1. Mogućnosti genetskog inženjeringa. 4

2. Istorija genetskog inženjeringa. 6

3. Genetski inženjering kao nauka. Metode genetskog inženjeringa. 10

4. Područja primjene genetskog inženjeringa. 12

5. Naučne činjenice o opasnostima genetskog inženjeringa. 18

Zaključak. 22

Reference.. 23

Uvod

Tema genetskog inženjeringa u posljednje vrijeme postaje sve popularnija. Najviše pažnje posvećuje se negativnim posljedicama do kojih može dovesti razvoj ove grane nauke, a vrlo malo se govori o prednostima koje genetski inženjering može donijeti.

Najperspektivnije područje primjene je proizvodnja lijekova korištenjem tehnologija genetskog inženjeringa. Nedavno je postalo moguće dobiti korisne vakcine na bazi transgenih biljaka. Ništa manje zanimljiva je proizvodnja prehrambenih proizvoda po istim tehnologijama.

Genetski inženjering je nauka budućnosti. Trenutno su u cijelom svijetu milioni hektara zemlje zasijani transgenim biljkama, stvaraju se jedinstveni medicinski preparati i stvaraju se novi proizvođači korisnih supstanci. Vremenom će genetski inženjering omogućiti postizanje novih napretka u medicini, poljoprivredi, prehrambenoj industriji i stočarstvu.

Svrha ovog rada je proučavanje karakteristika mogućnosti, istorije razvoja i područja primjene genetskog inženjeringa.

1. Mogućnosti genetskog inženjeringa

Važan dio biotehnologije je genetski inženjering. Rođena početkom 70-ih, danas je postigla veliki uspjeh. Tehnike genetskog inženjeringa transformišu ćelije bakterija, kvasca i sisara u "tvornice" za proizvodnju bilo kojeg proteina velikih razmjera. To omogućava da se detaljno analizira struktura i funkcije proteina i da se koriste kao lijekovi. Trenutno, Escherichia coli (E. coli) je postala dobavljač tako važnih hormona kao što su insulin i somatotropin. Ranije se inzulin dobivao iz životinjskih stanica pankreasa, pa je njegova cijena bila vrlo visoka. Za dobijanje 100 g kristalnog inzulina potrebno je 800-1000 kg gušterače, a jedna žlijezda krave je teška 200-250 grama. To je učinilo inzulin skupim i teško dostupnim za širok spektar dijabetičara. Godine 1978. istraživači iz Genentecha su prvi put proizveli inzulin u posebno dizajniranom soju Escherichia coli. Insulin se sastoji od dva polipeptidna lanca A i B, dužine 20 i 30 aminokiselina. Kada su povezani disulfidnim vezama, nastaje prirodni dvolančani inzulin. Pokazalo se da ne sadrži proteine ​​E. coli, endotoksine i druge nečistoće, ne izaziva nuspojave poput životinjskog inzulina i da nema biološku aktivnost

je drugačije. Nakon toga, proinzulin je sintetizovan u ćelijama E. coli, za koje je kopija DNK sintetizovana na RNK šablonu koristeći reverznu transkriptazu. Nakon pročišćavanja nastalog proinzulina, on je podijeljen na nativni inzulin, dok su faze ekstrakcije i izolacije hormona svedene na minimum. Od 1000 litara tečnosti kulture može se dobiti do 200 grama hormona, što je ekvivalentno količini insulina koji se luči iz 1600 kg pankreasa svinje ili krave.

Somatotropin je ljudski hormon rasta koji luči hipofiza. Nedostatak ovog hormona dovodi do hipofiznog patuljastosti. Ako se somatotropin daje u dozama od 10 mg po kg tjelesne težine tri puta sedmično, onda za godinu dana dijete koje pati od njegovog nedostatka može narasti 6 cm. Ranije se dobijao iz trupnog materijala, od jednog leša: 4 - 6 mg somatotropina u smislu konačnog farmaceutskog proizvoda. Stoga su dostupne količine hormona bile ograničene, osim toga, hormon dobiven ovom metodom bio je heterogen i mogao je sadržavati spororastuće viruse. Kompanija Genentec je 1980. godine razvila tehnologiju za proizvodnju somatotropina pomoću bakterija, koja je bila lišena ovih nedostataka. Godine 1982. ljudski hormon rasta je dobijen u kulturi E. coli i životinjskih ćelija na Pasteur institutu u Francuskoj, a 1984. godine počela je industrijska proizvodnja insulina u SSSR-u. U proizvodnji interferona koriste se i E. coli, S. cerevisae (kvasac) i kultura fibroblasta ili transformiranih leukocita. Sigurne i jeftine vakcine se takođe dobijaju sličnim metodama.

Tehnologija rekombinantne DNK temelji se na proizvodnji visoko specifičnih DNK sondi, koje se koriste za proučavanje ekspresije gena u tkivima, lokalizaciju gena na hromozomima i identifikaciju gena sa srodnim funkcijama (na primjer, kod ljudi i pilića). DNK sonde se također koriste u dijagnostici raznih bolesti.

Tehnologija rekombinantne DNK omogućila je nekonvencionalni pristup gena proteina koji se naziva reverzna genetika. U ovom pristupu, protein se izoluje iz ćelije, gen za ovaj protein se klonira i modifikuje, stvarajući mutantni gen koji kodira izmenjeni oblik proteina. Dobijeni gen se unosi u ćeliju. Ako se ekspresira, ćelija koja ga nosi i njeni potomci će sintetizirati izmijenjeni protein. Na taj način se mogu ispraviti defektni geni i liječiti nasljedne bolesti.

Ako se hibridna DNK unese u oplođeno jaje, mogu se proizvesti transgeni organizmi koji eksprimiraju mutantni gen i prenose ga na svoje potomstvo. Genetska transformacija životinja omogućava utvrđivanje uloge pojedinih gena i njihovih proteinskih proizvoda kako u regulaciji aktivnosti drugih gena tako iu različitim patološkim procesima. Uz pomoć genetskog inženjeringa stvorene su linije životinja otpornih na virusne bolesti, kao i rase životinja sa osobinama korisnim za ljude. Na primjer, mikroinjekcija rekombinantne DNK koja sadrži goveđi somatotropin gen u zigotu kunića omogućila je dobivanje transgene životinje sa hiperprodukcijom ovog hormona. Nastale životinje su imale izraženu akromegaliju.

Nosioci materijalne osnove gena su hromozomi, koji uključuju DNK i proteine. Ali geni formiranja nisu hemijski, već funkcionalni. Sa funkcionalne tačke gledišta, DNK se sastoji od mnogih blokova koji pohranjuju određenu količinu informacija - gena. Djelovanje gena zasniva se na njegovoj sposobnosti da odredi sintezu proteina putem RNK. Molekul DNK sadrži, takoreći, informacije koje određuju hemijsku strukturu proteinskih molekula. Gen je dio molekule DNK koji sadrži informacije o primarnoj strukturi bilo kojeg proteina (jedan gen - jedan protein). Pošto u organizmima postoje desetine hiljada proteina, postoje desetine hiljada gena. Ukupnost svih gena ćelije čini njen genom. Sve stanice u tijelu sadrže isti skup gena, ali svaka od njih implementira drugačiji dio pohranjenih informacija. Stoga se, na primjer, nervne ćelije razlikuju od ćelija jetre i po strukturnim, funkcionalnim i biološkim karakteristikama.

Sada je čak i teško predvideti sve mogućnosti koje će se ostvariti u narednih nekoliko decenija.

2. Istorija genetskog inženjeringa

Istorija visokih biomedicinskih tehnologija, metoda genetskih istraživanja, kao i samog genetskog inženjeringa, u direktnoj je vezi sa večnom željom čoveka da unapredi rase domaćih životinja i kultivisane biljke koje ljudi uzgajaju. Odabirom pojedinih individua iz grupa životinja i biljaka i njihovim ukrštanjem, čovjek je, a da nije imao ispravnu predstavu o unutrašnjoj suštini procesa koji se odvijaju unutar živih bića, ipak, dugi niz stotina i hiljada godina, stvarao poboljšane rase životinja i sorte biljaka koje su imale određena korisna i neophodna svojstva za ljude.

U 18. i 19. stoljeću učinjeno je mnogo pokušaja da se otkrije kako se osobine prenose s generacije na generaciju. Jedno važno otkriće napravio je 1760. botaničar Koelreuther, koji je ukrstio dvije vrste duhana, prenoseći polen sa prašnika jedne vrste na tučak druge vrste. Biljke dobijene iz hibridnog sjemena imale su karakteristike srednjeg nivoa između oba roditelja. Koelreuter je iz toga izveo logičan zaključak da se roditeljske karakteristike prenose i kroz polen (sjemenske ćelije) i kroz ovule (ovule). Međutim, ni on ni njegovi suvremenici, koji su se bavili hibridizacijom biljaka i životinja, nisu uspjeli otkriti prirodu mehanizma prijenosa naslijeđa. To se dijelom objašnjava činjenicom da u to vrijeme još nije bila poznata citološka osnova ovog mehanizma, ali uglavnom činjenicom da su naučnici pokušavali istovremeno proučavati nasljeđivanje svih karakteristika biljaka.

Naučni pristup proučavanju nasljeđivanja određenih osobina i svojstava razvio je austrijski katolički redovnik Gregor Mendel, koji je u ljeto 1865. godine započeo svoje eksperimente u hibridizaciji biljaka (ukrštanje različitih sorti graška) na teritoriji svog samostana. On je prvi otkrio osnovne zakone genetike. Gregor Mendel je postigao uspjeh jer je proučavao nasljeđivanje pojedinačnih, jasno različitih (kontrastnih) osobina, brojao broj potomaka svake vrste i pažljivo vodio detaljne zapise o svim svojim eksperimentima ukrštanja. Poznavanje osnova matematike omogućilo mu je da ispravno protumači dobijene podatke i iznese pretpostavku da je svaka osobina određena s dva nasljedna faktora. Talentovani monah-istraživač kasnije je mogao jasno pokazati da se nasljedna svojstva ne miješaju, već se prenose na potomstvo u obliku određenih jedinica. Ovaj briljantni zaključak naknadno je u potpunosti potvrđen kada je bilo moguće vidjeti hromozome i saznati karakteristike različitih tipova diobe stanica: mitoze (somatske stanice - tjelesne ćelije), mejoze (seksualne, reproduktivne, germinalne) i oplodnje.

