиновую кислоту, фаги содержат дезоксирибонуклеиновую кислоту. В вирусах человека и животных находится или РНК, или ДНК. РНК содержится в вирусах гриппа (1,6%), полиомиелита (24%), некроза табака (18%), мозаики табака (6%), ящура (40%), саркомы Рауса (10%) и др. ДНК содержится в вирусах осповакцин (6%), папилломы (6,8%), герпеса (3,8%), полиомы (12%) и др.

Теперь интенсивно изучается вопрос, как соединяются белок и нуклеиновая кислота, как они подогнаны друг к другу. Для разрешения этого вопроса пользуются методом рентгенокристаллографии. Если в вирусной частице имеются субъединицы, то этот метод может установить их число, а также их взаимное расположение. Оказалось, что для большинства вирусов характерно закономерное, высокоупорядоченное расположение элементов вирусной частицы.

У вируса полиомиелита нуклеиновая кислота свернута в клубок, белковая оболочка состоит из 60 одинаковых субъединиц, которые объединены в 12 групп, по 5 субъединиц в каждой. Частица вируса имеет сферическую форму.

Нуклеиновая кислота вируса табачной мозаики имеет вид спирали или пружины. Белковая оболочка ВТМ состоит также из отдельных одинаковых по форме и размерам белковых субъединиц. Всего имеется 2200 субъединиц, расположенных в виде 130 витков вокруг стержня нуклеиновой кислоты. Молекулярный вес такой субъединицы 18 000. Каждая субъединица представляет собой пептидную цепочку, содержащую 158 определенных аминокислот, причем уже определено последовательное расположение этих аминокислот. В настоящее время интенсивно изучается последовательность расположения 6500 нуклеотидов, образующих нуклеиновую кислоту. Когда эта задача будет решена, то станет известен план, которым определяется тип вируса, образующегося в зараженной клетке. Строение, подобное частицам ВТМ и полиомиелита, имеют другие мелкие вирусы растений.

У более крупных вирусов, кроме нуклеиновой кислоты, белковой оболочки, есть еще внешние оболочки, содержащие белки, липоиды, углеводы. Некоторые вирусы содержат ферменты. Так, гриппозный вирус имеет фермент нейраминидазу, парагриппозный вирус - сендай-лизин, вирус миелобластоза птиц содержит аденовинтрифосфатазу. Эти ферменты растворяют оболочку клеток для проникновения вируса в тело своего будущего хозяина.

В свободном состоянии, во внешней среде вне живой клетки, вирусы не проявляют активности, они только сохраняют свою жизнеспособность, иногда продолжительное время. Но как только вирусы встречаются с чувствительными к ним клетками, они становятся активными, внедряются в них и проявляют все признаки жизнедеятельности.

Единственным методом изучения жизнедеятельности вирусов раньше было заражение восприимчивых к ним опытных животных: мышей, кроликов, обезьян и др. Более удобно и экономно выращивать вирусы в развивающемся зародыше куриного яйца. Материал, содержащий вирус, вводят шприцем в зародыш на 8-12-й день его развития. Через несколько дней пребывания зародыша в термостате изучают патологические изменения, вызываемые вирусом в зародыше. Затем пересевают в свежий зародыш другого яйца. В последнее время получил наибольшее применение метод однослойных культур из изолированных клеток животных тканей. Размельченную свежую ткань обрабатывают ферментом трипсином, который разрушает межклеточные связи. Освободившиеся клетки отмывают от трипсина, разводят питательным составом (№ 199, содержащим необходимые аминокислоты и соли) и помещают в пробирки или в специальные плоские чашки. В термостате клетки размножаются, образуя однослойный пласт по стеклу. Затем эту культуру однородных клеток заражают вирусом и происходящие в ней процессы изучают под микроскопом или другими способами. Так трудоемкий и дорогой способ, например культура вируса полиомиелита на печени обезьян, был заменен быстрым способом выращивания его в тканевой культуре.

В 1955 г. и позднее были получены необычные факты, вызвавшие недоумение у ученых биологов. Химическим путем вирус табачной мозаики был разделен на свои составные части: белок и нуклеиновую кислоту. Каждая из них в отдельности не вызывала заболевания мозаикой у листьев табака. Но когда их опять соединили вместе в пробирке (10 частей белка и 1 часть нуклеиновой кислоты) и заразили этой смесью листья табака, то получили типичную мозаику на листьях, как от исходного цельного ВТМ. При электронной микроскопии были найдены типичные палочки вируса, состоящие из белковой оболочки, в которой был заключен тяж нуклеиновой кислоты. Таким образом, нуклеиновая кислота связалась с белковой частью и заняла в ней свое нормальное положение. Открытие этого явления - ресиитеза (восстановления) вируса - является крупнейшим достижением современной микробиологии, открывающим новые пути в биологии и медицине.

Далее оказалось, что достаточно натереть лист табака лишь одной нуклеиновой кислотой, выделенной из ВТМ мягким способом, как на листе возникают (конечно, не в большом количестве) типичные некрозы, в которых находились в огромном количестве типичные цельные вирусные частицы.

Такие же результаты были получены с вирусами человека: полиомиелита, гриппа и др.

Выл получен даже гибридный вирус мозаики табака из белка одного типа вируса и РНК другого типа вируса, отличавшегося по некоторым признакам от вируса первого типа. При размножении этот гибридный вирус давал потомство только того вируса, чью РНК содержал гибрид.

Все эти факты говорят о том, что нуклеиновым кислотам принадлежит ведущая роль в размножении вирусов и инфекциозности их. Нуклеиновые кислоты обеспечивают передачу наследственных свойств. В кислотах заключена наследственная информация по синтезу полноценных вирусных частиц внутри клетки.

