Нобелевский комитет объявил лауреатов премии по химии. «Нобель» по химии присужден за развитие криоэлектронной микроскопии Нобелевские лауреаты по химии года

Нобелевская премия по химии в 2017 году была присуждена за развитие криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения структур биомолекул в растворах. Лауреатами стали из Лозаннского университета, Иоахим Франк из Колумбийского университета и из Кембриджского университета.

Криоэлектронная микроскопия - это форма просвечивающей электронной микроскопии, в которой образец исследуется при криогенных температурах.

Метод популярен в структурной биологии, так как позволяет наблюдать за образцами, которые не были окрашены или каким-либо образом зафиксированы, показывая их в их родной среде.

При электронной криомикроскопии замедляется движение входящих в молекулу атомов, что позволяет получать очень четкие изображения ее структуры. Получаемые о строении молекул сведения чрезвычайно важны, в том числе, для более глубокого понимания химии и развития фармацевтики.

Многие прорывы в науке связаны с успешной визуализацией объектов, невидимых человеческому глазу. Оптическая микроскопия позволила доказать существование микроорганизмов, взглянуть на сперматозоиды и яйцеклетки, частично изучить клеточную структуру и даже разглядеть хромосомы. Преодолеть физические ограничения оптических телескопов позволила электронная микроскопия, где вместо светового потока использовался пучок электронов.

Однако и у нее были свои изъяны. Во-первых, мощный пучок электронов разрушал биологический материал. Во-вторых, чтобы разогнаться электронам необходим вакуум - соответственно, в вакууме должен был находиться и препарат.

Поэтому изучать с ее помощью «живые» образцы было невозможно.

Вклад Иоахима Франка способствовал широкому распространению метода. Еще в 1975-1986 годах он разработал метод обработки изображений, заключавшийся в анализе полученных с помощью электронного микроскопа двумерных изображений и построения на их основе трехмерных структур изучаемых объектов.

Жак Дюбоше предложил использовать для сохранения образцов быстро охлажденную воду. Охлаждение образцов как способ их сохранения рассматривалось учеными довольно давно. Однако при замерзании воды и образовании кристаллической решетки структура образцов разрушалась. А в жидком виде она испарялась в вакуумной камере электронного микроскопа, опять-таки приводя к разрушению изучаемых молекул.

Наконец, был найден способ обойти фазу кристаллизации и добиться того, чтобы вода переходила в стеклообразное состояние. Метод был назван витрификацией.

При витрификации вода оказалась способна предохранять молекулы от разрушения даже в вакууме.

Эти открытия дали мощный толчок развитию электронной микроскопии. В 2013 году ученые смогли рассмотреть даже отдельные атомы вещества.Такое высокое разрешение позволяет рассматривать рибосомы и митохондрии клеток, ионные каналы и ферментные комплексы.

В 2015 году журнал Nature Methods назвал одночастичную криоэлектронную микроскопию прорывным методом года.

Последние технические достижения в этой области позволили ученым отойти от метода рентгеновской кристаллографии, главный недостаток которой — необходимость кристаллизации белка, что может быть затруднительно для белков со сложной структурой. Научные журналы последних лет пестрят детальными изображениями поверхности вируса Зика и белков, вызывающих устойчивость к антибиотикам. В частности, удалось , как бактерии золотистого стафилококка противостоят действию антибиотиков и снимок структуры, с помощью которой коронавирусы проникают в клетки.

Несмотря на быстрый прогресс в этой области, стоимость оборудования и стандартизированные методы несколько замедляют повсеместное распространение технологии криоэлектронной микроскопии.

Среди претендентов на Нобелевскую премию по химии числился россиянин — ведущий научный сотрудник Института химической физики (ИХФ) им. Н. Н. Семенова , вместе с коллегами из США и он сделал весомый вклад в область углеродно-водородной функционализации — отрасли, разрабатывающей новые методы синтеза органических соединений. Также в списке возможных лауреатов значились датчанин Йенс Норсков за фундаментальные достижения в области гетерогенного катализа на твердых поверхностях и команда из химиков Тсутому Миясаки, Нам-Гю Парка и Генри Снейта за открытие минерала перовскита и разработки на его основе.