Mendel je rezultate svog rada izvijestio na sastanku Brunnovog društva prirodnjaka i objavio ih u zbornicima ovog društva. Njegovi savremenici nisu shvatili značaj njegovih rezultata, a ova istraživanja nisu privlačila pažnju oplemenjivača biljaka i prirodnjaka skoro 35 godina.

Godine 1900., nakon što su postali poznati detalji o diobi stanica prema tipu mitoze, mejoze i same oplodnje, tri istraživača - de Vries u Holandiji, Correns u Njemačkoj i Chermak u Austriji - izveli su niz eksperimenata i, neovisno jedan o drugom, ponovo otkrili zakone naslijeđa, koje je prethodno opisao Mendel. Kasnije, otkrivši Mendelov članak u kojem su ovi zakoni jasno formulisani 35 godina ranije, ovi naučnici su jednoglasno odali počast monahu naučniku tako što su po njemu nazvali dva osnovna zakona nasledstva.

U prvoj deceniji 20. vijeka vršeni su eksperimenti sa najrazličitijim biljkama i životinjama, a vršena su i brojna zapažanja o nasljeđivanju karaktera kod ljudi, što je jasno pokazalo da se kod svih ovih organizama nasljeđe pokorava istim osnovnim zakonima. Utvrđeno je da se faktori koje je opisao Mendel koji određuju individualnu osobinu nalaze u hromozomima ćelijskog jezgra. Kasnije, 1909. godine, danski botaničar Johansen je ove jedinice nazvao geni (od grčke riječi "ge-nos" - rod, porijeklo), a američki naučnik William Sutton uočio je iznenađujuću sličnost između ponašanja hromozoma tokom formiranja gamete (polne ćelije), njihovu oplodnju i prenošenje Mendelovih nasljednih faktora – gena. Na osnovu ovih genijalnih otkrića stvorena je takozvana hromozomska teorija nasljeđa.

Naime, sama genetika, kao nauka o naslijeđu i varijabilnosti živih organizama i metodama njihove kontrole, nastala je početkom 20. stoljeća. Američki genetičar T. Morgan, zajedno sa svojim suradnicima, proveo je brojne eksperimente koji su omogućili otkrivanje genetske osnove određivanja spola i objašnjenje niza neobičnih oblika nasljeđivanja u kojima prijenos neke osobine ovisi o spolu pojedinca. (tzv. spolno povezane osobine). Sljedeći veliki iskorak napravljen je 1927. godine, kada je G. Möller ustanovio da je zračenjem voćne mušice Drosophila i drugih organizama rendgenskim zracima moguće umjetno izazvati promjene gena na njima, odnosno mutacije. To je omogućilo dobivanje mnogih novih mutantnih gena - dodatnog materijala za proučavanje nasljeđa. Podaci o prirodi mutacija poslužili su kao jedan od ključeva za razumijevanje i strukturu samih gena.

Dvadesetih godina našeg veka, sovjetski naučnici škole A.S. Serebrovski je izveo prve eksperimente koji su pokazali koliko je gen složen. Ove ideje su koristili J. Watson i F. Crick, koji su 1953. godine u Engleskoj uspjeli stvoriti DNK model i dešifrirati genetski kod. Naknadni istraživački rad vezan za ciljano stvaranje novih kombinacija genetskog materijala doveo je do pojave samog genetskog inženjeringa.

Istovremeno, 40-ih godina počelo je eksperimentalno istraživanje odnosa između gena i enzima. U tu svrhu naširoko je korišten još jedan predmet - plijesan Neurospora, iz koje je bilo moguće umjetno dobiti i proučavati niz biokemijskih mutacija povezanih s gubitkom jednog ili drugog posebnog enzima (proteina). U protekle dvije decenije, najčešće mete genetskih istraživanja bile su Escherichia coli i određeni bakteriofagi koji inficiraju ovu bakteriju.

Od samog početka 20. stoljeća postoji kontinuirano interesovanje za proučavanje nasljeđivanja određenih (specifičnih) osobina kod ljudi i za nasljedni prijenos poželjnih i nepoželjnih osobina kod domaćih životinja i kultiviranih biljaka. Na osnovu sve većeg znanja o genetskim obrascima, genetičari i uzgajivači su naučili, gotovo po narudžbi, uzgajati rase stoke koje mogu preživjeti u vrućim klimatskim uvjetima, krave koje daju puno mlijeka s visokim sadržajem masti, kokoške koje nose velika jaja sa tankom ljuskom, te sortama kukuruza i pšenice koje su vrlo otporne na određene bolesti.

Godine 1972. u SAD-u je u laboratoriji P. Berga dobijena prva hibridna (rekombinantna) DNK. Uzbudljive ideje u oblasti ljudske genetike i metoda genetskog istraživanja počele su da se naširoko razvijaju i primenjuju u samoj medicini. Sedamdesetih godina počelo je dekodiranje ljudskog genoma. Više od decenija postoji projekat pod nazivom Ljudski genom. Od 3 milijarde nukleotidnih parova raspoređenih u neprekidne neprekidne prolaze, do sada je pročitano samo oko 10 miliona karaktera. Istovremeno se stvaraju nove genetske tehnike koje povećavaju brzinu čitanja DNK. Direktor Medicinsko-genetičkog centra Ruske akademije medicinskih nauka V.I. Ivanov definitivno vjeruje da će "cijeli genom biti pročitan oko 2020. godine".

3. Genetski inženjering kao nauka. Metode genetskog inženjeringa

Genetski inženjering je in vitro konstrukcija funkcionalno aktivnih genetskih struktura (rekombinantna DNK), ili drugim riječima, stvaranje umjetnih genetskih programa (Baev A.A.). Prema E.S. Piruzyan genetski inženjering je sistem eksperimentalnih tehnika koji omogućava konstruisanje veštačkih genetskih struktura u laboratoriji (in vitro) u obliku takozvanih rekombinantnih ili hibridnih DNK molekula.

Riječ je o usmjerenoj, po unaprijed određenom programu, izgradnji molekularno genetskih sistema izvan tijela sa njihovim naknadnim unošenjem u živi organizam. U tom slučaju, rekombinantna DNK postaje sastavni dio genetskog aparata organizma primatelja i daje mu nova jedinstvena genetska, biohemijska, a zatim i fiziološka svojstva.

Cilj primijenjenog genetskog inženjeringa je dizajnirati takve rekombinantne DNK molekule koji bi, kada se unesu u genetski aparat, dali tijelu svojstva korisna za ljude.

Rekombinantna DNK tehnologija koristi sljedeće metode:

Specifično cijepanje DNK restrikcijskim nukleazama, ubrzavajući izolaciju i manipulaciju pojedinačnih gena;

Brzo sekvenciranje svih nukleotida u pročišćenom fragmentu DNK, što omogućava određivanje granica gena i sekvence aminokiselina koju on kodira;

Konstrukcija rekombinantne DNK;

Hibridizacija nukleinske kiseline, koja omogućava detekciju specifičnih RNA ili DNK sekvenci sa većom preciznošću i osetljivošću, na osnovu njihove sposobnosti da vežu komplementarne sekvence nukleinskih kiselina;

Kloniranje DNK: in vitro amplifikacija lančanom reakcijom polimeraze ili uvođenjem fragmenta DNK u bakterijsku ćeliju, koja nakon takve transformacije ovaj fragment reproducira u milionima kopija;

Uvođenje rekombinantne DNK u ćelije ili organizme.

4. Područja primjene genetskog inženjeringa

Aktuelna naučna otkrića u oblasti ljudske genetike zapravo su od revolucionarnog značaja, jer je reč o mogućnosti kreiranja „mape ljudskog genoma“, odnosno „patološke anatomije ljudskog genoma“. Ova genetska mapa će omogućiti da se odredi lokacija gena na dugačkoj spirali DNK koji su odgovorni za određene nasljedne bolesti. Ove neograničene mogućnosti su, prema mišljenju genetičara, bile osnova za ideju ​​korišćenja takozvane genske terapije u kliničkoj praksi, što je vid lečenja pacijenata koji podrazumeva zamenu zahvaćenih gena uz pomoć visokih biomedicinskih tehnologija i genetskog inženjeringa. Invazija u sastav ljudskih genskih sistema i obezbeđivanje njihove vitalne aktivnosti moguća je kako na nivou somatskih (sve telesne ćelije sa određenim strukturnim i funkcionalnim razlikama) ćelija tela, tako i na nivou reproduktivnih, reproduktivnih (germinativnih) i germinalnih. (embrionalne) ćelije.

Genetski inženjering kao vrsta terapije - liječenje specifične genetski uvjetovane bolesti - povezuje se s nabavkom odgovarajuće nedefektne molekule DNK u svrhu njezine zamjene uz pomoć gena - dijela hromozoma koji sadrži defekt, ili za integraciju u ljudski genetski materijal spajanjem sa takozvanim somatskim ćelijama ljudskog tela koje imaju genetski defekt. Zadatak genetskog inženjeringa u odnosu na osobu je da obezbijedi odgovarajući ciljani efekat na određeni gen kako bi ga ispravio u pravcu pravilnog funkcionisanja i obezbedio osobi koja boluje od nasledne bolesti normalnu, nepromenjenu verziju gena. Za razliku od terapije lijekovima, ova terapija, koja se zove genetski inženjering, očito će moći pacijentu pružiti dugotrajan, produžen, visoko efikasan tretman koji donosi veliko olakšanje i korist.

Međutim, sve moderne metode uvođenja DNK u žive organizme nisu u stanju da je usmjere i isporuče specifičnoj populaciji stanica koje sadrže izmijenjeni i stoga neispravni gen. Drugim riječima, takozvani usmjereni transfer, transport gena u tijelu (u “in vivo” modelu) trenutno je nemoguć.

Drugi metodološki pristup, baziran na izdvajanju iz tijela pacijenta određene populacije stanica koje sadrže zahvaćeni gen i manipulaciji genetskim materijalom zamjenom defektnih gena u stanicama pomoću genetskog inženjeringa (u modelu “in vitro”) i vraćanjem u to mjesto u tijelu, odakle su uzeti od pacijenta, trenutno je moguće u medicinsko-genetičkim centrima. Ova metoda genske terapije putem genetskog inženjeringa već je korišćena u eksperimentalnom pokušaju da se izleče dva pacijenta koji boluju od retke genetske bolesti zvane beta talasemija, koja je, kao i anemija srpastih ćelija, takođe uzrokovana prisustvom deformisanog i samim tim neispravnog funkcionisanja. proteina u crvenim krvnim zrncima. Suština manipulacije je bila da su iz koštane srži ovih pacijenata izolovane takozvane matične ćelije, u čije je hromozome uveden deo DNK odgovoran za proizvodnju normalnog proteina hemoglobulina - gen. Nakon što su oštećene matične ćelije koje su ostale u koštanoj srži pacijenata gotovo potpuno uništene, pacijentima su ubrizgane genetski modifikovane matične ćelije. Nažalost, ova dva pokušaja su bila klinički neuspješna, jer su pacijenti umrli. Ovaj prvi slučaj genetskog inženjeringa u bolničkom okruženju nije odobren ili odobren od strane relevantnih revizionih komisija, a njegovi učesnici su najoštrije osuđeni zbog grubog kršenja pravila istraživanja u oblasti ljudske genetike.

