Стерилизации и других микробиологических целей. Методы и способы стерилизации Механический метод стерилизации

Действие температуры на микроорганизмы.

Температура – важный фактор, влияющий на жизнедеятельность микроорганизмов. Для микроорганизмов различают минимальную, оптимальную и максимальную температуру. Оптимальная – температура, при которой происходит наиболее интенсивное размножение микробов. Минимальная – температура, ниже которой микроорганизмы не проявляют жизнедеятельности. Максимальная – температура, выше которой наступает гибель микроорганизмов.

По отношению к температуре различают 3 группы микроорганизмов:

2. Мезофилы. Оптимум – 30-37°С . Минимум – 15-20°С. Максимум – 43-45°С. Обитают в организме теплокровных животных. К ним относятся большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

3. Термофилы. Оптимум – 50-60°С. Минимум - 45°С. Максимум - 75°С . Обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна. Они не способны размножаться в организме теплокровных животных, поэтому не имеют медицинского значения.

Благоприятное действие оптимальной температуры используется при выращивании микроорганизмов с целью лабораторной диагностики, приготовления вакцин и других препаратов.

Тормозящее действие низких температур используется при хранении продуктов и культур микроорганизмов в условиях холодильника. Низкая температура приостанавливает гнилостные и бродильные процессы. Механизм действия низких температур – затормаживание в клетке процессов метаболизма и переход в состояние анабиоза.

Губительное действие высокой температуры (выше максимальной) используетсяпри стерилизации . Механизм действия – денатурация белка (ферментов), повреждение рибосом, нарушение осмотического барьера. Наиболее чувствительны к действию высокой температуры психрофилы и мезофилы. Особую устойчивость проявляют споры бактерий.

Действие лучистой энергии и ультразвука на микроорганизмы.

Различают неионизирующее (ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света) и ионизирующее излучение (g-лучи и электроны высоких энергий).

Ионизирующее излучение обладает мощным проникающим действием и повреждает клеточный геном. Механизм повреждающего действия: ионизация макромолекул, что сопровождается развитием мутаций или гибелью клетки. При этом летальные дозы для микроорганизмов выше, чем для животных и растений.

Механизм повреждающего действия УФ-лучей : образование димеров тимина в молекуле ДНК , что прекращает деление клеток и служит основной причиной их гибели. Повреждающее действие УФ-лучей в большей мере выражено для микроорганизмов, чем для животных и растений.

Ультразвук (звуковые волны 20 тыс. гц)обладает бактерицидным действием. Механизм: образование в цитоплазме клетки кавитационных полостей , которые заполняются парами жидкости и в них возникает давление до 10 тыс. атм. Это приводит к образованию высокореактивных гидроксильных радикалов, к разрушению клеточных структур и деполимеризации органелл, денатурации молекул.

Ионизирующее излучение, УФ-лучи и ультразвук используются для стерилизации.

Действие высушивания на микроорганизмы.

Вода необходима для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов. Снижение влажности среды приводит к переходу клеток в состояние покоя, а затем и к гибели. Механизм губительного действия высушивания: обезвоживание цитоплазмы и денатурация белков.

Более чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы: возбудители гонореи, менингита, брюшного тифа, дизентерии, сифилиса и др. Более устойчивы споры бактерий, цисты простейших, бактерии, защищенные слизью мокроты (туберкулезные палочки).

В практике высушивание используется для консервирования мяса, рыбы, овощей, фруктов, при заготовке лекарственных трав .

Высушивание из замороженного состояния под вакуумом – лиофилизация или лиофильная сушка. Ее используют для сохранения культур микроорганизмов, которые в таком состоянии годами (10-20 лет) не теряют жизнеспособности и не меняют свойств. Микроорганизмы находятся при этом в состоянии анабиоза. Лиофилизация используется в производстве препаратов из живых микроорганизмов: эубиотиков, фагов, живых вакцин против туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, гриппа и др.

Действие химических факторов на микроорганизмы.

Химические вещества по-разному влияют на микроорганизмы. Это зависит от природы, концентрации и времени действия химических веществ. Они могут стимулировать рост (используются как источники энергии), оказывать микробицидное, микробостатическое , мутагенное действие или могут быть безразличными для процессов жизнедеятельности

Например: 0,5-2% раствор глюкозы – источник питания для микробов, а 20-40% раствор оказывает угнетающее действие.