В 2016 году премия была Жан-Пьеру Соважу, Стоддарту и Бернарду Феринге за изобретение молекулярных машин.

Нобелевская премия по химии за 2017 год присуждена Жаку Дюбуше (Jacques Dubochet), Иохиму Франку (Joachim Frank) и Ричарду Хендерсону (Richard Henderson) за разработку метода криоэлектронной микроскопии, которая позволила рассмотреть в подробностях - с очень высоким разрешением - молекулы живых организмов.

Жак Дюбуш - швейцарец, трудится в Университете Лозанны (University of Lausanne, Switzerland), Иохим Франк - американец из Колумбийского университета (Columbia University, New York, USA), Ричард Хендерсон - британский ученый из Кембриджа (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK).

В подчеркнуто, что исследования лауреатов, продолжавшиеся в 70-е - 90-е годы прошлого века, обеспечили революционный прорыв в биологии, поскольку позволили впервые взглянуть на то, что прежде было совсем невидимым - на отдельные биологические молекулы и даже на составляющие их атомы.

По сути ученые модернизировали электронную микроскопию. Прежде в электронный микроскоп наблюдали неживую материю. Лауреаты приспособили его к наблюдению за объектами живой природы. Научились замораживать их в водяном растворе так, что биомолекулы сохраняли свою форму, свойства и при этом «закреплялись» в удобном для наблюдения за ними виде.

В итоге, с помощью электронного микроскопа стало возможным получать трехмерные изображения рассматриваемых живых объектов. К 2013 году разрешение метода стало феноменальным. Появились изображения всевозможных молекулярных белков - например, тех, благодаря которым у бактерий появляется устойчивость к антибиотикам. Удалось «сфотографировать» даже вирусы - например, вирус Зика . Что сулит ближайшую победу над ним.

Исследователи, проникшие в микромир, отмечают: подробная картинка некого объекта - это кратчайший путь к пониманию его сути. То есть, к познанию. Просто очевидно, что Шведская королевская академия наук, присуждающая Нобелевские премии, разделяет это мнение.

СПРАВКА КП

Нынешняя Нобелевская премия по химии - 109-я по счету. Среди лауреатов, которые были удостоены этой - самой почетной в мире научной награды начиная с 1901 года, - 4 женщины.

Британский ученый Фредерик Сэндгер, включенный в список «100 гениев современности», получил Нобелевскую премию по химии дважды - в 1958 году и в 1980 году. Первый раз - за определение точной последовательности аминокислот в молекуле инсулина. Второй - за разработку метода расшифровки первичной структуры ДНК .

В прошлом году премия ушла ученым из Франции, США и Голландии. Француз Жан-Пьер Саваж (Jean-Pierre Sauvage), американец сэр Джеймс Фрезер Стоддарт (Fraser Stoddart) и голландец Бернард Лукас Феринга (Bernard L. Feringa) были награждены «за разработку и синтез молекулярных машин». Луреаты фактически заложили материальную основу нанотехнологии.

На прошлой неделе было объявлено, что Нобелевскую премию по химии 2017 года получат швейцарец Жак Дюбоше, американец немецкого происхождения Йоахим Франк и шотландец Ричард Хендерсон за «разработку методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения трехмерных структур биомолекул в растворе». Их работы позволили, начиная с 80-х годов прошлого века, опробовать и постепенно усовершенствовать этот вид микроскопии до такой степени, что в последние годы ученые могут рассматривать сложные биологические молекулы в мельчайших деталях. Нобелевский комитет отметил, что метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру, позволяя заполнить множество пробелов в знаниях о молекулах жизни и живых системах.

Сразу отметим, что вряд ли можно называть криогенную электронную микроскопию принципиально новым и самодостаточным методом физического исследования вещества. Скорее, она является разновидностью просвечивающей электронной микроскопии (один из авторов этого метода, Эрнст Руска , получил Нобелевскую премию в 1986 году), которую специально адаптировали для изучения микробиологических объектов.