Genetski inženjering reproduktivnih (reproduktivnih) stanica može dovesti do potpuno drugačijih posljedica, jer se uvođenje DNK u te stanice razlikuje od ispravljanja genetskog defekta u somatskim (tjelesnim, nereproduktivnim) stanicama. Poznato je da uvođenje drugih gena u hromozome zametnih stanica dovodi do njihovog prijenosa na sljedeće generacije. U principu, može se zamisliti dodavanje određenih dijelova DNK kako bi se zamijenili defektni dijelovi genetskom materijalu svake ćelije koja se razmnožava određene osobe koja je zahvaćena jednom ili drugom genetski uvjetovanom bolešću.

Zaista, ovo je postignuto kod miševa. Tako je dobijeno jaje iz jajnika ženke, koje je naknadno oplođeno in vitro (in vitro), a zatim je u hromozom oplođenog jajeta uveden strani dio DNK. Samo oplođeno jaje sa izmijenjenim genomom implantirano je (uvedeno) u majčinu matericu ženke miša. Izvor stranog DNK u jednom eksperimentu bio je genetski materijal zeca, au drugom ljudski genetski materijal.

Kako bi se u periodu fetalnog razvoja otkrila vjerovatnoća da dijete ima određene genetske abnormalnosti, kao što su Downov sindrom ili Tay-Sachsova bolest, koristi se istraživačka tehnika koja se zove amniocenteza - prenatalna analiza, tokom koje se uzima uzorak biološke tekućine. koji sadrže zametne ćelije, uzete iz amnionske vrećice početkom drugog trimestra trudnoće. Osim toga, dodatno je razvijena tehnika vađenja različitih fetalnih stanica iz uzorka krvi placente majke. Ovako dobijene ćelije materice trenutno se mogu koristiti samo za identifikaciju ograničenog broja genetski uslovljenih bolesti kod kojih postoje izraženi, grubi poremećaji u strukturi DNK i promene utvrđene biohemijskim testovima. Genetski inženjering korištenjem rekombinantne DNK tokom prenatalnog istraživanja otvara mogućnost ispravnog dijagnosticiranja različitih i brojnih nasljednih bolesti.

U ovom slučaju se razvijaju tehnike za stvaranje takozvanih genskih “sondi”, pomoću kojih je moguće utvrditi da li kromosom sadrži normalan, nepromijenjen gen ili abnormalan, defektan gen. Osim toga, genetski inženjering povezan sa upotrebom rekombinantne DNK, koja je u jednoj od faza svog formiranja, u budućnosti će omogućiti da se izvrši takozvano „planiranje“ ljudskih gena, tako da određeni gen koji nosi iskrivljene, patološke informacije i stoga je od interesa za genetičare, mogao bi se identifikovati na vreme i dovoljno brzo po analogiji sa metodom korišćenja drugog „označenog” gena. Ova složena medicinska i biološka tehnika trebala bi pomoći u određivanju lokacije bilo kojeg gena u stanicama materice, a ne samo u onima kod kojih će se tehnikom amniocenteze vjerovatno otkriti različiti poremećaji.

S tim u vezi, posljednjih godina pojavljuju se novi dijelovi biomedicinskih nauka, kao što su, na primjer, visoke DNK tehnologije, embrioterapija i ćelijska terapija (citoterapija), odnosno intrauterina dijagnoza i liječenje genetski uvjetovane bolesti kako na obrazovnoj fazi i razvoju embrija (embriona), te u fazi sazrijevanja fetusa. Invazija i manipulacija embrionalnim materijalom ima direktan utjecaj na nasljeđivanje genetskih promjena, budući da one imaju sposobnost da se prenose s generacije na generaciju. Štoviše, sama genetska dijagnoza počinje se razvijati u genetsko predviđanje, odnosno u određivanje buduće sudbine osobe, konsolidirajući glavne revolucionarne promjene u samoj medicini, koja je, kao rezultat složenih medicinsko-genetskih eksperimenata i tehnika, dobila priliku mnogo prije pojave "kliničke slike bolesti", ponekad čak i prije rođenja osobe, kako bi se utvrdilo koje mu nasljedne bolesti prijete. Tako je, zahvaljujući naporima genetičara i specijalista iz oblasti genetskog inženjeringa, u dubinama biomedicinskih nauka rođena takozvana „prediktivna medicina“, odnosno medicina koja „predviđa budućnost“.

Istovremeno, različite tehnologije i metode genetskog inženjeringa omogućavaju da se u prenatalnom periodu razvoja djeteta, prije njegovog rođenja, predvidi ne samo prisutnost određene nasljedne bolesti, već i da se detaljno opiše medicinsko i genetsko stanje. svojstva rastućeg embriona i fetusa.

Sa akumulacijom novih podataka o genetskom mapiranju ljudskog genoma i opisu (sekvenciranju) njegove DNK, kao i zbog toga što savremene metode proučavanja polimorfizama DNK koje se razvijaju omogućavaju da se učine dostupnim genetske informacije o određenim strukturnim i funkcionalnim ( uključujući patološke) karakteristike ljudskog tijela, koje će se, po svemu sudeći, pojaviti u budućnosti, ali sada još nisu uočljive, postaje moguće dobiti, uz pomoć medicinske genetske dijagnostike, sve genetske informacije o djetetu ne samo pretklinički, odnosno prije ispoljavanja određene nasljedne bolesti, i prenatalno, odnosno prije njegovog rođenja, ali i preventivno, odnosno čak i prije njenog začeća.

U dogledno vrijeme, zahvaljujući uspjehu i napretku na polju medicinske genetičke dijagnostike, moći će se, na osnovu DNK dijagnostičkih podataka, prilično pouzdano suditi, na primjer, kolika je visina osobe, mentalne sposobnosti, predispozicija za određene bolesti. (posebno, rak) će biti. ili mentalno), osuđen na ispoljavanje i razvoj bilo koje nasljedne bolesti.

Savremene medicinske i biološke tehnologije omogućavaju otkrivanje različitih poremećaja u genima koji se mogu manifestirati i uzrokovati određene tegobe, ne samo u fazi klinički izražene bolesti, već i kada još nema znakova patologije, a sama bolest neće manifestuje se tako brzo. Primjeri za to uključuju Alchajmerovu bolest i Huntingtonovu koreju, koje pogađaju osobu stariju od 40 ili čak 70 godina. Međutim, čak i u tim slučajevima moguće je otkriti gene koji mogu uzrokovati slične bolesti kod ljudi, čak i prije začeća pacijenta. Takođe je poznato da se dijabetes melitus može svrstati u jednu od ovih bolesti. Predispozicija za ovu bolest i sama genetski određena patologija su naslijeđene i mogu se manifestirati u slučaju nepridržavanja određenog načina života u odrasloj ili starosti. Sa razumnom sigurnošću možemo reći da ako oba roditelja ili jedan od njih boluju od dijabetesa, onda se vjerovatnoća nasljeđivanja gena za “dijabetes” ili kombinacije takvih gena prenosi na djecu.

U ovom slučaju se ispostavlja da je moguće provesti odgovarajuće medicinske i biološke studije i postaviti ispravnu dijagnozu u prisustvu mikroskopski malih količina biološkog materijala. Ponekad je za to dovoljno nekoliko pojedinačnih ćelija koje će se umnožavati u kulturi in vitro, a od njih će se dobiti „genetski portret” testirane osobe, naravno, ne za sve gene njegovog genoma (ima ih na desetine hiljada njih!), ali za one od njih, za koje postoje opravdani razlozi za sumnju na postojanje određenih nedostataka. Istovremeni razvoj metoda ćelijskog i genetskog inženjeringa omogućit će da se u narednim fazama poznavanja genoma otvori praktična mogućnost proizvoljnog, a prije svega, u terapeutske svrhe, promjene redoslijeda i reda gena. njihov sastav i strukturu.

Medicina nije jedino područje primjene genetskog inženjeringa. Postoje genetski inženjering biljaka i genetski inženjering bakterioloških ćelija.

Nedavno su se pojavile nove mogućnosti za dobijanje „jestivih“ vakcina na bazi transgenih biljaka.

Veliki napredak je postignut u transgenim biljkama u svijetu. Oni su velikim dijelom posljedica činjenice da problem dobivanja organizma iz ćelije, grupe stanica ili nezrelog embrija u biljkama sada nije mnogo težak. Ćelijske tehnologije, kultura tkiva i stvaranje regeneranata se široko koriste u modernoj nauci.

Razmotrimo dostignuća u oblasti uzgoja biljaka koja su postignuta na Sibirskom institutu za fiziologiju i biohemiju biljaka Sibirskog ogranka Ruske akademije nauka.

Tako je posljednjih godina niz transgenih biljaka dobiven prijenosom u njihov genom gena ugt, acp, acb, accc i drugih izolovanih iz različitih biljnih objekata.

Kao rezultat uvođenja ovih gena, pojavile su se transgene biljke pšenice, krompira, paradajza, krastavca, soje, graška, uljane repice, jagode, jasike i još neke druge.

Uvođenje gena je vršeno ili "ciljanjem" tkiva iz "genskog pištolja" (čiji je dizajn razvijen u našem institutu), ili genetskim vektorom na bazi agrobakterijskog plazmida sa ugrađenim ciljnim genima i odgovarajućim promotorima. .

Kao rezultat toga, formiran je niz novih transgenih oblika. Evo nekih od njih.

Transgena pšenica (2 sorte), koja ima znatno intenzivniji rast i bokovanje, verovatno je otpornija na sušu i druge nepovoljne faktore sredine. Proučava se njegova produktivnost i nasljeđivanje stečenih svojstava.