Для микроорганизмов необходимо оптимальное значение рН среды . Для большинства симбионтов и возбудителей заболеваний человека – нейтральная, слабощелочная или слабокислая среда. При росте рН сдвигается чаще в кислую сторону, рост микроорганизмов при этом приостанавливается. А затем наступает гибель. Механизм: денатурация ферментов гидроксильными ионами, нарушение осмотического барьера клеточной мембраны.

Химические вещества, которые обладают противомикробным действием, используются для дезинфекции, стерилизации и консервации.

Действие биологических факторов на микроорганизмы.

Биологические факторы – это различные формы влияния микробов друг на друга, а также действие на микроорганизмы факторов иммунитета (лизоцим, антитела, ингибиторы, фагоцитоз) во время их пребывания в макроорганизме. Совместное существование различных организмов – симбиоз . Выделяют следующие формы симбиоза.

Мутуализм – такая форма сожительства, когда оба партнера получают взаимную выгоду (например, клубеньковые бактерии и бобовые растения).

Антагонизм – форма взаимоотношений, когда один организм наносит вред (вплоть до гибели) другому организму своими продуктами метаболизма (кислоты, антибиотики, бактериоцины), благодаря лучшей приспособленности к условиям среды, путем непосредственного уничтожения (например, нормальная микрофлора кишечника и возбудители кишечных инфекций).

Метабиоз – форма сожительства, когда один организм продолжает процесс, вызванный другим (использует его продукты жизнедеятельности), и освобождает среду от этих продуктов. Поэтому создаются условия для дальнейшего развития (нитрифицирующие и аммонифицирующие бактерии).

Сателлизм – один из сожителей стимулирует рост другого (например, дрожжи и сарцины вырабатывают вещества, способствующие росту других, более требовательных к питательным средам, бактерий).

Комменсализм – один организм живет за счет другого (извлекает выгоду), не причиняя ему вреда (например, кишечная палочка и организм человека).

Хищничество – антагонистические взаимоотношения между организмами, когда один захватывает, поглощает и переваривает другой (например, кишечная амеба питается кишечными бактериями).

Стерилизация.

Стерилизация – это процесс полного уничтожения в объекте всех жизнеспособных форм микробов, в том числе спор.

Различают 3 группы методов стерилизации: физические, химические и физико-химические. Физические методы: стерилизация высокой температурой, Уф облучением, ионизирующим облучением, ультразвуком, фильтрованием через стерильные фильтры. Химические методы – использование химических веществ, а также газовая стерилизация. Физико-химические методы – совместное использование физических и химических методов. Например, высокая температура и антисептики.

Стерилизация высокой температурой.

К этому методу относятся: 1) стерилизация сухим жаром ; 2) стерилизация паром под давлением ; 3) стерилизация текучим паром ; 4) тиндализация и пастеризация ; 5) прокаливание ; 6) кипячение .

Стерилизация сухим жаром.

Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165-170°С воздуха в течение 45 мин.

Аппаратура: сухожаровой шкаф (печь Пастера) . Печь Пастера – металлический шкаф с двойными стенками, обшитый снаружи материалом, плохо проводящим тепло (асбест). Нагретый воздух циркулирует в пространстве между стенками и выходит наружу через специальные отверстия. При работе необходимо строго следить за нужной температурой и временем стерилизации. Если температура будет более высокой, то произойдет обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется более длительная стерилизации. По окончании стерилизации шкаф открывают только после его остывания, иначе стеклянная посуда может потрескаться из-за резкой смены температуры.

а) стеклянные, металлические, фарфоровые предметы, посуда, завернутые в бумагу и закрытые ватно-марлевыми пробками для сохранения стерильности (165-170°С, 45 мин);

б) термостойкие порошкообразные лекарственные средства - тальк, белая глина, окись цинка (180-200°С, 30-60 мин);

в) минеральные и растительные масла, жиры, ланолин, вазелин, воск (180-200°С, 20-40 мин).

Стерилизация паром под давлением.

Наиболее эффективный и широко применяемый в микробиологической и клинической практике метод.

Метод основан на гидролизующем действии пара под давлением на белки микробной клетки. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает высокую эффективность этой стерилизации, при которой погибают самые стойкие споровые бактерии.