В просвечивающем электронном микроскопе через достаточно тонкий образец, чтобы он был прозрачным для электронов (обычно это десятые и сотые доли микрона), пропускают пучок электронов, которые, проходя через образец, поглощаются и рассеиваются, меняя направление движения. Эти изменения можно зарегистрировать (сейчас в качестве детектора чаще всего используется ПЗС-матрица , создатели которой, Уиллард Бойл и Джордж Смит , стали лауреатами ) и, после анализа, получить изображение исследуемого объекта в плоскости, перпендикулярной пучку. Поскольку собственная длина волны электронов (десятки пикометров при энергиях, характерных для электронных микроскопов) много меньше длин волн света в видимой области (сотни нанометров), с помощью электронной микроскопии можно «разглядеть» гораздо более тонкие детали, чем с помощью оптической микроскопии, в том числе и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения (ФМВР), разработанной лауреатами Эриком Бетцигом , Штефаном Хеллем и Уильямом Мернером .

Предельная разрешающая способность электронных микроскопов - несколько ангстрем (десятые доли нанометра) - уже почти достигнута. Это позволяет получать изображения, на которых, например, различимы отдельные атомы. Для сравнения: предел возможностей ФМВР - 10–20 нм. Но просто так сравнивать разные методы по предельному разрешению довольно бессмысленно. Электронные микроскопы имеют высокое разрешение, но им не всегда можно воспользоваться. Дело в том, что образец, помимо измельчения при подготовке, во время самого исследования подвергается довольно серьезному облучению пучком электронов (грубо говоря, чем интенсивнее пучок, тем меньше ошибок и тем лучше получается результат), находясь при этом в вакууме (вакуум нужен, чтобы среда не рассеивала электроны вне образца, внося тем самым лишние искажения). Такие условия совершенно не подходят, если нужно изучать сложно устроенные биологические молекулы и объекты - они повреждаются в разреженной среде и в них много довольно слабых связей, которые просто будут разрушаться во время исследования.

Понимание того, что без дополнительных усовершенствований электронный микроскоп нельзя будет приспособить к изучению биомолекул и живых систем, появилось почти сразу после его изобретения. Об этом, например, писал спустя три года после демонстрации принципа работы электронного микроскопа Эрнстом Руской в 1931 году венгерский физик Ладислав Мартон (L. Marton, 1934. Electron Microscopy of Biological Objects). В той же статье Мартон предложил и пути решения этой проблемы. В частности, он же указал, что замораживание образцов может снизить ущерб от облучения пучком электронов. Важно отметить, что, хотя в статье Мартона это и не указано, замораживание образца помогает еще и тем, что снижает тепловое колебание молекул, что тоже способствует улучшению получаемого изображения.

В 1970–80-е годы наука и техника достигли достаточного уровня развития, чтобы преодолеть все трудности. И это произошло во многом благодаря усилиям лауреатов премии этого года.

Ричард Хендерсон был первым, кто получил при помощи просвечивающей электронной микроскопии (с охлаждением образца) изображение несимметричного белка с атомным разрешением. Свои исследования он начал еще в середине 70-х годов. Причем сперва Хендерсон пытался получить структуру нескольких белков из клеточной мембраны, используя метод рентгеноструктурного анализа , который уже тогда мог давать разрешение в несколько ангстрем. Однако быстро стало ясно, что этим способом хорошего результата не добиться: исследуемое вещество должно быть в кристаллической форме, а мембранные белки, извлеченные из своего окружения, либо плохо кристаллизуются, либо вообще теряют форму. Тогда он переключился на электронную микроскопию.

Был выбран конкретный белок - бактериородопсин - и было решено не извлекать его из мембраны, а исследовать прямо в ней. Ученые дополнительно покрывали образцы раствором глюкозы, чтобы защитить его от высыхания в вакууме. Это помогло решить проблему с сохранением структуры. Затем Хендерсон с коллегами столкнулись с уже описанной проблемой разрушения образцов под действием пучка электронов. Ее помогло решить сочетание нескольких факторов.