Transgeni krompir, koji se prati tri godine. Konzistentno daje prinos koji je 50-90 posto veći od kontrole, stekao je gotovo potpunu otpornost na auksinske herbicide, a osim toga gomolji značajno manje „crne“ na rezovima zbog smanjenja aktivnosti polifenol oksidaze.

Transgeni paradajz (nekoliko sorti), koji se odlikuje većom grmolikom i prinosom. U stakleniku, njegov prinos je do 46 kg po kvadratnom metru (više od dva puta veći od kontrole).

Transgeni krastavac (više sorti) daje veći broj plodnih cvjetova, a samim tim i plodova sa prinosom do 21 kg po metru kvadratnom naspram 13,7 u kontroli.

Postoje transgeni oblici drugih biljaka, od kojih mnoge imaju i niz korisnih ekonomskih osobina.

Genetski inženjering je nauka danas i sutra. Već sada se širom svijeta na desetine miliona hektara zasijavaju transgene biljke, stvaraju se novi lijekovi i novi proizvođači korisnih tvari. Vremenom će genetski inženjering postati sve snažniji alat za nova dostignuća u medicini, veterini, farmakologiji, prehrambenoj industriji i poljoprivredi.

5. Naučne činjenice o opasnostima genetskog inženjeringa

Treba napomenuti da uz napredak koji donosi razvoj genetskog inženjeringa, postoje i neke činjenice o opasnostima genetskog inženjeringa, od kojih su glavne predstavljene u nastavku.

1. Genetski inženjering se suštinski razlikuje od razvoja novih sorti i rasa. Umjetno dodavanje stranih gena uvelike remeti fino reguliranu genetsku kontrolu normalne stanice. Manipulacija genima je fundamentalno drugačija od kombinacije majčinih i očinskih hromozoma koja se javlja u prirodnim križanjima.

2. Trenutno je genetski inženjering tehnički nesavršen, jer nije u stanju da kontroliše proces ubacivanja novog gena. Stoga je nemoguće predvidjeti mjesto insercije i efekte dodanog gena. Čak i ako se lokacija gena može odrediti nakon što je umetnut u genom, dostupne informacije o DNK su vrlo nepotpune za predviđanje rezultata.

3. Kao rezultat vještačkog dodavanja stranog gena, mogu neočekivano nastati opasne supstance. U najgorem slučaju to mogu biti otrovne tvari, alergeni ili druge tvari štetne po zdravlje. Informacije o ovim vrstama mogućnosti su još uvijek vrlo nepotpune.

4. Ne postoje potpuno pouzdane metode za ispitivanje neškodljivosti. Više od 10% ozbiljnih nuspojava novih lijekova ne može se otkriti, uprkos pažljivo sprovedenim studijama sigurnosti. Rizik da će opasna svojstva nove genetski modificirane hrane ostati neotkrivena vjerovatno će biti znatno veći nego u slučaju lijekova.

5. Trenutni zahtjevi za ispitivanje neškodljivosti su krajnje nedovoljni. Oni su jasno dizajnirani da pojednostave proces odobravanja. Oni omogućavaju upotrebu izuzetno neosetljivih metoda ispitivanja bezopasnosti. Stoga postoji značajan rizik da će opasni prehrambeni proizvodi proći inspekciju neotkriveni.

6. Prehrambeni proizvodi koji su do danas stvoreni genetskim inženjeringom nemaju značajnu vrijednost za čovječanstvo. Ovi proizvodi zadovoljavaju uglavnom samo komercijalne interese.

7. Poznavanje uticaja genetski modifikovanih organizama unesenih u životnu sredinu je potpuno nedovoljno. Još uvijek nije dokazano da organizmi modificirani genetskim inženjeringom neće imati štetne posljedice po okoliš. Ekolozi su predložili različite potencijalne ekološke komplikacije. Na primjer, postoje mnoge mogućnosti za nekontrolirano širenje potencijalno štetnih gena koje koristi genetski inženjering, uključujući prijenos gena bakterijama i virusima. Komplikacije uzrokovane okolinom vjerovatno je nemoguće ispraviti jer se oslobođeni geni ne mogu vratiti.

8. Mogu se pojaviti novi i opasni virusi. Eksperimentalno je pokazano da se virusni geni ugrađeni u genom mogu kombinovati sa genima infektivnih virusa (tzv. rekombinacija). Ovi novi virusi mogu biti agresivniji od originalnih. Virusi također mogu postati manje specifični za vrstu. Na primjer, biljni virusi mogu postati štetni za korisne insekte, životinje, ali i ljude.

9. Poznavanje nasljedne supstance, DNK, vrlo je nepotpuno. Poznata je funkcija samo tri posto DNK. Rizično je manipulisati složenim sistemima o kojima je znanje nepotpuno. Veliko iskustvo u oblasti biologije, ekologije i medicine pokazuje da to može uzrokovati ozbiljne nepredvidive probleme i poremećaje.

10. Genetski inženjering neće pomoći u rješavanju problema gladi u svijetu. Tvrdnja da genetski inženjering može dati značajan doprinos rješavanju problema gladi u svijetu je naučno neutemeljen mit.

Zaključak

Genetski inženjering je metoda biotehnologije koja se bavi istraživanjem restrukturiranja genotipova. Genotip nije samo mehanički zbir gena, već složen sistem koji se razvio tokom evolucije organizama. Genetski inženjering omogućava prijenos genetskih informacija s jednog organizma na drugi putem in vitro operacija. Transfer gena omogućava prevladavanje međuvrstnih barijera i prijenos individualnih nasljednih karakteristika jednog organizma na drugi.

Preuređenje genotipova, pri obavljanju zadataka genetskog inženjeringa, predstavlja kvalitativne promjene gena koje nisu povezane sa promjenama u strukturi hromozoma vidljivim u mikroskopu. Promjene gena su prvenstveno povezane s transformacijom hemijske strukture DNK. Informacija o strukturi proteina, napisana kao sekvenca nukleotida, implementirana je kao sekvenca aminokiselina u sintetizovanom proteinskom molekulu. Promjena redoslijeda nukleotida u hromozomskoj DNK, gubitak nekih i uključivanje drugih nukleotida mijenja sastav molekula RNK formiranih na DNK, a to, zauzvrat, određuje novi slijed aminokiselina tokom sinteze. Kao rezultat toga, novi protein počinje da se sintetizira u ćeliji, što dovodi do pojave novih svojstava u tijelu. Suština metoda genetskog inženjeringa je da se pojedinačni geni ili grupe gena ubacuju ili isključuju iz genotipa organizma. Kao rezultat umetanja prethodno odsutnog gena u genotip, stanica može biti prisiljena sintetizirati proteine ​​koje ranije nije sintetizirala.

Bibliografija

2. Lee A., Tinland B. Integracija t-DNK u genom biljke: prototip i stvarnost // Plant Physiology. 2000. - Sveska 47. - Br. 3.

3. Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. et al. Genetika razvoja biljaka. - Sankt Peterburg: Nauka, 2000. - 539 str.

4. Lyadskaya M. Genetski inženjering može učiniti sve - čak i uzgojiti cjepivo u vrtu // Pharmaceutical Bulletin. - 2000. - br. 7.

5. Romanov G. A. Genetski inženjering biljaka i načini rješavanja problema biološke sigurnosti // Fiziologija biljaka, 2000. - Svezak 47. - Br. 3.

6. Salyaev R. Mitovi i stvarnost genetskog inženjeringa // Nauka u Sibiru. - 2002. - br. 7.

7. Favorova O. O. Liječenje genima - fikcija ili stvarnost? // Farmaceutski bilten. - 2002. - br. 5.

Kuzmina N.A. Osnovi biotehnologije: udžbenik. - Omsk: OGPU, 2001. - 256 str.

Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. et al. Genetika razvoja biljaka. - Sankt Peterburg: Nauka, 2000. - 539 str.

Lyadskaya M. Genetski inženjering može učiniti sve - čak i uzgojiti cjepivo u vrtu // Pharmaceutical Bulletin. - 2000. - br. 7.

Kuzmina N.A. Osnovi biotehnologije: udžbenik. - Omsk: OGPU, 2001. - 256 str.

Favorova O. O. Liječenje genima - fikcija ili stvarnost? // Farmaceutski bilten. - 2002. - br. 5.

Salyaev R. Mitovi i stvarnost genetskog inženjeringa // Nauka u Sibiru. - 2002. - br. 7.

Kuzmina N.A. Osnovi biotehnologije: udžbenik. - Omsk: OGPU, 2001. - 256 str.

Genetski (genetski) inženjering

Genetski (genetski) inženjering– umjetna konstrukcija genetskih struktura i nasljedno modificiranih organizama. Genetski inženjering je dio (primijenjena grana) molekularne genetike povezan sa ciljanim stvaranjem novih molekula DNK sposobnih za razmnožavanje u ćeliji domaćinu. U ovom slučaju dolazi do umjetne, svrsishodne promjene genotipa organizma (mikroorganizma) i stvaranja novih karakteristika i svojstava. Genetski inženjering se bavi dekodiranjem strukture gena, njihovom sintezom i kloniranjem, te umetanjem gena izolovanih iz ćelija živih organizama u ćelije biljaka i životinja kako bi se specifično promenile njihove genetske karakteristike.

Dobro razvijene metode genetskog inženjeringa su transgeneza, mikrobiološka sinteza itd.

Transgeneza– prijenos gena s jedne vrste organizma na drugu. Transgeneza se provodi rezanjem i šivanjem dijelova DNK uz sudjelovanje enzima - restrikcijskih enzima i ligaza.

Faze transgeneze:

a) izolacija gena (fragmenata DNK) iz bakterijskih, biljnih ili životinjskih stanica pomoću enzima restrikcijskim enzimima;

b) povezivanje (vezivanje) gena (fragmenata DNK) sa plazmidom pomoću enzima ligaze;

c) uvođenje hibridne plazmidne DNK koja sadrži željeni gen u ćeliju domaćina;

d) kopiranje (kloniranje) ovog gena u ćeliji domaćina i osiguravanje njegovog rada prema shemi: “DNK kod – transkripcija – translacija – protein”

Alati za genetski inženjering su enzimi otkriveni 1974. restrikcijskim enzimima (restrikcijskim endonukleazama). Restrikcijski enzimi prepoznaju dijelove (mjesta) DNK i prave rezove u lancima DNK. Na krajevima svakog fragmenta formiraju se jednolančani repovi, zvani " ljepljivi krajevi" budući da se mogu, takoreći, držati zajedno zbog komplementarnosti.