Аппаратура – автоклав. Автоклав состоит из 2-х металлических цилиндров, вставленных друг в друга с герметически закрывающейся крышкой, завинчивающейся винтами. Наружный котел – водопаровая камера, внутренний – стерилизационная камера. Имеется манометр, паровыпускной кран, предохранительный клапан, водомерное стекло. В верхней части стерилизационной камеры – отверстие, через которое пар проходит из водопаровой камеры. Манометр служит для определения давления в стерилизационной камере. Между давлением и температурой существует определенная зависимость: 0,5 атм - 112°С, 1-01,1 атм – 119-121°С, 2 атм - 134°С. Предохранительный клапан – для защиты от чрезмерного давления. При повышении давления выше заданного, клапан открывается и выпускает лишний пар. Порядок работы. В автоклав наливают воду, уровень которой контролируют по водомерному стеклу. В стерилизационную камеру помещают материал и плотно завинчивают крышку. Паровыпускной кран открыт. Включают нагрев. После закипания воды кран закрывают лишь тогда, когда будет вытеснен весь воздух (пар идет непрерывной сильной сухой струей). Если кран закрыть раньше, показания манометра не будут соответствовать нужной температуре. После закрытия крана, в котле постепенно повышается давление. Начало стерилизации – тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. По истечении срока стерилизации прекращают нагрев и охлаждают автоклав до возвращения стрелки манометра к 0. Если выпустить пар раньше, жидкость может вскипеть из-за быстрой смены давления и вытолкнуть пробки (стерильность нарушается). Когда стрелка манометра вернется к 0, осторожно открывают паровыпускной кран, спускают пар и затем вынимают стерилизуемые объекты. Если не выпустить пар после возвращения стрелки к 0, вода может конденсироваться и смочить пробки и стерилизуемый материал (стерильность нарушится).

Материал и режим стерилизации:

а) стеклянная, металлическая, фарфоровая посуда, белье, резиновые и корковые пробки, изделия из резины, целлюлозы, древесины, перевязочный материал (вата, марля) (119 - 121°С, 20-40 мин));

б) физиологический раствор, растворы для инъекций, глазные капли, дистиллированная вода, простые питательные среды - МПБ, МПА(119-121°С, 20-40 мин);

в) минеральные, растительные масла в герметически закрытых сосудах (119-121°С, 120 мин);

Стерилизация текучим паром.

Метод основан на бактерицидном действии пара (100°С) в отношении только вегетативных клеток.

Аппаратура – автоклав с незавинченной крышкой или аппарат Коха .

Аппарат Коха - это металлический цилиндр с двойным дном, пространство в котором на 2/3 заполнено водой. В крышке – отверстия для термометра и для выхода пара. Наружная стенка облицована материалом, плохо проводящим тепло (линолеум, асбест). Начало стерилизации – время от закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру.

Материал и режим стерилизации. Этим методом стерилизуют материал, который не выдерживает температуру выше 100°С : питательные среды с витаминами, углеводами (среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина), желатином, молоко.

При 100°С споры не погибают, поэтому стерилизацию проводят несколько раз - дробная стерилизация - 20-30 мин ежедневно в течение 3-х дней.

В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для того, чтобы проросли споры в вегетативные формы. Они будут погибать при последующем нагревании при 100°С.

Тиндализация и пастеризация.

Тиндализация - метод дробной стерилизации при температуре ниже 100°С. Она используются для стерилизации объектов, которые не выдерживают 100°С: сыворотка, асцитическая жидкость, витамины . Тиндализация проводится в водяной бане при 56°С по 1 часу 5-6 дней.

Пастеризация - частичная стерилизация (споры не погибают), которая проводится при относительно низкой температуре однократно. Пастеризацию проводят при 70-80°С, 5-10 мин или при 50-60°С, 15-30 мин. Пастеризация используется для объектов, теряющих свои качества при высокой температуре.Пастеризацию, например, используют для некоторых пищевых продуктов: молока, вина, пива . При этом не повреждается их товарная ценность, но споры остаются жизнеспособными, поэтому эти продукты нужно хранить на холоде.

С помощью физических и химических факторов.

К физическим факторам стерилизации относятся высокая температура, ультрафиолетовые лучи, ионизирующие излучения, и через бактериальные фильтры.

В лабораторной практике стерилизация с помощью высокой температуры достигается прокаливанием на пламени, прогреванием сухим жаром, кипячением, обработкой текучим паром или паром под давлением.

Рис. 1. Горелка Бунзена. Рис. 2. Горелка Теклю. Рис. 3. Распределение температуры в пламени горелки.

Рис. 4. Сушильный шкаф.

Рис. 5. Водяные бани: 1 - с постоянным притоком воды; 2 - цилиндрическая; 3 - круглодонная. Рис. 6. Текучепаровой стерилизатор.