Во-первых, бактериородопсин располагается в мембране регулярно, поэтому аккуратный учет этой регулярности в сочетании со съемкой под разными углами сильно помогает при построении картинки. Это помогло снизить интенсивность пучка и сократить время экспозиции, но выиграть в качестве. Уже в 1975 году удалось получить изображение этого белка с разрешением 7 ангстрем (рис. 3, см. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy).

Во-вторых, у Хендерсона была возможность ездить по разным научным центрам и пробовать разные электронные микроскопы. Поскольку в те годы не было унификации, у разных микроскопов были свои достоинства и недостатки: разная степень вакуумирования камеры, разная степень охлаждения образца (это позволяет снизить ущерб от облучения электронами), разные энергии электронных пучков, разная чувствительность детекторов. Поэтому возможность исследования одного и того же объекта на разных микроскопах позволила сначала подобрать «наименее неблагоприятные» условия получения изображения, а потом постепенно их улучшать. Так Хендерсон накапливал данные и получал все более и более точную структуру бактериородопсина. В 1990 году вышла его статья, в которой была представлена модель этого белка с атомарным разрешением (R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy).

В ходе этого пионерского исследования Хендерсон показал, что криоэлектронная микроскопия может давать изображения с разрешением, которое не хуже, чем у метода рентгеноструктурного анализа - в то время это было прорывом. Правда, этот результат существенно использовал тот факт, что бактериородопсин регулярно располагается в клеточной мембране, и не было понятно, можно ли будет добиться такого разрешения для других, «нерегулярных» молекул.

Проблему обработки слабых сигналов от беспорядочно расположенных биологически активных молекул решил другой лауреат Нобелевской премии 2017 года - Йоахим Франк. Его главный вклад в криоэлектронную микроскопию состоит в создании алгоритмов анализа двумерных изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии, которые позволяют построить качественную трехмерную модель. Подобные алгоритмы уже были разработаны для других методов микроскопии. Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить полезную информацию, полученной в ходе электронной микроскопии, от сигналов, обусловленных шумом. Шумы возникают в точных электронных приборах по разным причинам: случайные колебания силы тока и напряжения могут быть из-за неравномерного испускания электронов в электровакуумных блоках, неравномерности процессов образования и рекомбинации носителей заряда (электронов проводимости и дырок) в полупроводниковых блоках, теплового движения носителей тока в проводниках (тепловой шум), либо внешних наводок (несмотря на то, что все обычно хорошо заизолировано).

Задача усложняется еще и вот чем. Если объекты, пусть даже и одинаковые или примерно одинаковые, как должно быть в подобных исследованиях, неупорядоченны, то они дают немного разные по структуре сигналы, которые могут размывать друг друга. Причем причину такого размытия - шум это или ошибки алгоритма - определить непросто. Схематично принцип обработки данных показан на рис. 5: многочисленные плоские изображения исследуемой молекулы очищаются от шумов и типизируются по «ракурсам», затем из изображений с близкими ракурсами строится более качественный профиль, и, наконец, из этих профилей строится трехмерная модель.

В 1981 году Франк обобщил математические модели в первой версии компьютерной программы SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields - Система для обработки данных электронной микроскопии и связанных областей, первая публикация: J. Frank et al., 1981. Spider - A modular software system for electron image processing). Этот программный пакет существует и обновляется до сих пор, более того, эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу ученых во всем мире. Франк использовал собственные алгоритмы для получения изображения поверхности рибосомы - состоящего из нитей РНК и связанных с нею белков органоида клетки, служащего для биосинтеза белка из аминокислот на основе генетической информации.

Приставка «крио-» появилась в электронной микроскопии благодаря третьему лауреату - Жаку Дюбоше. Он разработал метод быстрого охлаждения водных растворов с образцами (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrification of pure water for electron microscopy). Причем вода должна замерзнуть так быстро, чтобы молекулы не успели выстроиться в кристаллическую решетку, застывая как попало (см. аморфный лед). Это достигается путем быстрого погружения тонкой пленки раствора с образцом в емкость с жидким этаном, охлажденным до –160°С (рис. 6). Правильный способ заморозки можно назвать ключом к успеху всего метода, так как упорядоченные кристаллы льда могут вызывать дифракцию электронов, искажая информацию об изучаемых молекулах. Из-за большой молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот эти молекулы неповоротливы, так что при мгновенной заморозке они не успевают ни изменить свое положение, ни поменять форму. То есть строение биологически активных молекул при быстрой заморозке этим методом не меняется. Пользуясь им, Дюбоше впервые применил криоэлектронную микроскопию для изучения строения вирусов (рис. 7, см. M. Adrian et al., 1984. Cryo-electron microscopy of viruses).