Белковая оболочка вируса несет защитную функцию, охраняя от внешних воздействий хрупкую нить нуклеиновой кислоты, кроме того, помогает вирусу проникать в клетку, определяет специфичность вирусов. Но некоторые ученые не считают возможным так ограничивать значение белков. Нужны дальнейшие исследования о роли вирусных белков.

Процесс размножения вирусов принципиально отличается от процесса размножения бактерий, простейших и других клеточных организмов.

Различают четыре фазы этого процесса: прикрепление вирусных частиц к клетке хозяина, проникновение вируса внутрь клетки, внутриклеточное размножение вируса и выход новых частиц вируса из клетки.

Первая фаза - прикрепление, или адсорбция, вируса к клетке - изучена в отношении вирусов гриппа и полиомиелита. Стенка клетки имеет мозаичное строение, в одних местах ее выступают молекулы мукопротеидов, в других молекулы липопротеидов. Вирус гриппа адсорбируется на мукопротеидах, а вирус полиомиелита адсорбируется на липопротеидах. Адсорбцию можно наблюдать в электронный микроскоп. В месте адсорбции вируса на стенке клетки образуется углубление, куда втягивается частица вируса. Края углубления смыкаются, и частица вируса оказывается внутри клетки (виропексис). Одновременно с виропексисом происходит разрушение белковой оболочки вируса. Проникновению вируса гриппа в клетку способствует фермент его оболочки. Таким образом, в клетку проникает нуклеиновая кислота, освобожденная от белковых оболочек с помощью ферментов самой клетки.

В третьей фазе проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота включается в обмен веществ клетки и направляет аппарат синтеза клетки на производство белка и нуклеиновой кислоты не клетки, а новых вирусных частиц. Деятельность ферментов, участвующих в синтезе вируса, активизируется, а остальных ферментов тормозится. Кроме того, создаются новые ферменты, которых клетка не имела, но которые необходимы для синтеза вирусных частиц. Можно полагать, что в это время организуется новая единая система вирус - клетка, переключенная на синтез вирусного материала. В начале этой фазы не удается различить в клетке какие-либо элементы вируса.

Обычно нуклеиновые кислоты и белки вируса синтезируются не одновременно и в разных местах клетки. Сначала начинается синтез нуклеиновой кислоты, а затем несколько позднее идет синтез белка. После накопления этих составных частей вируса происходит их объединение, сборка в полноценные вирусные частицы. Иногда образуются неполные вирусные частицы, лишенные нуклеиновой кислоты и потому неспособные к самопроизводству (бублики).

Быстро наступает последняя фаза - выход вирусных частиц из клетки. В каком-либо месте клетки сразу выходит около 100 частиц вируса, У более сложных вирусов имеются еще внешние оболочки вирусного нуклеопротеида, которыми они обволакиваются во время прохождения через клетку и выхода из нее, при этом в состав внешних оболочек входят белки клетки хозяина.

У вирусов человека и животных выход нового потомства происходит в несколько циклов. Так, у вируса гриппа каждый цикл продолжается часов 5-6 с выходом 100 и более вирусных частиц одной клетки, а всего наблюдается 5-6 циклов в течение 30 часов. После этого способность клетки производить вирус истощается, и она погибает. Весь процесс размножения парагриппозного вируса Сен дай от адсорбции до выхода из клетки продолжается 5-6 часов.

Иногда частицы вируса не выходят из клетки, а скапливаются в ней в виде внутриклеточных включений, очень характерных для разных видов вирусов. Вирусы растений образуют включения, имеющие кристаллическую форму.

Большое внимание начинает привлекать к себе семейство микробов, получившее название "микоплазма", так как за последнее время в этой группе обнаружены возбудители различных заболеваний человека и животных. В виде скрытой инфекции они часто обитают во многих тканевых культурах - Хела и др. Микоплазмы занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. С вирусами их сближает фильтруемость через бактериальные фильтры, фильтрующиеся формы способны к саморепродукции, внутриклеточному размножению. К признакам, сближающим вирусы с бактериями, относится способность расти на питательных средах, образовывать на них колонии, а также отношение к антибиотикам, сульфамидам и их антигенная структура.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги).

Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным – натуральной оспы (около 350 нм).

Различают просто устроенные (например, вирус полиомиелита) и сложно устроенные (например, вирусы гриппа, кори) вирусы. У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. capsa – футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц – капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид, взаимодействуя друг с другом, образуют нуклеокапсид. У сложно устроенных вирусов капсид окружен дополнительной липопротеидной оболочкой – суперкапсидом (производное мембранных структур клетки-хозяина), имеющей «шипы». Для вирионов характерен спиральный, кубический и сложный тип симметрии капсида. Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида, кубический тип симметрии – образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.В вирусологии используют следующие таксономические категории: семейство (название оканчивается на viridae), подсемейство (название оканчивается на virinae), род (название оканчивается на virus).

Однако названия родов и особенно подсемейств сформулированы не для всех вирусов. Вид вируса биноминального названия, как у бактерий, не получил.

В основу классификации вирусов положены следующие категории:

§ тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две),

§ особенности воспроизводства вирусного генома;

§ размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;

§ наличие суперкапсида;

§ чувствительность к эфиру и дезоксихолату;

§ место размножения в клетке;

§ антигенные свойства и пр.

Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также растения и бактерии. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, вирусы также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирус краснухи, цитомегаловирус и др.), поражая плод человека. Они могут приводить к постинфекционным осложнениям – развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов и др.