Стерилизация на пламени является простым и надежным методом для обработки различных термоустойчивых объектов: игл, бактериальных петель, микробиологических шпателей, пипеток, предметных и покровных стекол, пинцетов и т. п. Для этой цели широко пользуются газовыми горелками системы Бунзена (рис. 1) или Теклю (рис. 2). Горелка Бунзена снабжена подвижной обоймой, перемещая которую можно регулировать доступ воздуха. В горелке Теклю количество поступающего воздуха регулируется перемещением диска (рис. 2,1), количество газа - винтом (рис. 2, 2). При отсутствии или недостаточном доступе воздуха образуется коптящее пламя. Доступ воздуха в горелку регулируют до получения синего пламени. Примерное распределение температуры в пламени горелки представлено на рис. 3.

Стерилизация сухим жаром производят в сушильном шкафу (печь Пастера). Этим методом стерилизуют только сухие предметы - лабораторную посуду, и т. п. Сушильный шкаф (рис. 4) представляет собой небольшой железный шкаф, с двойными стенками, между которыми вложен теплоизоляционный материал (асбест, стекловата). Чисто вымытые пробирки и флаконы закупоривают ватными пробками; пипетки, вату, марлю заворачивают в бумагу и помещают на полки шкафа так, чтобы стерилизуемые предметы не касались горячих стенок прибора и нагретый воздух свободно проникал между ними. Стерилизация в сушильном шкафу продолжается 45 минут - 1 час при t° 160-170°, При температуре выше 175° бумага и вата сгорают.

Кипячение в воде уничтожает неспоровые формы микробов за 1-3 мин. , иглы, ножи, небольшие инструменты и т. п. можно кипятить в металлических стерилизаторах и даже в обычной кастрюле. Прибавление к воде небольшого количества гидрокарбоната натрия (двууглекислой

В лабораторной практике при работе с микроорганизмами приходится постоянно принимать меры, чтобы посуда, питательные среды, металлические инструменты, используемые во время работы, не содержали микробов. Для этой цели применяют следующие методы стерилизации:

Стерилизацию перегретым паром под давлением;

Стерилизацию текучим паром;

Стерилизацию горячим воздухом;

Дезинфекцию.

Наилучшим способом стерилизации является обработка различных объектов перегретым паром в специальных аппаратах - автоклавах.

Автоклав и стерилизация перегретым паром под давлением

Автоклавы - это металлические (стальные, чугунные или медные) котлы с двойными стенками и массивной крышкой, герметически закрывающейся с помощью болтов и резиновой прокладки. В зависимости от системы обогрева автоклавы бывают паровые, электрические и огневые (рис. 42). Получение в автоклаве высокого давления и перегретого пара температурой 115-120°С позволяет в течение 20-30 мин уничтожить как вегетативные клетки, так и споры микробов.

В автоклаве стерилизуют все те предметы, которые не портятся при высокой температуре: различные жидкости (воду, питательные среды, не содержащие углеводных компонентов), стеклянную посуду, металлические инструменты, вату, марлю, бумагу и пр.

В тех случаях, когда некоторые вещества не выдерживают нормального режима стерилизации в автоклаве (в частности, питательные среды, содержащие сахара), их стерилизуют в автоклаве при температуре 112 °С в течение 20 мин, а также при более мягких режимах.

При высоких давлениях перегретого пара в автоклаве соответственно возрастает температура нагрева; это вызывает карамелизацию сахаров, добавляемых в некоторые питательные среды, в результате среды становятся непригодными для определения физиологических свойств микробов.

Измерение давления внутри автоклава производится с помощью манометра, вмонтированного в крышку или корпус автоклава. При чрезмерном возрастании давления автоматически срабатывает предохранительный клапан, расположенный в зависимости от конструкции либо на крышке, либо на боковой поверхности стенки автоклава. Струя пара, выходя со свистом из предохранительного клапана, предупреждает о необходимости прекращения нагрева. Если нагрев не прекратить, автоклав может взорваться.

В специальном кармашке на крышке автоклава иногда помещается термометр, с помощью которого измеряется температура стерилизации. Внутри автоклава имеется подставка, под которую наливается вода через трубку с воронкой, расположенную снаружи автоклава. Кроме того, автоклавы снабжаются краном для выпуска пара и воздуха и краном для выливания воды.

Правила обращения с автоклавом при стерилизации следующие: аппарат через воронку и трубку заполняют водой, уровень которой должен находиться ниже подставки. Предметы, подлежащие стерилизации, помещают в специальные металлические бюксы и загружают в автоклав. Крышку автоклава завинчивают.