Restrikcijski enzimi prepoznaju specifičnu sekvencu nukleotida DNK u dvolančanoj DNK. Restrikcioni enzim se zatim veže na prepoznato nukleotidno mesto i preseca ga na mestu vezivanja. Češće, restrikcijski enzimi prepoznaju regione od 4-6 parova nukleotida u molekulu DNK i preseku oba lanca DNK u sredini ovih regiona ili obično sa pomakom. Primjeri restrikcijskih enzima: restrikcijski enzim Eco RI, koji prepoznaje fragment DNK od šest nukleotida GAATTC (mjesto reza između nukleotida G i A oba lanca DNK); restrikcijski enzim Hind III prepoznaje AAGCTT regiju (mjesto reza između nukleotida A i A oba lanca DNK); restrikcijski enzim Bam I prepoznaje GGATCC regiju (mjesto reza između nukleotida G i G oba lanca DNK); restrikcijski enzim Hae III prepoznaje GGC mjesto (mjesto preseka između G i C nukleotida oba lanca DNK); restrikcijski enzim Hpa II prepoznaje CCGG regiju (mjesto reza između C i C nukleotida oba lanca DNK).

Dalje, da bi se konstruisao genetski modifikovan organizam, potrebno je uvesti željeni gen u ćeliju ovog organizma. Unošenje stranih gena u organizam vrši se pomoću plazmidni vektor. Vektor je plazmid – mali kružni molekul DNK koji se ekstrahuje iz citoplazme bakterijske ćelije. Plazmidi– faktori nasljeđa locirani izvan hromozoma, koji predstavljaju ekstrahromozomska DNK.

Rice. 37.

A– Šema za uvođenje strane DNK u bakterijski plazmid pomoću enzima (restrikciona endonukleaza i ligaza).

B– Shema prijenosa ljudskih gena odgovornih za sintezu hormona inzulina i formiranje vektorske DNK.

Osobine plazmida: 1) ima sposobnost autonomne replikacije; 2) sadrži gene koji kodiraju antibiotike; 3) sposobni su da se integrišu u hromozom ćelije primaoca; 4) prepoznaje delove DNK koji se mogu preseći restrikcijskim enzimima; 5) restrikcijski enzim može presjeći plazmid i prebaciti ga u linearno stanje. Istraživači koriste ova svojstva plazmida da bi dobili rekombinantna (hibridna) DNK.

Slijed uvođenja DNK u plazmid (plazmidni vektor) korištenjem restrikcionog enzima(Sl. 37 A):

1) ograničenje– rezanje molekule DNK restrikcijskim enzimom, formiranje DNK fragmenata i izolacija potrebnog gena;

2) uključivanje izolovanog gena u plazmid, tj. dobijanje rekombinantne (hibridne) DNK uvođenjem fragmenta strane DNK u plazmid;

3) ligacija– umrežavanje enzima ligaza plazmid (vektor) i strani fragmenti DNK; u ovom slučaju, krajevi vektora i strane DNK (takozvani “ljepljivi krajevi”) su komplementarni jedni drugima;

4) transformacija– uvođenje rekombinantnog plazmida u genom druge ćelije (ćelije primaoca), posebno bakterijske ćelije.

Treba napomenuti da plazmidi prodiru samo u dio tretiranih bakterija. Transformirane bakterije, zajedno s plazmidima, stiču otpornost na određeni antibiotik, što ih čini mogućim odvojiti od netransformiranih bakterija koje umiru na podlozi koja sadrži antibiotik. Svaka od transformiranih bakterija, smještena na hranjivu podlogu, umnožava se i formira koloniju od mnogo hiljada potomaka - klon.

5) skrining– odabir među transformisanim bakterijama onih koje sadrže plazmide sa željenim genom.

Transgene životinje i biljke

Klonirani geni se mikroinjekcijama unose u jajašca sisara ili biljne protoplaste (izolovana stanica bez stanične stijenke), a zatim se iz njih uzgajaju životinje ili biljke u čijem genomu djeluju strani geni. Biljke i životinje čiji su genomi promijenjeni operacijama genetskog inženjeringa nazivaju se transgene organizacije (transgene biljke i životinje), jer sadrži strane gene. Dobiveni su transgeni miševi, zečevi, svinje i ovce. Njihov genom sadrži gene bakterija, sisara i ljudi. Dobivene su transgene biljke (kukuruz, paprika, paradajz, pšenica, raž, mahunarke, krompir itd.) koje sadrže gene nesrodnih vrsta. Transgene biljke su otporne na herbicide, insekte, nepovoljne kišne uslove itd. Problem promjene nasljednosti mnogih poljoprivrednih biljaka postepeno se rješava.

Genetska mapa hromozoma. Genska terapija

Genetska mapa hromozoma je dijagram relativnog rasporeda gena koji se nalaze u istoj grupi vezivanja. Takve mape se sastavljaju za svaki par homolognih hromozoma. Genetska mapa pokazuje redoslijed gena na hromozomu i udaljenost između njih (postotak križanja između određenih gena). Dakle, stvaranje novih sojeva mikroorganizama sposobnih za sintetizaciju hormona, proteina i lijekova zasniva se na poznavanju genetskih mapa mikroorganizama. Ljudske genetske mape su neophodne za medicinsku genetiku. Znanja o lokalizaciji gena na određenom hromozomu koriste se u dijagnostici niza nasljednih bolesti, kao i u genskoj terapiji za korekciju strukture i funkcije gena.

genska terapija - zamjena defektnih gena netaknutim, ili korekcija njihove strukture.

Za borbu protiv nasljednih, onkoloških i bolesti povezanih sa starenjem razvijaju se metode genske terapije koje su sigurne za ljudske stanice. Koristeći metode genske terapije, moguće je zamijeniti defektne gene u tijelu u kojima su se dogodile tačkaste mutacije netaknutim. Danas naučnici savladavaju metode ljudska biološka sigurnost: uvođenje potrebnih gena u ćelije ljudskog organizma. To će vam omogućiti da se riješite mnogih nasljednih bolesti.

Mikrobiološka sinteza

Metode genetskog inženjeringa omogućile su implementaciju mikrobiološka sinteza(Sl. 37 B). Koristeći metode genetskog inženjeringa, mikrobiolozi su uspjeli dobiti sojeve bakterija, zahvaljujući kojima se uspješno provodi mikrobiološka sinteza. Da biste to učinili, odabiru se potrebne bakterijske stanice koje ne sadrže plazmide. Izoluju se molekuli DNK sa datim nizom nukleotida, koji određuju razvoj željene osobine. U bakterijsku ćeliju se uvodi plazmid sa integrisanom DNK sekcijom (genomom) u kojoj počinje da radi ugrađeni DNK deo (odvijaju se procesi replikacije, transkripcije, translacije) i potrebni protein (interferon, genferon, imunoglobulin, itd.). inzulin, somatotropin itd.) sintetizira se u bakterijskoj ćeliji. ). U industrijskim količinama dobijaju se hormoni (insulin, somatotropin), mnoge aminokiseline, antibiotici, vakcine itd. Takve bakterije se umnožavaju u industrijskom obimu i proizvode potrebne proteine.

Genetskim metodama dobijen je soj mikroorganizma Pseudomonas denitrificans, koji proizvodi desetine puta više vitamina C i B vitamina od originalnog oblika; novi soj bakterije Micrococcus glutamicus luči stotine puta više aminokiseline lizina od originalne (divlje) kulture bakterije koja proizvodi lizin.

Cell engineering

Cell engineering– uzgoj pojedinačnih ćelija ili tkiva u posebnim vještačkim podlogama, razvoj metoda za stvaranje nove vrste stanica njihovom hibridizacijom, zamjenom hromozoma i uzgojem hibrida iz njih.

1. Metoda kulture tkiva

Metoda se sastoji od kultivacije izolovanih ćelija ili komada tkiva na veštačkoj hranljivoj podlozi u odgovarajućim mikroklimatskim uslovima. Kao rezultat uzgoja, biljne stanice ili dijelovi tkiva se regenerišu u cijelu biljku. Mikroklonskim razmnožavanjem pojedinačnih ćelija ili komada tkiva (obično apikalni meristem stabljike ili korena) mogu se dobiti mnoge korisne biljke. Eksperimentalno se biraju mikroklimatski uslovi i hranljivi mediji za regeneraciju ukrasnog, kulturnog i lekovitog bilja. Kultura tkiva se također koristi za proizvodnju diploidnih biljaka nakon tretiranja originalnih haploidnih oblika kolhicinom.

2. Somatska hibridizacija

Somatska hibridizacija uključuje proizvodnju hibridnih ćelija, a iz njih - novih oblika; veštačka oplodnja jajnih ćelija.

Dobivanje novih hibridnih biljaka fuzijom protoplasta (nukleusa i citoplazme) različitih ćelija u kulturi tkiva. Za spajanje protoplasta, biljni stanični zid se uništava uz pomoć enzima i dobiva se izolirani protoplast. Kada se uzgajaju takvi protoplasti različitih biljnih vrsta, oni se spajaju i formiraju forme s novim korisnim karakteristikama. Vještačka oplodnja jajnih ćelija vrši se metodom vantelesne oplodnje (IVF), koja omogućava oplodnju jajnih ćelija in vitro uz naknadnu implantaciju embriona u ranoj fazi razvoja, kao i za prevazilaženje nekih oblika neplodnosti kod ljudi.

3. Inženjering hromozoma– zamjena pojedinačnih hromozoma u biljnim stanicama ili dodavanje novih. Diploidi imaju parove homolognih hromozoma, a takvi se organizmi nazivaju disomici. Ako u bilo kojem paru ostane jedan hromozom, tada se formira monosomija. Ako bilo kom paru dodate treći homologni hromozom, formira se trizomik itd. Moguće je zamijeniti pojedinačne hromozome jedne vrste hromozomima druge vrste. Primljeno oblici se nazivaju supstituisani.

Genetski inženjering

Moderna biologija se suštinski razlikuje od tradicionalne biologije ne samo po većoj dubini razvoja kognitivnih ideja, već i po bližoj povezanosti sa životom društva i sa praksom. Možemo reći da je biologija u naše vrijeme postala sredstvo za transformaciju živog svijeta kako bi se zadovoljile materijalne potrebe društva. Ovaj zaključak ilustruje prije svega tijesna povezanost biologije sa biotehnologijom, koja je postala najvažnije područje materijalne proizvodnje, ravnopravan partner mehaničkim i kemijskim tehnologijama koje je stvorio čovjek, kao i medicinom.