Кроме обычных вирусов, известны и так называемые неканонические вирусы – прионы – белковые инфекционные частицы, являющиеся агентами белковой природы, имеющие вид фибрилл размером 10.20x100.200 нм. Прионы, по-видимому, являются одновременно индукторами и продуктами автономного гена человека или животного и вызывают у них энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции (болезни Крейтц-фельдта.Якоба, куру и др.). Другими необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды – небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие заболевания у растений.

Глава 3

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность микробных клеток, процессы их питания, дыхания, роста, размножения, закономерности взаимодействия с окружающей средой.

Предметом изучения медицинской микробиологии является физиология патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способных вызывать заболевания человека. Выяснение физиологии этих микроорганизмов важно для постановки микробиологического диагноза, понимания патогенеза, проведения лечения и профилактики инфекционных заболеваний, регуляции взаимоотношений человека с окружающей средой и т.д.

Химический состав бактерий

В состав микроорганизмов входят вода, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, минеральные вещества.

Вода – основной компонент бактериальной клетки, составляющий около 80 % ее массы. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18.20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе – потере клеткой воды в гипертоническом растворе – происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды микроорганизмы не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей.

Белки (40.80 % сухой массы) определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.

Нуклеиновые кислоты бактерий выполняют функции, аналогичные нуклеиновым кислотам эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.

Бактерии можно характеризовать (таксономически) по содержанию суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в молярных процентах (М%) от общего количества оснований ДНК. Более точной характеристикой микроорганизмов является гибридизация их ДНК. Основа метода гибридизации

ДНК – способность денатурированной (однонитчатой) ДНК ренатурироваться, т.е. соединяться с комплементарной нитью ДНК и образовывать двухцепочечную молекулу ДНК.

Углеводы бактерий представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.

Липиды в основном входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме биомолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии туберкулеза.

Минеральные вещества бактерий обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.).Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.

Питание бактерий

Особенности питания бактериальной клетки состоят в поступлении питательных субстратов внутрь через всю ее поверхность, а также в высокой скорости процессов метаболизма и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Типы питания . Широкому распространению бактерий способствует разнообразие типов питания. Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы (от греч. autos – сам, trophe – пища), использующие для построения своих клеток диоксид углерода СО 2 и другие неорганические соединения, и гетеротрофы (от греч. heteros – другой, trophe – пища), питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.

В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофны-ми (от греч. lithos – камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, – органотрофами.

Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т.е. фотосинтезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии.

Факторы роста . Микроорганизмам для роста на питательных средах необходимы определенные дополнительные компоненты, которые получили название факторов роста. Факторы роста – необходимые для микроорганизмов соединения, которые они сами синтезировать не могут, поэтому их необходимо добавлят в питательные среды. Среди факторов роста различают: аминокислоты, необходимые для построения белков; пурины и пиримидины, которые требуются для образования нуклеиновых кис лот; витамины, входящие в состав некоторых ферментов. Для обозначения отношения микроорганизмов к факторам роста используют термины «ауксотрофы» и «прототрофы». Ауксотрофы нуждаются в одном или нескольких факторах роста, прототрофы могут сами синтезировать необходимые для роста соединения. Они способны синтезировать компоненты из глюкозы и солей аммония.

Механизмы питания. Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Д. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: это простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп. Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку – простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липид-ную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.

Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому компоненту цитоплазматической мембраны – собственно переносчику.

Белками-переносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых – цитоплазматическая мембрана. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный процесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется. Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем-ферменты бактерий. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), т.е. метаболизма. Многие ферменты взаимосвязаны со структурами микробной клетки. Например, в цитоплазматической мембране имеются окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании и делении клетки; ферменты, обеспечивающие питание клетки, и др. Окислительно-восстановительные ферменты цитоплазматической мембраны и ее производных обеспечивают энергией интенсивные процессы биосинтеза различных структур, в том числе клеточной стенки. Ферменты, связанные с делением и аутолизом клетки, обнаруживаются в клеточной стенке. Так называемые эндоферменты катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки.

Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, усваиваемых клеткой в качестве источников энергии, углерода и др. Некоторые экзоферменты (пенициллиназа и др.) инактивируют антибиотики, выполняя защитную функцию.

Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. К конститутивным ферментам относят ферменты, которые синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются бактериальной клеткой только при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, р-галактозидаза кишечной палочкой на среде с глюкозой практически не образуется, но её синтез резко увеличивается при выращивании на среде с лактозой или другим р-галактозидозом.

Некоторые ферменты (так называемые ферменты агрессии) разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое распространение в инфицированной ткани микроорганизмов и их токсинов. К таким ферментам относят гиалуронидазу, коллаге-назу, дезоксирибонуклеазу, нейраминидазу, лецитовителлазу и др. Так, гиалуронидаза стрептококков, расщепляя гиалуроновую кислоту соединительной ткани, способствует распространению стрептококков и их токсинов.

Известно более 2000 ферментов. Они объединены в шесть классов: оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы и др.); трансферазы, переносящие отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим; гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза, т.е. расщепления веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глкжозидазы и др.); лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидролитическим путем (карбоксилазы и др.); изомеразы, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексои-зомераза и др.); лигазы, или синтетазы, ускоряющие синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза, глю-таминсинтетаза и др.).

Различия в ферментном составе используются для идентификации микроорганизмов, так как они определяют их различные биохимические свойства: сахаролитические (расщепление сахаров), протеолитические (разложение белков) и другие, выявляемые по конечным продуктам расщепления (образование щелочей, кислот, сероводорода, аммиака и др.).