Открыв кран для выхода пара и воздуха, начинают нагрев. Как только вода закипит, образующийся пар начинает вытеснять из автоклава воздух. Паровыпускной кран держат открытым до тех пор, пока из него сплошной струей не пойдет сухой пар. Это указывает на полное удаление воздуха из автоклава. Тогда кран закрывают. Пар, накапливающийся при дальнейшем нагревании все в большем и большем количестве, повышает давление в автоклаве, а вместе с тем и температуру. При работе с автоклавом можно руководствоваться таблицей соотношений между давлением пара и его температурой (табл. 4).

После того как стрелка манометра достигнет нужного показателя давления (температура в автоклаве при этом будет соответствовать принятой температуре стерилизации), регулируют нагрев автоклава так, чтобы давление держалось необходимое время на одном уровне. По окончании стерилизации прекращают нагревание. Когда температура в автоклаве понизится, а стрелка манометра опустится до нуля (давление в автоклаве сравняется с атмосферным), осторожно открывают паровыпускной кран, выпускают пар и, открыв крышку автоклава, вынимают материал. Открывать паровыпускной кран преждевременно, до падения давления в автоклаве, нельзя. Резкое понижение давления в камере автоклава вызовет бурное вскипание жидкостей, нагретых до более высоких температур, чем 100 °С, т.е. выше точки кипения при нормальном атмосферном давлении. Бурно вскипевшие жидкости будут смачивать или даже вытолкнут ватные пробки из сосудов - работа будет произведена впустую. Питательные среды будут портиться, так как на мокрых пробках легко развивается попадающая из воздуха микрофлора, проникает внутрь и заражает среды. Кроме того, открывать автоклав с повышенным давлением опасно для работника.

Однако как только стрелка манометра остановится на нуле, автоклав нужно открыть тотчас же, иначе конденсат начнет стекать на пробки и также вызовет их смачивание. Чтобы избежать смачивания пробок конденсационной водой, перед стерилизацией их закрывают бумагой.

Материалы, помещенные в автоклав, будут надежно простерилизованы за 20-30 мин, если температура поддерживается 120°С, что соответствует давлению в 2 ат (19,61 * 10000 н/м2) или по манометру в 1 ат сверх нормальной. Автоклав можно с успехом применять и для стерилизации сред текучим паром; в этом случае крышку автоклава не завинчивают.

Кипятильник Коха и стерилизация текучим паром

Кипятильник Коха представляет собой цилиндр из оцинкованной жести или меди с двойными стенками и конической крышкой в виде шлема (рис. 43). В крышке посредине имеется отверстие для термометра. Снаружи кипятильник Коха покрывают слоем теплоизолирующего материала: асбеста, линолеума и пр.

Внутри кипятильника помещена перегородка (подстава), разделяющая внутреннее пространство кипятильника на две секции: верхнюю и нижнюю. Нижняя секция заполняется водой, уровень которой устанавливается по водомерному стеклу: вода не должна покрывать верхней части подставы. В верхнюю секцию кипятильника в решетчатых ведерках, устанавливаемых одно на другое, помещают стерилизуемые предметы. Закрыв кипятильник крышкой, начинают нагревать в нем воду. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 98-100°С. При отсутствии термометра началом стерилизации считается момент, когда из отверстия в крышке кипятильника начнет энергично выходить пар. Таким образом, стерилизуемые предметы во время работы кипятильника будут все время находиться в струе текучего пара.

Метод стерилизации текучим паром благодаря его простоте и доступности широко распространен в лабораторной практике. Текучим паром стерилизуют главным образом питательные среды, у которых изменяются свойства при нагревании их выше 100°С: белковые, углеводные и желатиновые. Для этих сред метод стерилизации текучим паром наиболее приемлем.

Недостатком метода стерилизации текучим паром является его продолжительность, так как для полной стерилизации среды необходимо проводить многократное нагревание в кипятильнике в течение определенного времени - от 20 мин до 1,5 ч (в среднем 30-45 мин) в зависимости от объема жидкости с промежутками в 24 ч. Весь промежуток времени между нагреваниями среды рекомендуется выдерживать в термостате при 25-30 °С.

Однократное нагревание в кипятильнике Коха вызывает гибель лишь вегетативных микробных клеток, но споры при этом могут сохраниться. При выдерживании стерилизуемой питательной среды в благоприятных условиях (при комнатной температуре, а еще лучше в термостате) часть оставшихся спор прорастет и до следующего дня превратится в вегетативные клетки. Повторное нагревание вызовет гибель и этих вновь развившихся клеток. Наконец, третье нагревание через сутки выдерживания среды в термостате обеспечит полную стерильность. Такой метод получил название дробной стерилизации. В практической работе вместо стерилизации текучим паром в кипятильнике Коха часто применяют обычную стерилизацию в автоклавах при 112 °С с противодавлением 0,5 ат в течение 15-20 мин.