В течение 1990-х и 2000-х годов криоэлектронная микроскопия постепенно развивалась и совершенствовалась с развитием вычислительных мощностей и точности приборов. Но настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии начинается с 2012 года. Он связан с появлением прямых электронных детекторов на основе КМОП (CMOS), которые могут напрямую улавливать электроны, прошедшие сквозь образец. Это позволило упростить конструкцию электронных микроскопов, убрав сложные системы фокусировки и преобразования сигнала и уменьшив число узлов, которые могут внести случайный шум. В результате разрешающая способность метода криоэлектронной микроскопии повысилась до 2–3 ангстрем (рис. 8).

Одним из примеров практического применения криоэлектронной микроскопии в этой области можно считать изучение вируса Зика (рис. 10). Во время вспышки эпидемии Зика в Бразилии в 2016 году исследователям хватило несколько месяцев для получения информации о строении вируса методом криоэлектронной микроскопии (D. Sirohi et al., 2016. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus).

Другой пример - в этом году криоэлектронная микроскопия позволила получить структуру капсида самого большого представителя семейства вирусов герпеса - цитомегаловируса человека (X. Yu et al., 2017. Atomic structure of the human cytomegalovirus capsid with its securing tegument layer of pp150). Результаты исследования стали основой для поиска возможных участков капсида вирусов, которые могут стать молекулярными мишенями для противовирусных лекарств.

Аркадий Курамшин

Доброй традицией Нобелевского комитета становится признание значимости методик, позволяющих «разглядеть» отдельные атомы: в 2014 году отметили сверхразрешающую микроскопию , а 4 октября 2017 года Нобелевскую премию по химии присудили «за разработку метода криоэлектронной микроскопии». Лауреатами стали трое исследователей: Жак Дюбоше из Университета Лозанны, Йохим Франк из Колумбийского университета в Нью-Йорке и Ричард Хендерсон из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. Заморозка биомолекул в движении позволяет получать их изображения в высоком разрешении, а методики компьютерной реконструкции дают пространственную структуру с точностью до атома. Исследование, начатое еще в 1970-е годы, все лучше и лучше позволяет оценивать архитектуру биоорганических комплексов.

Люди, регулярно читающие статьи в топовых научных журналах, давно уже привыкли к многочисленным молекулярным изображениям. Но микроскопы не позволяют увидеть отдельные молекулы . Правда, существует микроскопия сверхразрешения, за которую в 2014 году дали Нобелевскую премию по химии , но и она не позволяет «разглядеть» отдельные атомы. Изучать строение биологических молекул с такой подробностью - удел структурной биологии , лидирующими методиками которой до недавнего времени считались рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Интересным методом также является атомно-силовая микроскопия , но герой нашего сегодняшнего рассказа другой: это криоэлектронная микроскопия , за разработку которой вручена Нобелевская премия по химии уже этого, 2017 года .

Визуализация сложных структур, прежде считавшихся «невидимыми» ввиду их малых размеров, позволила совершить множество фундаментальных прорывов. Один из них - прогресс в борьбе с вирусом Зика , (рис. 1), недавно вызвавшим пандемию одноименной болезни. Благодаря криоэлектронной микроскопии, в последние пять лет все более прочно входящей в «большую тройку» методов структурной биологии, удалось получить трехмерную модель этого коварного агента. Что, в свою очередь, положило начало поиску потенциальных мишеней для лекарственных веществ, способных справиться с болезнью.

Рисунок 1. Примеры некоторых белковых комплексов. а - Белковый комплекс, регулирующий циркадный ритм. б - Комплекс звукового сенсора уха, считывающий изменения давления и позволяющий нам слышать. в - Модель вируса Зика.