Od svog nastanka, biologija i biotehnologija su se uvijek razvijale zajedno, a biologija je od samog početka bila naučna osnova biotehnologije. Međutim, dugo vremena nedostatak vlastitih podataka nije dozvoljavao biologiji da ima veliki utjecaj na biotehnologiju. Situacija se dramatično promijenila stvaranjem u drugoj polovini 20. stoljeća. metodologija genetskog inženjeringa,što se shvata kao genetska manipulacija u svrhu konstruisanja novih i rekonstrukcije postojećih genotipova. Budući da je po svojoj prirodi metodološko dostignuće, genetski inženjering nije doveo do prekida postojećih ideja o biološkim pojavama, nije uticao na temeljne principe biologije, kao što ni radioastronomija nije uzdrmala temeljne principe astrofizike, uspostavljanje “ mehanički ekvivalent toplote” nije doveo do promene zakona toplotne provodljivosti, ali dokaz atomske teorije materije nije promenio odnose između termodinamike, hidrodinamike i teorije elastičnosti (A.A. Baev).

Ipak, genetski inženjering je otvorio novu eru u biologiji iz razloga što su se pojavile nove mogućnosti za prodiranje u dubinu bioloških pojava kako bi se dalje karakterizirali oblici postojanja žive tvari, efikasnije proučavala struktura i funkcija gena u molekularnom nivou, i razumiju suptilne mehanizme njihovog rada.genetski aparat. Uspjeh genetskog inženjeringa znači revoluciju u modernom

prirodna nauka. Oni određuju kriterijume vrednosti savremenih ideja o strukturnim i funkcionalnim karakteristikama molekularnog i ćelijskog nivoa žive materije. Savremeni podaci o živim bićima su od ogromnog obrazovnog značaja, jer omogućavaju razumevanje jednog od najvažnijih aspekata organskog sveta i time daju neprocenjiv doprinos stvaranju naučne slike sveta. Tako je, dramatično proširivši svoju kognitivnu bazu, biologija putem genetskog inženjeringa također imala vodeći utjecaj na uspon biotehnologije.

Genetski inženjering stvara temelje na putu razumijevanja metoda i načina „konstruiranja“ novih ili poboljšanja postojećih organizama, dajući im veću ekonomsku vrijednost i mogućnost naglog povećanja produktivnosti biotehnoloških procesa. Međutim, genetski inženjering je stvorio nove horizonte za medicinu u dijagnostici i liječenju mnogih bolesti, kako nenasljednih tako i nasljednih. Otvorio je nove puteve u potrazi za novim lijekovima i materijalima koji se koriste u medicini. Genetski inženjering i biotehnologija potaknuli su razvoj bionanotehnoloških tehnika.

U okviru genetskog inženjeringa postoje genetski I ćelijski inženjering. Genetski inženjering se odnosi na manipulacije za stvaranje rekombinantnih molekula DNK. Ova metodologija se često naziva molekularno kloniranje, kloniranje gena, tehnologija rekombinantne DNK ili jednostavno genetska manipulacija. Važno je naglasiti da su objekti genetskog inženjeringa molekuli DNK i pojedinačni geni. Nasuprot tome, ćelijski inženjering se odnosi na genetsku manipulaciju izolovanih pojedinačnih ćelija ili grupa ćelija biljaka i životinja.

GENETSKI INŽENJERING I NJEGOVI ALATI

Genetski inženjering je skup različitih eksperimentalnih tehnika (tehnika) koje obezbjeđuju dizajn (rekonstrukciju) i kloniranje DNK molekula i gena za određene svrhe.

Metode genetskog inženjeringa se koriste u određenom nizu (Sl. 127), a u implementaciji se izdvaja nekoliko faza.

nije tipičan eksperiment genetskog inženjeringa koji ima za cilj kloniranje gena, naime:

1. Izolacija plazmidijske DNK iz ćelija organizma od interesa (inicijalna) i izolacija DNK vektora.

2. Rezanje (restrikcija) DNK originalnog organizma na fragmente koji sadrže gene od interesa pomoću jednog od restrikcijskih enzima i izolovanje ovih gena iz restrikcijske smjese. Istovremeno, vektorska DNK se reže (ograničava), pretvarajući ga iz kružne strukture u linearnu.

3. Povezivanje DNK segmenta od interesa (gena) sa vektorskom DNK kako bi se dobili hibridni DNK molekuli.

4. Unošenje rekombinantnih molekula DNK transformacijom u neki drugi organizam, npr. E. coli ili somatskih ćelija.

5. Zasijavanje bakterija u koje su uvedene hibridne DNK molekule na hranljive podloge koje omogućavaju rast samo ćelija koje sadrže hibridne molekule DNK.

6. Identifikacija kolonija koje se sastoje od bakterija koje sadrže hibridne DNK molekule.

7. Izolacija klonirane DNK (klonirani geni) i njena karakterizacija, uključujući sekvencioniranje azotnih baza u kloniranom DNK fragmentu.

Rice. 127.Uzastopne faze eksperimenta genetskog inženjeringa

Tokom evolucije, bakterije su razvile sposobnost da sintetiziraju takozvane restrikcijske enzime (endonukleaze), koji su postali dio ćelijskog (bakterijskog) sistema za modifikaciju restrikcije. Kod bakterija, sistemi restrikcijske modifikacije su intracelularni imuni sistem za zaštitu od strane DNK. Za razliku od viših organizama, kod kojih se prepoznavanje i uništavanje virusa, bakterija i drugih uzročnika bolesti odvija ekstracelularno, kod bakterija se zaštita od strane DNK (DNK biljaka i životinja u čijim tijelima žive) odvija intracelularno, tj. kada strana DNK prodre u citoplazmu bakterije. Kako bi se zaštitile, bakterije su također razvile sposobnost "označavanja" vlastite DNK metilacijskim bazama na određenim sekvencama. Iz istog razloga, strana DNK, zbog odsustva metilnih grupa na istim sekvencama, biva topljena (isječena) na fragmente raznim bakterijskim restrikcijskim enzimima, a zatim se razgrađuje bakterijskim egzonukleazama do nultidida. Možemo reći da se na taj način bakterije štite od DNK biljaka i životinja, u čijim tijelima žive privremeno (kao patogeni) ili trajno (kao saprofiti).

Restrikcijski enzimi su prvi put izolovani iz E. coli 1968. Ispostavilo se da su oni sposobni da preseku (tape) molekule DNK na različitim restrikcijskim mestima (lokacijama). Ovi enzimi su nazvani endonukleazama klase I. Zatim su u bakterijama otkrivene endonukleaze klase II, koje specifično prepoznaju restrikcijska mjesta u stranoj DNK i također provode restrikciju na tim mjestima. Upravo su enzimi ove klase počeli da se koriste u genetskom inženjeringu. Istovremeno, otkriveni su enzimi klase III koji tope DNK u blizini mjesta prepoznavanja, ali ti enzimi nisu važni u genetskom inženjeringu.

Djelovanje restrikciono-modifikacionog sistema je „racionalizovano“ takozvanim palindromskim (prepoznavanjem) sekvencama azotnih baza, koje su restrikcijska mjesta DNK. Palindromske sekvence su nizovi baza koje se čitaju na isti način naprijed i nazad, kao što je niz slova radar. Budući da lanci DNK imaju antiparalelni smjer, sekvenca se smatra palindromskom ako je identična kada se čita u smjeru od 5" do 3" kraja na vrhu i na donjem lancu od 3" do 5" kraja , naime:

Palindromi mogu biti bilo koje veličine, ali većina palindroma koji se koriste kao mjesta za prepoznavanje restrikcijskih enzima sastoje se od 4, 5, 6 i rijetko 8 baza.

Restrikcijski enzimi su apsolutno neophodan alat u genetskom inženjeringu za izrezivanje interesnih fragmenata (gena) iz velikih molekula DNK. Pošto je poznato više od 100 restrikcijskih enzima, to omogućava selekciju restrikcijskih enzima i selektivnu eksciziju fragmenata iz originalne DNK.

Izvanredna karakteristika restrikcijskih enzima je to što molekule sijeku na nekoliko fragmenata (restrikcija) DNK sa koracima, zbog čega je na rezultirajućim krajevima jedan lanac duži od drugog, tvoreći svojevrsni rep. Takvi krajevi (repovi) nazivaju se "ljepljivim" krajevima, jer su sposobni za samokomplementarnost.

Razmotrimo rezultate restrikcije na primjeru jednog od najpoznatijih restrikcijskih enzima Eco RI iz sistema modifikacije ograničenja E. coI. Umjesto da topi DNK u središtu palindromske sekvence prepoznavanja, ovaj enzim topi DNK izvan centra i proizvodi 4 samokomplementarna (“ljepljiva”) kraja koja se sastoje od različitog broja nukleotida, naime:

Ovi ljepljivi krajevi korisni su u eksperimentima genetskog inženjeringa jer se mogu komplementarno spojiti na niskim temperaturama, omogućavajući efikasno zatvaranje fragmenata DNK.

Mjesta prepoznavanja i mjesta topljenja u slučaju drugih restrikcijskih enzima imaju različit sadržaj, i to:

Nakon restrikcije DNK, iz restrikcijske smjese se izoluju restrikcijski DNK fragmenti (DNK restrikcijski fragmenti), koji su zatim neophodni za kombinovanje sa vektorom. Za izolaciju restrikcijskih enzima DNK koristi se elektroforeza, jer je ovom metodom vrlo lako frakcionirati restrikcijsku DNK zbog veličine restrikcijskih fragmenata i konstantnog omjera električnog naboja i mase. Fragmenti u električnom polju migriraju tokom elektroforeze na frekvenciji koja ovisi o njihovoj veličini (masi). Što je veći (duži) fragment, sporije migrira u električnom polju. Materijal koji se koristi za elektroforezu je agaroza ili poliakrilamid koja se ne puni. Za identifikaciju fragmenata koristi se etidijev bromid, koji boji fragmente, što ih čini lakšim za otkrivanje.

Efikasnost elektroforeze je vrlo visoka, jer se može koristiti za odvajanje fragmenata čija se veličina kreće od 2 do 50.000 baza.

Nakon elektroforeze, fragmenti se izoluju iz agaroze različitim metodama. Na osnovu rezultata poređenja veličina

restrikcijskih enzima iste DNK dobijene korištenjem različitih restrikcijskih enzima, konstruiraju se restrikcijske mape koje pokazuju restrikcijska mjesta svakog od korištenih restrikcijskih enzima. U praktičnom smislu, restrikcione mape omogućavaju određivanje ne samo veličine restrikcijskih mjesta, već i određivanje lokacije lokusa određenih gena u molekulima DNK.