Сушильный шкаф и стерилизация горячим воздухом

В лабораторной практике для стерилизации микробиологической посуды необходимо иметь сушильный шкаф или так называемую печь Пастера. Принцип устройства сушильного шкафа и печи Пастера одинаков. Печи делаются только прямоугольной формы, а сушильные шкафы могут иметь не только прямоугольную, но и цилиндрическую форму (рис. 44 и 45). В этих аппаратах стерилизация осуществляется горячим воздухом (сухим жаром) при температуре 160 °С в течение 1 ч или при температуре 150 °С в течение 2 ч.

Как печи Пастера, так и сушильные шкафы - это полые внутри аппараты с двойными стенками, с двойными и плотно прикрывающимися дверцами. Снаружи для термоизоляции они покрываются слоем асбеста. Между стенками циркулирует горячий воздух, нагревание которого осуществляется либо электрическими спиралями, либо газовыми горелками. Внутри шкафа имеется несколько (обычно две или три) дырчатых полочек. В верхней части шкафа имеется два отверстия: одно предназначено для термометра, а второе служит для вентиляции. Наиболее удобны электрические сушильные шкафы.

В сушильных шкафах последней конструкции предусмотрены четыре ступени обогрева, которые могут быть включены в действие специальным регулятором, помещаемым на боковой стенке шкафа. Нужная степень обогрева достигается включением одной, двух, трех или всех четырех электрических спиралей, причем последовательность включения спиралей может быть любой.

В сушильных шкафах можно, кроме стеклянной посуды, стерилизовать марлю, вату, хотя все же лучше обрабатывать их в автоклаве, так как при температуре 160 °С они желтеют. Нельзя стерилизовать в сушильном шкафу резиновые изделия, так как они не выносят высокой температуры - становятся ломкими и портятся. Жидкости при 150-160 °С вскипают и меняют свой химический состав.

Чтобы избежать последующего заражения простерилизованных предметов микробами из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в бумагу. Чашки Петри завертываются в бумагу по 2 штуки таким образом, чтобы в обертке не было щелей. Стеклянные трубки и пипетки также заворачивают в бумагу, сначала каждую отдельно, а затем в пачки по 10-20 штук. Заворачивание трубок и пипеток должно быть исключительно аккуратным, полностью предохраняющим их внешнюю поверхность от сообщения с воздухом. Колбы, пробирки, бутылки перед стерилизацией горячим воздухом закрывают ватными пробками и бумажными колпачками.

Нельзя допускать в сушильном шкафу повышения температуры выше 170 °С, так как при такой температуре ватные пробки буреют, а бумажные обертки становятся ломкими и даже обугливаются. Началом стерилизации считается момент, когда термометр покажет 150-160 °С. По прошествии требуемого для стерилизации времени нагревание прекращают. Чтобы предохранить посуду от растрескивания, стерилизовать нужно только сухую посуду и шкаф открывать после стерилизации лишь тогда, когда температура в нем упадет до 50-70 °С. Мелкие лабораторные предметы, например платиновые петли, иглы, пинцеты, ножницы и пр., можно стерилизовать простым прокаливанием на пламени газовой горелки (или спиртовки).

Дезинфекция

К дезинфекции в микробиологической лаборатории приходится прибегать очень часто. Наиболее употребительные дезинфицирующие вещества следующие: 3-5%-ный раствор карболовой кислоты и растворы других высших фенолов, 50-70%-ный раствор этилового спирта, такой же концентрации бутиловый спирт, 4%-ный раствор формалина, 1-2%-ные растворы хлороформа и толуола, 0,5%-ный раствор хлорамина и др.

В микробиологических лабораториях консервных заводов дезинфицируют поверхности столов, посуду, полы, стены помещений. Для дезинфекции поверхности столов можно использовать не только растворы этилового спирта, но и растворы карболовой кислоты.

Дезинфекция канализационных устройств на консервных заводах и других пищевых предприятиях производится 5-10%-ным раствором хлорной извести. Для обеззараживания оборотной стеклянной тары на консервных заводах применяют хлорную воду, содержащую в 1 л не менее 100 мг активного хлора. Для приготовления такого раствора берут хлорную известь, смешивают ее с небольшим количеством воды до получения густой массы молочного цвета. Эту смесь добавляют к воде, тщательно размешивают и оставляют на сутки. Хлорная известь реагирует с образованием гидрата окиси кальция - Ca(OH)2 - и активного хлора. Ca(OH)2 оседает на дно, раствор над осадком после осветления получается прозрачным, зеленоватого цвета. Замачивание тары в таком растворе длится 10 мин. После хлорирования тара должна быть тщательно промыта в проточной воде.