Ферменты микроорганизмов используют в генетической инженерии (рестриктазы, лигазы и др.) для получения биологически активных соединений, уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Ферменты применяют в качестве биодобавок в стиральные порошки («Ока» и др.) для уничтожения загрязнений белковой природы.

Дыхание бактерий

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление – отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление – присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным – нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч. аег – воздух + bios – жизнь) – жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Облигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. При наличии кислорода бактерии образуют перекисные радикалы кислорода, в том числе перекись водорода и супероксид-анион кислорода, токсичные для облигатных анаробных бактерий, поскольку они не образуют соответствующие инактивирующие ферменты. Аэробные бактерии инактивируют перекись водорода и супероксид-анион соответствующими ферментами (каталазой, пероксидазой и супероксиддисмутазой). Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие. Факультативные анаэробы способны осуществлять анаэробное дыхание, называемое нитратным: нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.Среди облигатных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые сохраняются при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты – специальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами.

Рост и размножение бактерий

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом – формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением – самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, Реже путем почкования.

Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактернями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра – нуклеоида. Репликация хромосомной ДНК осуществляется от начальной точки огі (от англ, origin – начало).

Хромосома бактериальной клетки связана в области огі с цитоплазматической мембраной. Репликация ДНК катализируется ДНК-полимеразами. Сначала происходит раскручивание (деспирализация) двойной цепи ДНК, в результате чего образуется репликативная вилка (разветвленные цепи); одна из цепей, достраиваясь, связывает нуклеоти-ды от 5"- к З"-концу, другая – достраивается посегментно.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация. Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки: прикрепленные к цитоплазматической мембране или ее производным (например, мезосомам) хромосомы по мере увеличения объема клетки удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутоли-тических ферментов, разрушающих сердцевину перегородки деления. Аутолиз при этом может проходить неравномерно: делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления. Такие клетки располагаются под углом друг к другу, что характерно для дифтерийных коринебактерий.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:

§ лаг-фаза;

§ фаза логарифмического роста;

§ фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

§ бактерий;

§ фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования. Лаг-фаза (от англ, lag – запаздывание) – период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-Фазы в среднем 4.5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий.

Продолжительность ее около 5. 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы; см. главу 5), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают ее, например синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) окрашивает среду в синий цвет. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. Так, колонии «чудесной палочки» имеют кроваво-красный пигмент, растворимый в спирте. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и перок-сидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.

Вид, форма, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде могут учитываться при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур.

В промышленных условиях при получении биомассы микроорганизмов с целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов, эубиотиков культивирование бактерий и грибов осуществляют в ферментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров для роста и размножения культур (см. главу 6).

Место действия - лаборатория Никитского ботанического сада при Академии наук России, где биолог Дмитрий Иосифович Ивановский (1864-1920) изучает загадочную мозаичную болезнь табака. Возбудитель заболевания у растения проходит через самые малые бактериальные фильтры, не дает роста на и не дает симптоматики при заражении здоровых растений фильтратами из больных.

Именно тогда, в 1892 году, ученый делает вывод - это не бактерии. И называет возбудителя вирусами (от латинского virus, - яд). Дмитрий Ивановский всю свою жизнь пытался увидеть вирусы, но мы увидели морфологию вирусов в 30-х годах XX века, когда были изобретены электронные микроскопы.

Но именно эта дата считается началом науки вирусологии, а Дмитрий Ивановский ее основателем.

Удивительное царство

Отличительные признаки вирусов следующие:

Часть органического мира планеты

На сегодняшний день уже описано более 6 тысяч вирусов, но предполагается, что их существует более ста миллионов. Это самая многочисленная биологическая форма на планете, и представлена она во всех экосистемах (повсеместное (убиквитарное) распространение).

Их появление на планете и сегодня не ясно. Известно одно - когда появились первые клеточные формы жизни, вирусы уже были.

Живые и не живые

Эти удивительные организмы имеют две формы своего существования, которые существенно отличаются друг от друга.

Вирион по сути это неживая часть жизни. А геном вируса в клетке его живая составляющая, ведь именно там происходит воспроизведение вирусов.

Морфология и ультраструктура вирусов

В данном контексте мы говорим о вирионе - внеклеточной форме.

Размер вирионов измеряется в нанометрах - 10 -9 метра. Вирусы гриппа имеют средние размеры - 80-120 нанометров, а вирус оспы - гигант с размерами в 400 нанометров.

Строение и морфология вирусов похожа на космонавтов. Внутри капсида (белковой оболочки, иногда содержащей жиры и углеводы), как в «скафандре», находится самая ценная часть - нуклеиновые кислоты, геном вируса. Причем и этот «космонавт» представлен в минимальном количестве - только непосредственно наследственный материал и минимум ферментов для его репликации (копирования).

Внешне «скафандр» может быть палочкообразный, шаровидный, пулевидный, в форме сложного икосаэдра или вообще не правильной формы. Это зависит от наличия в капсиде специфических белков, которые отвечают за проникновение вируса внутрь клетки.

Как патоген попадает в организм хозяина

Способов проникновения много, но самый распространенный воздушно-капельный. Мириады мельчайших частичек выбрасываются в пространство не только при кашле или чихании, а и просто при дыхании.

Другой путь попадания вирионов в организм - контагиозный (непосредственный физический контакт). Этот способ присущ довольно небольшой группе патогенов, именно так передается герпес, венерические инфекции, СПИД.

Способ заражения через переносчика, которыми могут быть различные группы организмов, довольно сложный. Переносчик, получивший патоген из резервуара инфекции, становится местом, где вирусы могут размножаться или проходить стадии развития. Вирус бешенства - именно такой патоген.