Краткий экскурс в историю микроскопии до 1975 года

Всю первую половину 20 века три самых известных биологических структуры - ДНК, РНК и белок - оставались белым пятном на карте биохимического мира. Было известно, что они есть в организме и играют важную роль в жизни клеток, но каково их строение - никто не имел ни малейшего понятия. Лишь в начале 1950-х годов знаменитая группа ученых из Кембриджа, включавшая Френсиса Крика, Джеймса Уотсона, Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин, впервые попробовала облучать ДНК рентгеновскими лучами, что привело к открытию прославленной двойной спирали.

К кристаллографам относился поначалу и Ричард Хендерсон , получивший за свои ранние исследования пусть не Нобелевскую премию, но докторскую степень. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, что помогает идентифицировать структуру молекулы. Но в то время он был еще далек от совершенства, хотя сегодня это один из основных способов изучения структуры вещества . Шагнув на 30 лет вперед, мы узнаем, что наука получила еще один способ расшифровывать строение биомолекул: в 1980-х годах для изучения структуры и динамики белков в растворе начали применять метод ядерного магнитного резонанса (и применяют до сих пор ).

Благодаря этим двум методам удалось накопить внушительные объемы информации по строению биологических молекул: на сегодня в базе PDB находится более 100 тыс. структур. Но, как это часто бывает, и у того, и у другого метода есть свои недостатки. Так, с помощью ЯМР можно визуализировать только белки, находящиеся в растворе, и размер их должен быть небольшим. А минус рентгеновской кристаллографии считывается в названии метода: он работает на стабильных структурах типа кристаллов, но не на динамических «живых» молекулах. Изображения, полученные с помощью этого метода, напоминают снимки первых в истории фотокамер: черно-белые и застывшие, не несущие в себе информации о подвижной структуре белка. Эта проблема заставила Ричарда Хендерсона бросить рентгеновскую кристаллографию в 1970-х, что и стало отправной точкой на его пути к Нобелевской премии 2017 года.

Шаг первый: бактериородопсин под прицелом электронного пучка

Хендерсона с самого начала интересовали мембранные белки. Почему же их визуализация оказалась неподвластна рентгеновскому методу на тот момент? Неудачи возникали при попытках кристаллизовать белок, тем самым нарушая его естественное состояние в липидной мембране клетки. Мембранные белки крайне трудно извлекать из мембраны, не нарушая их нативного состояния : очень часто они просто «слипаются» в единую массу, неподвластную дальнейшему изучению. Впрочем, сейчас и в кристаллизации мембранных белков есть большой прогресс: мембрану просто научились делать частью кристалла .

После ряда неудачных попыток Ричард Хендерсон обратился к единственному, казалось, реальному варианту: электронной микроскопии. В чем принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического? В просвечивающей электронной микроскопии (так называется эта техника) вместо пучка света к образцу посылается луч электронов. Длина волны электронов намного меньше, чем длина волны света, поэтому с помощью электронного микроскопа можно визуализировать даже очень маленькие структуры - вплоть до уровня отдельных атомов.

В теории электронный микроскоп идеально подходил для исследований Ричарда Хендерсона - ведь он позволял получить изображения мембранных белков на атомном уровне. Но на практике эта идея казалась нереальной. Со времен изобретения электронного микроскопа считалось, что с помощью этого метода можно изучать исключительно неживую материю. Виной тому электронный пучок: он позволяет получать картинки с высоким разрешением, но фактически «сжигает» на своем пути живые структуры. Если же снизить его интенсивность, то изображение теряет контраст и получается нечетким.

Дополнительной преградой на пути визуализации биомолекул под электронным микроскопом является необходимость создания вакуума. При выкачивании воздуха из биологического образца испаряется и вода, обволакивающая живые структуры, из-за чего они теряют свою естественную форму. Таким образом, все обстоятельства выступали против Хендерсона. Однако его идею спас особый белок, обладающий исключительной стабильностью в мембране - бактериородопсин.