Проведение 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов:

из исследуемого материала готовим фиксированный препарат, окраска по методу Грама, микроскопируем, проведим идентификацию обнаруженных микроорганизмов по морфо-тинкториальным свойствам.

Сеем исследуемый материал на половину чашки с плотной питательной средой мето­дом «штрих с площадкой» (материал наносим на поверхность, плотной питательной среды в чашке Петри на ограниченном участке, а затем распределяют путем посева частыми параллельными – штрихами)

подпишем чашки, указав дату посева, и ставим их вверх дном в термостат при темпе­ратуре 37° на 18-24 ч.

Паровой стерилизатор (автоклав) - стерилизация паром под давлением.

Наиболее надежным и универсальным методом стерилизации в медицинской и микробио­логической практике является стерилизация паром под давлением. Производят ее в автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают насыщенным паром под давлением выше атмосферно­го. Между показаниями манометра и температурой насыщенного пара имеется следующая зави­симость

Нулевым давлением считают нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.).

Стерилизация достигается только при полной исправности автоклава и правильной его эксплуатации специально обученным персоналом Поэтому необходим постоянный контроль за режимом стерилизации, который производится физическим (термометр максимальный и др), био­логическим (биотест со спорами тест-культур микроорганизмов) и химическим (химические тес­ты, индикаторы типа ИС) способами

Контроль режима стерилизации автоклавов проводят химическим способом при каждой загрузке автоклава Химический тест - стеклянная трубочка с химическим веществом, имеющим определенную температуру плавления, антипирин, резорцин - 110±2°, бензойная кислота - 120±2°, бензамид - 126+1°, мочевина, никотинамид, Д (+)-манноза - 132+2°. В состав химических тестов вводят анилиновый краситель (фуксин, генцнанвиолет и др), который равномерно окрашивает вещество при его расплавлении. В настоящее время чаше используются индикаторы типа ИС (фирма «Винар», Россия), представляющие полоску бумаги с нанесенным на нее слоем индика­торной смеси и предназначенные дня оперативного визуального контроля не только температуры, по и времени стерилизации (ИС-120, ИС-132) Ежеквартально проводится контроль режима стери­лизации с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus stearotermophilus BKM В-718

Печь Пастера - стерилизация сухим жаром.

В печи Пастера стерилизуют изделия из стекла, металлов и резин на основе силиконового каучука. Режим стерилизации: 160°С - 150 мин; 180°С - 60 мин Контроль режима стерилизации при каждом цикле осуществляется с помощью индикаторов стерилизации ИС-160, ИС-180; еже­квартально - с использованием биотеста со спорами тест-культуры Bacillus licheniformis

Стерилизация Таблица 1.

Дезинфекция Таблица 2.

Это металлический цилиндр с двойной стенкой, снаружи покрытый металлическим кожухом. Он герметичес­ки закрывается массивной крышкой с помощью нескольких винтов. На нем установлен манометр с предохранительным клапаном и паро­отводный кран.

Перед стерилизацией в автоклав наливают через воронку с водо­мерным стеклом дистиллированную воду до указанной на кожухе черты. В стерилизующую камеру загружают материал для стерилиза­ции, закрывают плотно крышкой, завинчивают и включают источник нагрева. При этом пароотводный кран ос­тавляют открытым. Образующийся при кипячении пар проходит между стенками автоклава и через отверстия внутренней стенки попадает в камеру. При нагревании из автоклава через пароотводный кран вначале выходит воздух, а затем пар. Выход непрерывной струей сухого пара свидетельствует о полном вытеснении воз­духа из автоклава: кран закрывают, и с этого момента в автоклаве начинает постепенно повышаться давление, стрелка на манометре поднимается. Началом сте­рилизации считается тот момент, когда стрелка манометра достигает нужного дав­ления.

Рис.3

Показание манометра соответствует определенной температуре пара в автоклаве: 0,50 МПа - 112 °С, 0,1 МПа - 120, 0,15 МПа - 127, 0,2 МПа - 134 °С.

Материал в автоклаве чаще всего стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20-30 мин. По окончании стерилизации отключают источник нагрева (стрелка манометра постепенно доходит до нуля). После этого открывают пароотводный кран, выпускают остаток пара. Затем осто­рожно отвинчивают крышку и открывают ее. После полного остывания вынимают простерилизованный материал.