Что происходит в организме хозяина

При помощи внешних белков капсида вирус прикрепляется к клеточной мембране и проникает внутрь посредством эндоцитоза. Они попадают в лизосомы, где под действием ферментов избавляются от «скафандра». И нуклеиновые кислоты патогена попадают в ядро или же остаются в цитоплазме.

Нуклеиновые кислоты патогена встраиваются в цепочки нуклеиновых кислот хозяина, и запускается реакция репликации (копирования) наследственной информации. Когда в клетке накопится достаточное количество вирусных частиц, при этом вирионы используют энергетический и пластические механизмы и ресурсы хозяина.

Последний этап - выход вирионов из клетки. Некоторые вирусы приводят к полной деструкции клеток и попадают в межклеточное пространство, другие выходят в него посредством экзоцитоза или почкования.

Стратегии патогена

Строение морфология вирусов приводит к полной зависимости патогена от энергетического и белоксинтезирующего потенциала клетки, единственное условие - он реплицирует свои нуклеиновые кислоты по собственному расписанию. Такое взаимодействие называется продуктивным (естественно для вируса, но не для клетки). Исчерпав запас клетки, вирус приводит к ее гибели.

Другой тип взаимодействия - соглашательный. В таком случае геном вируса, встроенный в геном хозяина, реплицируется ковалентно с собственными нуклеиновыми кислотами клетки. А дальше развитие сценария может пойти в двух направлениях. Вирус ведет себя тихо и не проявляет себя. Молодые вирионы покидают клетку только при определенных условиях. Либо гены патогена постоянно работают, продуцируют большое количество молодого поколения, но клетка не погибает, а они покидают ее посредством экзоцитоза.

Сложности систематики

Классификация и морфология вирусов различна в разнообразных источниках. При этом для их классификации используются следующие признаки:

Тип нуклеиновой кислоты (РНК - содержащие и ДНК-содержащие) и способ ее репликации. Самая распространенная классификация вирусов, предложенная американским вирусологом Дэвидом Балтимором в 1971 году.
Морфология и структура вируса (однонитевые, двухнитевые, линейные, кольцевые, фрагментированные, не фрагментированные).
Размеры, тип симметрии, количество капсомеров.
Наличие суперкапсида (внешней оболочки).
Антигенные свойства.
Тип генетического взаимодействия.
Круг потенциальных хозяев.
Локализация в клетке-хозяине - в ядре или в цитоплазме.

Именно выбором главного критерия и морфологии вирусов, в микробиологии определяются различные подходы к классификации вирусов. Это довольно не просто. Сложность состоит в том, что изучать морфологию и строение вируса мы начинаем только тогда, когда они приводят к патологическим процессам.

Привередливые и не очень

По выбору хозяина эти патогены чрезвычайно разнообразны в своих предпочтениях. Некоторые нападают исключительно на один биологический вид - имеют очень строгую «прописку». Например, ест вирусы гриппа кошек, чаек, свиней, которые совершенно безопасны для других животных. Иногда специализация бывает удивительной - вирус бактериофаг Р-17 поражает только мужские особи одной разновидности кишечной палочки.

Другие вирусы ведут себя совершенно иначе. Например, пулевидные вирусы, морфология которых похожа на пулю, вызывают совершенно разные болезни и при этом круг хозяев у них чрезвычайно широк. К таким вирусам относится вирус бешенства, который поражает всех млекопитающих, или вирус везикулярного стоматита (передаваемый, кстати, посредством насекомых).

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

ВВЕДЕНИЕ

Сегодня ситуация на Земле такая, что каждый год открывают все новые и новые вирусы человека и животных, которые являются весьма опасными для здоровья человека. Люди перемещаются по странам и континентам, вступают друг с другом в различные контакты, мигрируют по экономическим, социальным, экологическим причинам. На территории планеты привнесены опасные вирусы лихорадки Рифт-Валли, Зика, Эбола, лихорадки долины Рифт, и некоторые другие. По большей части они достаточно близки по строению, и вызывают серьезные заболевания человека, являющиеся очень контагеозными и вирулентными, с высокой степенью летальности, что является серьезной угрозой для населения.

Необходимо отметить существующие эпидемии СПИДа и гепатита С, которые до настоящего времени не имеют лечения, а разрушают нашу иммунную систему с большой скоростью. В связи с этим, рассмотрение данного вопроса является весьма актуальным.

На вирусах изучаются вопросы генетики микробов и актуальные проблемы биохимии. Учёные всё более глубоко и успешно познают тончайшую структуру, биохимический состав и физиологические свойства этих ультрамикроскопических живых существ, их роль в природе, жизни человека, животного и растений. Развитие вирусологии связано с блестящими успехами молекулярной генетики. Изучение вирусов привело к пониманию тонкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению механизмов мутации. Вирусы широко применяются в работах генной инженерии. Способность вирусов приспосабливаться, вести себя непредсказуемо - не знает предела. Миллионы людей стали жертвами вирусов - возбудителей различных болезней. И всё-таки основные успехи вирусологии достигнуты в борьбе с конкретными болезнями и это даёт основание утверждать, что в нашем третьем тысячелетии вирусология займёт ведущее место.

Объектом нашего исследования является изучение неклеточной формы жизни.

Предметом исследования является изучение морфологии вирусов, и методах индикации.

Цель работы. На основе знаний особенностей биологии вирусов обосновать способы их культивирования, индикации, идентификации и методы лабораторной диагностики, вызываемых ими заболеваний.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

Изучить литературные данные по морфологии вирусов.