Budući da se kod viših organizama tokom transkripcije sintetiše heterogena DNK koja se koriguje obradom, genetski inženjering obično koristi komplementarnu DNK (cDNK), koja se dobija korišćenjem mRNA kao šablona, ​​na kojoj reverzna transkriptaza sintetiše jednolančanu DNK (cDNK) , koji je kopija mRNA. Ove jednolančane DNK se kasnije pretvaraju u dvolančanu DNK. Smatra se da cDNK sadrži kontinuirane nukleotidne sekvence (transkribovane i prevedene). Za restrikciju se koristi cDNK.

DNK fragmenti (restrikcije) izolovani nakon elektroforeze iz agaroznih gelova mogu se prethodno podvrgnuti sekvenciranju, tj. odrediti njihov nukleotidni niz. U tu svrhu koriste se hemijske i enzimske metode sekvenciranja. Hemijska metoda se zasniva na dobijanju fragmenata označenih radioaktivnim fosforom (32 P) i uklanjanju jedne od baza iz tih fragmenata, nakon čega se uzimaju u obzir rezultati autoradiografije gelova koji sadrže te fragmente. Enzimska metoda se zasniva na uvođenju nukleotida na kraju analiziranog fragmenta, koji se zatim koristi u sintezi različitih fragmenata. in vitro, elektroforetski analiziran na nukleotidnu sekvencu. Za proučavanje specifičnih nukleotidnih sekvenci u molekulu DNK, koristite

takođe hibridizacija DNK-DNK, RNA-RNA, DNK-RNA, Northern

i Southern blots.

Genetski vektori. DNK segment (gen) koji je namijenjen za molekularno kloniranje mora imati sposobnost replikacije kada se prenese u bakterijsku ćeliju, tj. biti replikon. Međutim, on nema takvu sposobnost. Stoga, kako bi se osigurao prijenos i detekcija kloniranih gena u stanicama, oni se kombiniraju s takozvanim genetskim vektorima. Potonji mora imati najmanje dva svojstva. Prvo, vektori moraju biti sposobni za replikaciju

u ćelijama i na nekoliko krajeva. Drugo, moraju obezbijediti mogućnost odabira ćelija koje sadrže vektor, tj. imaju marker koji se može koristiti za kontra-selekciju ćelija koje sadrže vektor zajedno sa kloniranim genom (rekombinantne DNK molekule). Plazmidi i fagi ispunjavaju ove zahtjeve. Plazmidi su dobri vektori jer su replikoni i mogu sadržavati gene za otpornost na bilo koji antibiotik, što omogućava selekciju bakterija za otpornost na ovaj antibiotik i, samim tim, lako otkrivanje rekombinantnih molekula DNK

(Sl. 128).

Rice. 128. Vektor pBRl

Pošto ne postoje prirodni plazmidni vektori, svi do sada poznati plazmidni vektori su konstruisani veštački. Početni materijal za stvaranje niza genetskih vektora bili su R-plazmidi, u kojima je višak DNK sekvenci, uključujući i one sa višestrukim restrikcijskim mjestima, uklonjen korištenjem restrikcijskih enzima. Ova delecija je određena činjenicom da plazmidni vektor treba da ima samo jedno mjesto prepoznavanja za jedan restrikcijski enzim, a to mjesto treba da leži u funkcionalno nevažnom području genoma plazmida. Na primjer, plazmidni vektor pBR 322, koji ima gene otpornosti na ampicilin i tetraciklin, što ga čini vrlo pogodnim

za selekciju bakterija koje sadrže klonirani DNK segment, ima pojedinačna restrikcijska mjesta za više od 20 restrikcijskih enzima, uključujući tako dobro poznate restrikcijske enzime kao što su Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II i Sal I.

Fagi vektori također imaju niz prednosti. Oni mogu uključivati ​​veće (duže) klonirane fragmente DNK u poređenju sa vektorima plazme. Nadalje, prijenos fagova kloniranog fragmenta u ćelije kao rezultat njihove infekcije potonjem je učinkovitiji od transformacije DNK. Konačno, vektori faga omogućavaju efikasniji skrining (prepoznavanje) na površini agara kolonija koje sadrže ćelije koje nose gen koji se klonira. Mnogi vektori faga su bazirani na lambda fagu.

Osim fagnih, koriste se i drugi virusni vektori konstruisani na bazi virusa herpesa, kao i vektori konstruisani na bazi DNK kvasca.

Ako se kloniranje gena provodi pomoću stanica sisara ili biljaka, tada su zahtjevi za vektorima isti kao u slučaju kloniranja u bakterijskim stanicama.

Konstrukcija rekombinantnih molekula DNK. Direktna konstrukcija rekombinantnih molekula DNK slijedi nakon što se dobiju ograničenja proučavane DNK i vektorske DNK. Sastoji se od spajanja restrikcijskih segmenata DNK koja se proučava sa restrikcijom vektorske DNK, koja se kao rezultat restrikcije pretvara iz kružne u linearnu DNK.

Za povezivanje fragmenata DNK koji se proučava sa DNK vektora koristi se DNK ligaza (Sl. 129). Ligacija će biti uspješna ako povezane strukture imaju 3"-hidroksil i 5"-fosfatne grupe i ako su ove grupe pozicionirane na odgovarajući način jedna u odnosu na drugu. Fragmenti se spajaju kroz svoje ljepljive krajeve kao rezultat samokomplementarnosti. Pri visokim koncentracijama fragmenata, potonji s vremena na vrijeme postaju u ispravnom položaju (jedni nasuprot drugima). Mnogi restrikcijski enzimi, kao što je EcoRI, proizvode ljepljive krajeve koji se sastoje od četiri baze. Proces podvezivanja “ljepljivih” krajeva, koji se sastoje od četiri baze, odvija se na niskoj temperaturi (do 12°C).

Rice. 129. DNK ligacija

Ako restrikcijska probava proizvodi fragmente bez ljepljivih krajeva, oni se "prisilno" pretvaraju u molekule s ljepljivim krajevima pomoću enzima transferaze. Ovaj enzim dodaje nukleotide na 3" kraj DNK. Poli-A rep se može dodati na jedan fragment, a poli-T rep na drugi. Lančana reakcija polimeraze (PCR) se također koristi za generiranje bilo kojeg željenog kraja DNK. princip PCR-a se zasniva na denaturaciji DNK izolovane iz ćelija i njenom „žarenju“ dodatkom DNK oligonukleotida koji se sastoje od 15-20 nukleotida svaki u renaturišućim lancima.Ovi oligonukleotidi moraju biti komplementarni sekvencama u lancima odvojenim udaljenosti od 50-2000 nukleotida. Biti "sjeme" za sintezu DNK in vitro, oni dozvoljavaju DNK polimerazi da kopira one dijelove koji se nalaze između "prajmera". Ovo kopiranje proizvodi veliki broj kopija fragmenta DNK koji se proučava.

Uvođenje rekombinantnih molekula DNK u ćelije. Nakon što se DNK fragment (gen) od interesa spoji sa genetskim vektorom pomoću DNK ligaze, rezultirajući rekombinantni molekuli se uvode u ćelije kako bi se postigla njihova replikacija (zbog genetskog vektora) i povećao broj kopija. Najpopularniji način uvođenja rekombinantnih DNK molekula u ćelije, u kojima plazmid služi kao vektor, je transformacija E. coli. U tu svrhu, bakterijske ćelije se prethodno tretiraju kalcijumom ili rubidijumom (joni), po redu

tako da postaju "kompetentni" u percepciji rekombinantne DNK. Da bi se povećala učestalost prodiranja DNK u ćelije, koristi se metoda elektroporacije, koja podrazumijeva kratko izlaganje stanica intenzivnom električnom polju. Ovaj tretman stvara šupljine u ćelijskim membranama, što omogućava ćelijama da bolje percipiraju DNK. Nakon uvođenja rekombinantnih DNK molekula u bakterije, ove se polažu na MPA (mesni pepton agar) obogaćen antibioticima kako bi se odabrale željene ćelije, tj. ćelije koje sadrže rekombinantne DNK molekule. Frekvencija transformacije je niska. Tipično, jedan transformant se pojavljuje na 10 5 zasijanih ćelija. Ako je vektor fag, tada se pribjegava transfekciji stanica (bakterije ili kvasca) fagom. Što se tiče životinjskih somatskih ćelija, one su transficirane DNK u prisustvu hemikalija koje olakšavaju prolazak DNK kroz plazma membrane. Moguće su i direktne mikroinjekcije DNK u oocite, kultivisane somatske ćelije i embrije sisara.

Najvažnija stvar povezana s molekularnim kloniranjem je traženje načina da se utvrdi da li je klonirani fragment zaista uključen u vektor i zajedno sa vektorom, formirajući rekombinantnu DNK molekulu, ulazi u ćelije. Ako je riječ o bakterijskim stanicama, onda se jedna od metoda temelji na uzimanju u obzir insercione inaktivacije gena rezistencije plazmida (vektora). Na primjer, u plazmidnom vektoru pBR 322, koji određuje otpornost na ampicilin i tetraciklin, jedino mjesto za Pst I restrikcijski enzim nalazi se u lokusu koji zauzima gen za rezistenciju na ampicilin. Fuzija PstI na ovom mjestu stvara ljepljive krajeve, omogućavajući ligaciju kloniranog fragmenta za vektorsku DNK. Međutim, u ovom slučaju, plazmid (vektor) gen otpornosti na ampicilin je inaktiviran, dok gen otpornosti na tetraciklin na vektoru ostaje netaknut. To je gen otpornosti na tetraciklin koji se koristi za selekciju ćelija transformisanih rekombinantnim molekulima DNK. To omogućava da se osigura da ćelije kolonija uzgojene na mediju s tetraciklinom zapravo sadrže rekombinantne molekule DNK; one se provjeravaju takozvanim “spot testom” na paru posuda s čvrstim podlogom, od kojih jedna sadrži ampicilin, dok je drugi lišen ovog antibiotika. DNK za kloniranje jeste

samo u transformantima otpornim na tetraciklin. Što se tiče transformanata koji su istovremeno otporni na ampicilin i tetraciklin (ArTc), oni sadrže molekule plazmida (vektora) koji su spontano poprimili kružni oblik bez uključivanja strane (klonirane) DNK.