В 1991 году Йоахим Франк «заморозил» рибосомы по методу Дюбоше, получив на выходе изображение их трехмерной структуры. И, несмотря на то, что картинка была сделана в небывалом для электронной микроскопии разрешении, исследователям удалось показать лишь очертания рибосомы. Странные каплевидные структуры все еще не выдерживали сравнения с атомным разрешением рентгеновской кристаллографии. Криоэлектронная микроскопия позволяла визуализировать лишь неверные контуры электронной плотности, напоминающие пузыри, из-за чего этот метод в шутку называли «блобология» (blobology ) . Но прогресс идет вперед, и после 2010 года получил распространение новый тип электронного детектора - Direct Electron Detector , позволяющий получать гораздо более детальное изображение биологических структур .

Сегодня криоэлектронная микроскопия позволяет «ловить» биологические структуры «в динамике» на разных этапах. Совмещая полученные снимки, исследователям удается создавать целые фильмы, демонстрирующие перемещения и взаимодействия белков с другими молекулами. За последние пять лет чуть ли не каждая вторая молекулярная структура, опубликованная в журналах уровня Science и Nature , криомикроскопическая: это и новые состояния рибосомы , и АТФазы , и различные рецепторы , и филаменты загадочного тау-пептида , и инфламмосома , и термочувствительный ионный канал TRPV1 , и многое другое. И это только начало: ученым еще предстоит определить точную структуру и механизм работы множества белков и других сложных биологических структур.

Литература

1. 12 методов в картинках: микроскопия ;
2. По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;
3. 12 методов в картинках: структурная биология ;
4. Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись ;
5. Fernholm A. (2017).

Нобелевскую премию по химии 2017 года присудили за разработку криоэлектронной микроскопии - метода изучения материи с помощью сверхбыстрого замораживания. Награду в 9 млн шведских крон разделят швейцарец Жак Дюбоше, американец Йоахим Франк и британец Ричард Хендерсон. Их разработка позволяет определять структуру белковых комплексов, сложных рецепторов и других соединений, которые невозможно изучать методом кристаллографии и спектроскопии, говорят эксперты.

Швейцарец Жак Дюбоше, американец Йоахим Франк и британец Ричард Хендерсон получат Нобелевскую премию по химии за разработку технологии криоэлектронного микроскопа для определения структуры высокомолекулярных биомолекул в растворе. Подобный микроскоп, говорится в коммюнике Нобелевского комитета , позволяет рассмотреть объекты после их быстрой заморозки, благодаря которой сохраняется естественная форма атомов в молекуле.

Ранее через электронные микроскопы изучали только неорганические соединения и неживую материю, так как мощные электронные лучи этого устройства разрушают биологический материал. В 1990 году Ричарду Хендерсону удалось применить микроскоп для создания 3D-изображения белка на атомном уровне. Йоахим Франк разработал эту технологию более тщательно: с 1975 по 1986 год он работал над тем, чтобы сделать изображение атомов более четким. Наконец, Жак Дюбоше смог найти применение воде в электронной микроскопии. Он использовал технологию «остекления»: быстро охлаждал воду вокруг биологического образца, позволяя молекулам сохранять свою естественную форму. Открытый нынешними лауреатами метод позволяет определять структуру белковых соединений.

«Этот метод сейчас находится на острие науки»,- заявил заведующий лабораторией электронной микроскопии Курчатовского института Александр Васильев. Научный сотрудник Института биоорганической химии РАН Алексей Пахомов пояснил, что благодаря открытому нобелевскими лауреатами методу ученые могут работать с белковыми комплексами, сложными рецепторами, мультибелковыми соединениями и другими материалами, которые невозможно изучать методом кристаллографии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). «Это очень мощный метод, который позволяет получить структуру отдельных молекул с очень высоким разрешением, причем в их естественном состоянии, а не в кристалле,- пояснил телеканалу "Россия 24" господин Пахомов.- За ЯМР премию уже дали , криомикроскопия отмечена совершенно справедливо».