Ознакомиться с наиболее чувствительными методами диагностики вирусных инфекций.

Степень изученности данного вопроса В 1892 г. русский ученый-ботаник Д.И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили название вирусов (от лат. Virus - яд). Большой вклад в изучение вирусов внесли русские вирусологи: М.А. Морозов, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Зильбер, М.П. Чумаков, А.А. Смородинцев, В.М. Жданов и др.

Личный вклад автора: путем изучения теоретического материала и лабораторных исследований автору удалось: трактовать морфологию и ультраструктуру вирусов. Ознакомиться с классификацией вирусов. Проанализировать особенности взаимодействия вирусов с живыми системами. Оценить результаты в живых системах. Проанализировать методы культивирования вирусов в лабораторных условиях. Трактовать современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.

Глава 1. МЕСТО ВИРУСОВ В БИОСФЕРЕ

1.1.Эволюционное происхождение

По мере изучения природы вирусов в первом полу столетии после их открытия Д.И.Ивановским (1892) формировались представления о вирусах как о мельчайших организмах. Многие ученые из других стран пытались первыми решить эту проблему. Эпитет “фильтрующийся” со временем был отброшен, так как стали известны фильтрующиеся формы или стадии обычных бактерий, а затем и фильтрующиеся виды бактерий. Наиболее правдоподобной и приемлемой является гипотеза о том, что вирусы произошли из “беглой” нуклеиновой кислоты, т.е. нуклеиновой кислоты, которая приобрела способность реплицироваться независимо от той клетки, из которой она возникла, хотя при этом предусматривается, что такая ДНК реплицируется с использованием структур этой или другой клеток. Эти участки высокомолекулярны, имеют большую молярную массу, активно участвуют в окислительных реакциях, необратимых изменениях, обладают большей скоростью восстановления органических процессов.

На основании опытов фильтрации через градуированные линейные фильтры были определены размеры вирусов. Это явилось большим прорывом для ученых вирусологов. Размер наиболее мелких из них оказался равным 20-30 нм, а наиболее крупных - 300-400 нм. В процессе дальнейшей эволюции у вирусов менялась больше форма, чем содержание.

Таким образом, вирусы, должно быть, произошли от клеточных организмов, и их не следует рассматривать, как примитивных предшественников клеточных организмов.

1.2.Строение и свойства вирусов

Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В связи с этим, они могут быть рассмотрены только при помощи электронной микрокопии, форма их разнообразна: от нитевидных клубочков до сложных гексаэндрических фигур, с включениями ДНК или РНК. В среднем они в 50 раз меньше бактерий. Их нельзя увидеть в световой микроскоп, так как их длины меньше длины световой волны.

Вирусы состоят из различных компонентов:

а) сердцевина генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу и другие.

б) белковая оболочка, которую называют аспидом.

Оболочка часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии.

в) дополнительная липопротеидная оболочка.

Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес).

Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом.

Положения о том, что вирусы представляют собой полноценные организмы, позволило окончательно объединить все три названных группы вирусов - вирусы животных, растений и бактерий - в одну категорию, занимающую определенное место среди живых существ, населяющих нашу планету. Как и другие организмы, вирусы способны к размножению. Вирусы обладают определенной наследственностью, воспроизводя себе подобных. Данное положение получило подтверждение у ученых других стран, работающих над аналогичной проблемой. Наследственные признаки вирусов можно учитывать по спектру поражаемых хозяев и симптомам вызываемых заболеваний, а также по специфичности иммунных реакций естественных хозяев или искусственных иммунизируемых экспериментальных животных. Сумма этих признаков позволяет четко определить наследственные свойства любого вируса, и даже больше - его разновидностей, имеющих четкие генетические маркеры, например: нейтропность некоторых вирусов гриппа, сниженную патогенность у вакциональных вирусов и т.п.

1.3. Бактериофаги

Спустя 25 лет после открытия вируса, канадский ученый Феликс Д’Эрель, используя метод фильтрации, открыл новую группу вирусов, поражающих бактерии. Они так и были названы бактериофагами (или просто фагами). Многие ученые пытались повторить аналогичные экспериментальные исследования, но должных результатов не получили.

Заключённую в головке фага нуклеиновою кислоту защищает белковая оболочка. Она является главной субстанцией для жизнеобеспечения вируса. На нижнем своём конце головка переходит в отросток, который заканчивается шестиугольной «площадкой» (базальной пластинкой) с шестью короткими выростами (шипами) и шестью длинными фибриллами (нитями). Отросток окружён чехлом по всей длине, от головки до пластинки. Отростки являются рецепторами, узнающими рецепторы на поверхности бактериальных клеток, которые являются транспортными белками, осуществляющими процессы поступления и выделения веществ из клетки. Это взаимодействие носит высокоспецифичный характер. Благодаря чему, бактериофаг подходит как “ключ к замку”, только для определенного штамма бактериальных клеток. Бактериофаги играют важную эволюционную роль в формировании новых штаммов бактериальных клеток в связи со способностью умеренных фагов интегрироваться с ДНК клетки-хозяина, захватывать часть клеточной ДНК из одной бактериальной клетки и приносить её в геном другой клетки, в процессе трансдукции. Этот процесс обеспечивает обмен генетической информации между бактериями одного или разных штаммов, и заменяет отсутствующий у бактерий типичный половой процесс.

Жизненный цикл фага составляет 30 минут, но бывает временной отрезок увеличивается до 1 часа, или уменьшается до 15 минут, в зависимости от условий окружающей среды: температуры, влажности, давления, плотности атмосферных слоев. Освобождающиеся в процессе репродукции вирусные частицы участвуют в заражении здоровых клеток, что приводит к гибели всей популяции бактерий, актиномицетов, риккетсий, трепаносом, грибов рода Кандида.