В автоклаве можно стерилизовать посуду, инструменты, питатель­ные среды (кроме желатина и сред с углеводами), перевязочный материал и т. п. При работе необходимо соблюдать правила техники безопасности. К работе допускают лиц, имеющих удостоверение на право пользования автоклавом. Исправность автоклава проверяет инспекция котлонадзора.

Аппарат Коха (рис. 4)- это металлический цилиндр, обшитый снаружи материалом (линолеум, асбест), плохо проводящим тепло. На дно наливают воду, а стерилизующий материал помещают сверху на подставку. Аппарат закрывают конической крышкой, в которой имеются отверстия для термометра и выхода пара. Внизу расположен кран для спуска воды. Стерилизацию проводят текучим паром при 100 °С в течение 30-60 мин. При таком режиме погибают вегетативные клетки спорообразующих и неспорообразующих форм микробов. Дробная стерилизация (трехкратная) по 30-60 мин в течение трех дней с интервалом 18-20 ч позволяет создать условия для прорастания спор в вегетативные клетки и освободиться от них. В промежутки времени между стерилизацией споры прорастают и при последующем прогрева­нии погибают. В аппарате Коха стерилизуют те материалы, которые не выдерживают температуру выше 100 °С (желатин, молоко, углеводные среды и др.).

Белковые среды и сыворотку крови, не переносящие температуру 100 °С, стерилизуют дробно при 56-58 °С в водяной бане.

Сушильный шкаф (печь Пастера) (рис. 5) - это металлический двустенный шкаф, покрытый сверху асбестом. В верхней стенке имеются отверстия для термометра и вентиляции. Нагретый воздух поднимается снизу между стенками и через верхнее отверстие попа­дает внутрь шкафа, где на полках размещен стерилизуемый материал. Стерилизацию проводят сухим жаром при 150 "С в течение 2 ч, при 165-170 °С - 45 мин, при 180 °С - 15 мин. В печи Пастера стерилизуют стеклянную посуду. После стерилизации шкаф отключают от источни­ка нагрева и открывают только после полного остывания.

Бактериальные фильтры используют для стерилизации жидкости без нагревания. К ним относятся свечи Шамберлана, Берке-фельда и асбестовые фильтры (пластинки) Зейтца.

Фильтровальные свечи (рис. 6) представляют собой полые ци­линдры, изготовленные из мелкопористых веществ: каолина с при­месью кварцевого песка (свечи Шамберлана) и инфузорной земли (свечи Беркефельда). Свечи Шамберлана имеют различной величины поры, через которые проходят микробы. Свечи, пропускающие круп­ные бактерии, обозначены буквами L9, L1(bis), L3, средние - L5, L7, самые мелкие - L9, L 11 , L 13 Свечи Беркефельда по пористости обозна­чаются W , N , V (самые крупные поры у свечей с маркой У).

Фильтры Зейтца представляют собой асбестовые пластинки раз­личной величины. При монтировании прибора для стерилизации пластинку помещают на сетку между металлическими дисками (с отверстием в середине), которые плотно прижимают друг к другу винтами. Смонтированный фильтр вставляют через пробку в колбу с боковой отводкой (колба Бунзена) и резиновой трубкой, обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 20-30 мин.

Для фильтрования материала создают разрежение в колбе Бунзе­на, подсоединяя к ней резиновую трубку с разрежающим масляным ручным насосом Комовского или электровакуумным насосом.

Выполнение работы. Микробы культивируют при оптимальных температурных режимах. Для этого в лабораториях используют воз­душные или водяные термостаты.

(рис. 7) представляет собой металлический шкаф с двойными стенками, между которыми находится слой воды или воздуха. Наружная часть термостата покрыта материалом, плохо проводящим тепло (асбест, линолеум).

Рис. 4, 5, 6.

Внутри термостата расположены полки для размещения посев­ного материала выращиваемых микроорганизмов. Постоянную температуру в термостате поддер­живают с помощью терморегулято­ра, который вмонтирован в верх­нюю крышку термостата. Устройст­во терморегулятора основано на принципе линейного расширения веществ. Терморегуляторы пред­ставляют собой сплав каких-либо двух металлов с различным коэффициентом теплового расширения (латунь, цинк) или металлическую "подушку", наполненную спир­том, смесью спирта и эфира, рту­тью или другими веществами, из­меняющими свой объем при определенной температуре. При нагревании термостата выше установлен­ной нормы металлы расширяются, контакты размыкаются и дальней­ший приток тепла автоматически задерживается. После снижения температуры включается электрический ток и приток тепла возобно­вляется.