Заведующий отделом электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии МГУ Игорь Киреев также говорит, что с помощью данного метода можно исследовать биологические структуры «в состоянии, близком к прижизненному». Технология сверхбыстрого замораживания, по его словам, оставляет образцы «в водной среде, как будто бы они внутри клетки». «В то же время они становятся твердыми, что позволяет, если речь идет о тканях или клетках, изготовить срезы для электронного микроскопа»,- пояснил господин Киреев. По словам ученого, подобная технология позволяет изучать образцы в высоком разрешении вплоть до отдельных атомов в молекулах. «Можно поймать какие-то реакции, которые происходят с белками»,- добавил господин Васильев. Игорь Киреев считает, что в России есть лишь несколько подобных новейших микроскопов, например в Курчатовском институте, так как это оборудование «весьма дорогостоящее».

Старший научный сотрудник Института биоорганической химии РАН Константин Минеев отметил, что в области науки, которая занимается белками, «это абсолютно заслуженная награда». «Белки - это то, что выполняет основную работу у нас в организме, они работают, как маленькие машины,- говорит ученый.- Если мы понимаем, как они работают, знаем их структуру, мы можем их менять, останавливать, и, соответственно, искать лекарства, моделируя и анализируя данные. Тогда мы можем подобрать лекарство не случайным образом и методом "тыка". Этот подход называется рациональным дизайном лекарств».

«Это как будто бы обычный электронный микроскоп, но с очень высоким разрешением и дополненный алгоритмами компьютерной обработки изображений: изображения больших молекулярных комплексов накапливаются в количестве нескольких сотен тысяч с разных ракурсов, что позволяет сделать 3D-реконструкцию такого высокого качества, что удается вписать туда даже отдельные атомы,- пояснил “Ъ”, как ученые используют криоэлектронную микроскопию, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Института биоорганической химии РАН Антон Чугунов.- Сам метод не дает такого высокого разрешения, но его применение совместно с компьютерными алгоритмами это позволяет». Он отметил, что около пяти лет назад этот метод не пользовался популярностью, так как получаемое разрешение было достаточно низким, а данные было трудно использовать в работе: они не подходили для компьютерного моделирования и драг-дизайна (создания лекарств): «Но в последние пять лет произошел очень большой рывок, разрешение было улучшено».

До криоэлектронной микроскопии основным лидером для структурных исследования в биологии был рентгеноструктурный анализ, еще одним методом исследования веществ на молекулярном уровне является ядерно-магнитно резонанс. «Но у каждого из них есть свои минусы,- объясняет ученый.- ЯМР не берет большие комплексы молекул, рентгеновская кристаллография требует кристаллизации молекул, а чем молекула больше, тем это сложнее.

И вот тут вот пришла криомикроскопия, которая как раз очень хорошо работает на больших комплексах - это несколько, 5-10, больших белков, они сложно соединены, у них сложная пространственная форма, что являлось ограничивающим фактором для всех остальных методов».

При этом господин Чугунов отметил, что криоэлектронную микроскопию сложно использовать для малых комплексов молекул: «Поэтому теперь эти методы работают вместе, и это очень удачно». Эксперт отметил, что криоэлектронная микроскопия широко используется в мире, однако в России «это пока не особо распространенный метод».

Один из лауреатов, Йоахим Франк, заявил, что потрясен присуждением награды. При этом он отметил, что метод криоэлектронной микроскопии найдет практическое применение лишь со временем. «Всегда требуется время на то, чтобы увидеть прямые практические возможности»,- сказал господин Франк.

Премия по химии присуждалась сегодня в 109-й раз. В нынешнем году Нобелевский фонд впервые с 2001 года увеличил размер выплат лауреатам премии с 8 млн до 9 млн шведских крон ($1,12 млн). Напомним, в 2016 году награду по химии присудили Жан-Пьеру Саважу, Фрезеру Стоддарту и Бернарду Феринге за разработку «молекулярных машин» - микроскопических устройств, занимающихся перемещениями молекул или их комплексов. Эти устройства планируется использовать в различных сенсорах в медицине.

5 октября объявят нобелевских лауреатов по литературе, 6 октября будет присуждена Нобелевская премия мира. 9 октября назовут лауреата премии Шведского национального банка по экономическим наукам памяти Альфреда Нобеля (неофициально называемой «Нобелевской премией по экономике»).

Александр Воронов, Валерия Мишина