Данное свойство бактериофагов разрушать бактерии используется для предупреждения и лечения бактериальных заболеваний, как правило желудочно-кишечного тракта, а именно сальмонеллеза, стафилококка и других энтеробактерий, некоторых других инфекций Через 10-15 минут после введения бактериофагов в организм возбудителя чумы, брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллеза обезвреживаются. Таким образом, бактериофаги являются эффективными и безопасными с точки зрения здоровья человека источниками биологической защиты его организма. Страны Запада, заинтересованные в получении противо вирусологических материалов, вакцин, ферментов, вложили большие капиталы в разработку, внедрение, приобретение дорогостоящих медикаментов. Это было одним из направлений защитной политики государства

Но у этого метода есть серьезный недостаток. Бактерии более изменчивы (в плане защиты от фагов) чем бактериофаги, поэтому бактериальные клетки относительно быстро становятся нечувствительным к фагам. Этот способ защиты организма человека невозможно использовать, если кроме клеточной стенки бактериальные клетки имеют слизистые чехлы и слои и капсулы. Эти образования на поверхности бактерий надежно защищают их от проникновения бактериофагов в клетки, так как они неспособны адсорбироваться на их поверхности, а это обязательные условия для начала проникновения вируса в бактериальную клетку.

ГЛАВА 2.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Лабораторные исследования играют важную роль в установлении диагноза инфекционных болезней. История развития лабораторной диагностики достаточно обширна. В начале своего исторического развития, в качестве основного лабораторного метода исследования использовали организмы животных. Диагностика была процессом трудоемким и дорогостоящим. И о наличии вирусной инфекции судили по характеру поражения внутренних органов животных. Этот организменный уровень исследования, был заменен, когда в лабораторную практику были введены куриные эмбрионы. Это стало возможным, благодаря тому, что в 1941 году американский вирусолог Хернст обнаружил феномен гемагглютинации—это способность вирусов склеивать эритроциты, которые являются переносчиками кислорода и выполняют ряд важнейших функций. Данную проблему изучают многие ученые. Эта модель стала основой для изучения взаимодействия вируса и клетки. В основе механизма реакции гемагглютинации лежит механизм вирусной адсорбции на поверхностной мембране эритроцитов, в результате чего происходит их склеивание, так как одна вирусная частица может захватывать несколько эритроцитов. Открытие возможности культивирования клеток в искусственных условиях, явилось революционным событием, послужившим для выделения, диагностики и изучения большого количества вирусов. Появилась возможность получения культуральных вакцин.

Лабораторные методы диагностики различны по чувствительности и специфичности.

2.1 Микробиологический метод

Микробиологический метод диагностики основан на обнаружении возбудителей в биологическом материале. Используют светооптическую и электронную микроскопию.

Микробиологический метод широко применяют в диагностике инфекционных болезней бактериальной, протозойной этиологии и, реже, вирусных болезней.

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится по трем основным направлениям:

поиск возбудителя в материале, взятом у пациента (фекалий, мочи, мокроты, крови, гнойного отделяемого и т.д.);

определение специфических антител в сыворотке - серологической диагностики;

определение человеческого тела повышенная чувствительность к инфекционным агентам - аллергический метод.

Для выявления инфекционного агента и его идентификацию (определение вида возбудителя) используют три метода: микроскопические, микробиологические (бактериологические) и биологические.

Микроскопический метод позволяет обнаружить возбудитель непосредственно в материале, взятом у пациента. Этот метод имеет решающее значение для диагностики гонореи, туберкулеза, заболеваний, вызванных простейшими: малярии, лейшманиоза, балантидиаза, амебиаза. Особенности микроскопического метода для этих инфекций вызваны возбудителями значительных морфологических различий этих заболеваний. Особенности морфологии патогенных микроорганизмов играют важную роль в диагностике. Тем не менее, микроскопический метод не позволяет диагноз при таких инфекциях, таких как тиф и паратиф, дизентерия, потому что они различить их агенты морфологически невозможно (все грамотрицательные палочки). Для того, чтобы различать одинаковую морфологию микроорганизмов, они должны получить в чистой культуре и определить, что можно сделать с помощью микробиологического (бактериологического) метода исследования.

Эффективность микроскопического метода определяется его чувствительностью и специфичностью. Специфичность ограничивается возможной ошибочной идентификацией возбудителя из-за артефактов. Кроме того, при проведении микроскопического исследования имеют значение техника исследования.

2.2. Бактериологический метод

Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Бактериологические лаборатории призваны осуществлять диагностику бактериологических болезней, контролировать заболевания животных, участвовать в организации и проведении противоэпидемиологических мероприятий и ликвидаций вирусных болезней. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах. Основным критериями, которые должны обладать питательные среды это прежде всего их питательность. Достаточное количество белков, ферментов, ростовых гормонов, которые стабилизируют условия питательности и хорошего обогащения среды. Основным уплотняющим агентом для среды является полисахарид- агар-агар. С его помощью питательные среды являются более плотными, что существенно сыграло важную роль в культивировании микроорганизмов, поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.

В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию. Микробиологический метод заключается в посеве исследуемого материала на питательную среду, чистой культуры изоляции и идентификации возбудителя. Если инфекционные агенты (риккетсии, вирусы, простейшие, некоторые) не растут на искусственных средах или необходимо изолировать возбудитель микробных ассоциаций, а затем использовать метод заражения восприимчивых животных биологии.

2.3.Вирусологический метод

Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Материалами могут быть кровь, другие биологические и патологические жидкости, биоптаты органов и тканей.

Вирусологическое исследование крови часто проводят с целью диагностики арбовирусных инфекций. Если необходимо использовать готовую структуры клеток и среды для них, отпадает необходимость в других биоматериалов. Вирусологические исследования с использованием культур клеток стоят на 2 месте по доступности для лабораторных испытаний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа и других ОРВИ, кори. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеро-, адено-, рео- и ротавирусы.

Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных.Страны Запада, заинтересованные в получении противовирусологических материалов, вакцин, ферментов, вложили большие капиталы в разработку, внедрение, приобретение,дорогостоящих медикаментов. Это было одним из направлений защитной политики государства Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности", например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, поэтому для выделения определенного вируса используют соответствующую культуру ткани. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментно заражать 3—4 культуры клеток, предполагая, что одна из них может оказаться чувствительной. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Чаще всего используют эмбрионы кур. При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (арбовирусы), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции.

2.4 Биологический метод

Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.

Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.

2.5 Иммунологический метод

Иммунологический метод (серологический) включает исследования сыворотки крови, а также других биологических субстратов для выявления специфических антител и антигенов. Классическая серодиагностика основана на определении антител к выявленному или предполагаемому возбудителю. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке крови антител к антигенам возбудителя, отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Обнаружения в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета, поэтому исследуют «парные» сыворотки крови, первую, взятую в первые дни болезни, и вторую, взятую с интервалом 7—10 дней. В этом случае оценивают динамику нарастания уровня антител.

Диагностически значимо увеличение титра антител в исследуемой сыворотке крови не менее чем в 4 раза относительно первоначального уровня. Этот феномен называют сероконверсией. Белковые компоненты встраиваются самостоятельно в пептидные цепи. При редких инфекционных болезнях, а также вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции и некоторых других факт наличия антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.

Кроме определения титра антител, при проведении серологических исследований можно установить изотип антител. Известно, что при первой встрече организма человека с возбудителем в остром периоде болезни выявляют более быстрое нарастание антител, принадлежащих к IgM, уровень которых, достигая максимального значения, затем снижается. В более поздние сроки болезни повышается количество IgG-антител, которые дольше сохраняются и определяются в периоде ре-конвалесценции. При повторной встрече с возбудителем благодаря иммунологической памяти реакции гуморального иммунитета проявляются более быстрой продукцией IgG-анти-тел, а антитела класса М вырабатываются в незначительном количестве. Обнаружение IgM-антител свидетельствует о наличии текущего инфекционного процесса, а наличие IgG-антител — о перенесенной в прошлом инфекции или поствакцинальном иммунитете.

Учитывая особенности первичного и вторичного иммунного ответа, анализ соотношения IgM- и IgG-антител позволяет в некоторых случаях дифференцировать стадию инфекционного процесса (разгар заболевания, реконвалесценция, рецидив). Например, в случае вирусного гепатита А (ГА) надежным методом диагностики служит определение анти-HAV IgM-антител в сыворотке крови. Их выявление свидетельствует о текущей или недавно возникшей HAV-инфекции. Белковые компоненты встраиваются самостоятельно в пептидные цепи.

Серологическое исследование для обнаружения антител при инфекционных заболеваниях является более доступным методом лабораторной диагностики, чем выделение возбудителя. Иногда положительная серологическая реакция служит единственным доказательством встречи и взаимодействия организма с возбудителем соответствующего инфекционного заболевания. Кроме того, ряд заболеваний со сходной клинической картиной (например, риккетсиозы, энтеровирусные инфекции) могут быть дифференцированы лишь серологически, что отражает значение серологических методов в диагностике инфекционных болезней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Адрианов В. В., ВасилюкН. А. «Общая и частная вирусология» 27 (4): 50—56. 2012.

2. Балин Р.М., Баранова А.П. «Бактериофаги» - М.: Медицина, 1997. - 236 с.

3. Бактериологический метод. / Под ред. А.М. Вейна. — М.: МИА, 2003. — 752 с.

4. Жемайтите Д.И. Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний. В кн: Анализ вирусов. - Вильнюс, 1982. - С. 22-32

5. Клецкин С.З. Вирусологический анализ. - М.: ВНИИМИ, 1979. -116 с.

6. Миронова Т.Ф., Миронов В.А. Клинический aнализ вирусов. - Челябинск, 1998. - 162 с.

7. Нагорная Н.В., Мустафина А.А. Инфекционные вирусы. Часть I // Здоровье ребенка. — 2007. — № 5 (8).

8. Oкунева Г.Н., Власов Ю.А., Шевелева Л.Т. Микробиология. - Новосибирск: Наука, 2000. - 280 с.

9. Рясик, Ю. В. Вирусы / Ю. В. Рясик, В. И. Циркин // Сибирский медицинский журнал. 2007. - Т. 72. -№5.-С. 49-52.

10. Сметнев, А. С. Бактериофаги. / А. С. Сметнев, О. И. Жаринов, В. Н. Чубучный // Кардиология. 1999. - № 4 . - С. 49-51.

11. Вирус иммунодефицита./ А. Р. Наниева и др. // Здоровье населения и среда обитания. 2011. - № 4. - С. 22-24.

12. Фокин, В. Ф. Вопросы вирусологии / В. Ф. Фокин, Н. В. Пономарева // Функциональная вирусология: хрестоматия / под ред. Н. Н. Боголепова, В. Ф. Фокина. -М.: Научный мир, 2004. С. 349-368.

13. Фокин, В. Ф. Строение вирусов / В. Ф. Фокин, Н. В. Пономарева. М.: Антидор, 2003. - 288 с.