Druga metoda za detekciju umetanja stranih (kloniranih) fragmenata u plazmidni vektor zasniva se na upotrebi vektora koji sadrži gen β-galaktozidaze. Umetanje strane DNK u ovaj gen neizbježno inaktivira sintezu β-galaktozidaze, što se može otkriti postavljanjem transformiranih stanica na podlogu koja sadrži supstrate β-galaktozidaze. Ovaj medij omogućava selekciju obojenih ćelijskih kolonija. Postoje i druge metode.

Kao što je već napomenuto, linearni restrikcijski fragmenti vektorske DNK su sposobni da obnove kružnu strukturu bez uključivanja kloniranih segmenata. Da bi se smanjila učestalost spontanog formiranja takvih kružnih vektorskih DNK molekula, vektorski DNK restriktori se tretiraju fosfatazom. Kao rezultat toga, formiranje kružnih DNK molekula postaje nemoguće, jer će izostati 5"-PO 4 krajevi neophodni za djelovanje ligaze.

Skup kolonija transformatora uzgojenih na selektivnom mediju je skup stanica koje sadrže klonove različitih fragmenata (gena) klonirane genomske ili cDNK. Kolekcije ovih klonova formiraju takozvane DNK biblioteke, koje se široko koriste u radu genetskog inženjeringa.

Završna faza kloniranja gena je izolacija i proučavanje klonirane DNK, uključujući sekvenciranje. Obećavajući sojevi bakterija ili somatskih ćelija koji sadrže rekombinantne DNK molekule koji kontrolišu sintezu proteina od interesa koji imaju komercijalnu vrednost prenose se u industriju.

CELL ENGINEERING

Kao što je navedeno na početku poglavlja, ćelijski inženjering se odnosi na genetsku manipulaciju izolovanih životinjskih i biljnih ćelija. Ove manipulacije se često provode in vitro, a njihov osnovni cilj je dobijanje genotipova ovih organizama sa zadatim svojstvima, prvenstveno ekonomski korisnim. Kao za-

Od ljudskog bića, ispostavilo se da je ćelijski inženjering primjenjiv na njegove zametne stanice.

Preduvjet za razvoj ćelijskog inženjeringa kod ljudi i životinja bio je razvoj metoda za uzgoj njihovih somatskih stanica na umjetnim hranjivim podlogama, kao i dobivanje hibrida somatskih stanica, uključujući i interspecifične hibride. Zauzvrat, napredak u uzgoju somatskih stanica utjecao je na proučavanje zametnih stanica i oplodnje kod ljudi i životinja. Od 60-ih godina. XX vijek U nekoliko laboratorija širom svijeta provedeni su brojni eksperimenti na transplantaciji jezgri somatskih stanica u jajašca umjetno lišena jezgara. Rezultati ovih eksperimenata su često bili kontradiktorni, ali su generalno doveli do otkrića sposobnosti ćelijskih jezgara da obezbede normalan razvoj jajeta (vidi Poglavlje IV).

Na osnovu rezultata proučavanja razvoja oplođenih jajašca 60-ih godina. XX vijek Započela su i istraživanja kako bi se utvrdila mogućnost oplodnje jajnih stanica izvan majčinog tijela. Vrlo brzo su ove studije dovele do otkrića mogućnosti oplodnje jajne ćelije spermom in vitro i daljeg razvoja tako formiranih embriona implantacijom u matericu žene. Dalje usavršavanje metoda razvijenih u ovoj oblasti dovelo je do toga da je rađanje djece iz epruvete postalo stvarnost. Već 1981. godine u svijetu je rođeno 12 djece, čiji je život dat u laboratoriji, u epruveti. Trenutno je ovaj dio ćelijskog inženjeringa postao široko rasprostranjen, a broj djece iz "epruvete" je već na desetine hiljada (Sl. 130). U Rusiji je rad na dobijanju djece iz epruvete počeo tek 1986. godine.

Godine 1993. razvijena je tehnika za proizvodnju monozigotnih ljudskih blizanaca in vitro podjelom embriona na blastomere i rastom potonjih do 32 ćelije, nakon čega bi se mogli implantirati u matericu žene.

Pod utjecajem rezultata povezanih s proizvodnjom djece iz epruvete, razvijena je i tehnologija na životinjama, tzv. transplantacija embriona. Povezuje se s razvojem metode za izazivanje poliovulacije, metoda za umjetnu oplodnju jajnih stanica i implantaciju embriona u tijelo životinja - usvojitelja. Suština ove tehnologije se svodi na sljedeće:

shyu. Visokoproduktivnoj kravi se ubrizgavaju hormoni, što dovodi do poliovulacije, koja uključuje sazrijevanje 10-20 ćelija odjednom. Jaja se zatim umjetno oplođuju muškim reproduktivnim stanicama u jajovodu. Sedmog do osmog dana embrioni se ispiru iz materice i presađuju u materice drugih krava (hraniteljica), koje potom rađaju telad blizance. Telad nasljeđuju genetski status svojih prvobitnih roditelja.

Rice. 130.Djeca iz epruvete

Druga oblast inženjeringa životinjskih ćelija je stvaranje transgenih životinja. Najjednostavniji način za dobivanje takvih životinja je uvođenje linearnih molekula DNK u jaja originalnih životinja. Životinje koje se razviju iz ovako oplođenih jaja sadržavat će kopiju unesenog gena na jednom od svojih hromozoma i, osim toga, taj gen će prenijeti u naslijeđe. Složenija metoda za proizvodnju transgenih životinja razvijena je na miševima koji se razlikuju po boji dlake, a svodi se na sljedeće. Prvo, četiri dana stari embrioni se uklanjaju iz tijela trudnog sivog miša i drobe u pojedinačne ćelije. Zatim se jezgre uklanjaju iz embrionalnih ćelija i prenose u jaja crnih miševa, prethodno lišenih jezgara. Jaja crnih miševa koja sadrže strana jezgra stavljaju se u epruvete

sa hranljivim rastvorom za dalji razvoj. Embrioni razvijeni iz jaja crnih miševa implantiraju se u materice bijelih miševa. Tako je u ovim eksperimentima bilo moguće dobiti klon miševa sive boje dlake, tj. kloniraju embrionalne ćelije sa određenim svojstvima. U IV poglavlju ispitali smo rezultate oplodnje ovčijih jaja sa umjetnom denukleacijom nuklearnim materijalom iz somatskih stanica životinja iste vrste. Konkretno, iz ovčijih jaja su uklonjene jezgre, a zatim su u takva jajašca ubrizgane jezgre somatskih stanica (embrionalnih, fetalnih ili odraslih stanica), nakon čega su tako oplođena jajašca ubrizgana u maternice odraslih ovaca. Rođena jagnjad bila su identična ovcama donorima. Primjer je ovca Dolly. Dobijena su i klonska telad, miševi, zečevi, mačke, mazge i druge životinje. Takva konstrukcija transgenih životinja direktan je način kloniranja životinja s ekonomski korisnim osobinama, uključujući i jedinke određenog spola.

Transgene životinje se također dobivaju korištenjem početnog materijala koji pripada različitim vrstama. Konkretno, poznata je metoda prijenosa gena koji kontrolira hormon rasta sa pacova u jaja miša, kao i metoda kombinovanja blastomera ovaca sa blastomerima koze, što je dovelo do pojave hibridnih životinja (ovca). Ovi eksperimenti ukazuju na mogućnost prevazilaženja nekompatibilnosti vrsta u najranijim fazama razvoja. Posebno atraktivni izgledi otvaraju se (ako se potpuno prevaziđe nekompatibilnost vrsta) u načinu oplodnje jajašca jedne vrste jezgrima somatskih ćelija druge vrste. Govorimo o realnoj perspektivi stvaranja ekonomski vrijednih životinjskih hibrida koji se ne mogu dobiti ukrštanjem.

Treba napomenuti da rad na nuklearnoj transplantaciji još nije vrlo efikasan. Eksperimenti izvedeni na vodozemcima i sisarima generalno su pokazali da je njihova efikasnost niska, a zavisi od nekompatibilnosti jezgra donora i jajnih ćelija primaoca. Osim toga, prepreka uspjehu su i hromozomske aberacije koje nastaju u transplantiranim jezgrama tokom daljeg razvoja, a koje su praćene uginućem transgenih životinja.

Na raskrsnici studija hibridizacije ćelija i imunoloških istraživanja nastao je problem proizvodnje i proučavanja takozvanih monoklonskih antitela. Kao što je gore navedeno, antitijela koje tijelo proizvodi kao odgovor na uvođenje antigena (bakterije, virusi, crvena krvna zrnca, itd.) su proteini koji se nazivaju imunoglobulini i čine osnovni dio obrambenog sistema tijela od patogena. Ali svako strano tijelo uneseno u tijelo je mješavina različitih antigena koji će stimulirati proizvodnju različitih antitijela. Na primjer, ljudska crvena krvna zrnca posjeduju antigene ne samo za krvne grupe A (II) i B (III), već i mnoge druge antigene, uključujući Rh faktor. Nadalje, proteini u ćelijskom zidu bakterija ili kapsidi virusa također mogu djelovati kao različiti antigeni, uzrokujući stvaranje različitih antitijela. U isto vrijeme, limfoidne ćelije imunološkog sistema tijela obično su predstavljene klonovima. To znači da su čak i samo iz tog razloga antitijela u krvnom serumu imuniziranih životinja uvijek mješavina antitijela koje proizvode stanice različitih klonova. U međuvremenu, za praktične potrebe potrebna su antitijela samo jednog tipa, tj. takozvani monospecifični serumi koji sadrže antitijela samo jednog tipa ili, kako ih zovu, monoklonska antitijela.

U potrazi za metodama za proizvodnju monoklonskih antitijela, švicarski istraživači su 1975. otkrili metodu hibridizacije između limfocita miševa imuniziranih određenim antigenom i kultiviranih tumorskih stanica koštane srži. Takvi hibridi se nazivaju "hibridom". Od “limfocitnog” dijela, kojeg predstavlja limfocit jednog klona, ​​jedan hibridom nasljeđuje sposobnost da izazove stvaranje potrebnih antitela, jednog tipa, a zahvaljujući delu “tumor (mijelom)” postaje sposoban, kao i sve tumorske ćelije, neograničenog razmnožavanja na veštačkim hranljivim podlogama, dajući veliku populaciju hibrida. Na sl. 131 prikazuje dijagram izolacije ćelijskih linija koje sintetiziraju monoklonska antitijela. Ćelijske linije mišjih monoklonskih antitijela su izolirane spajanjem stanica mijeloma s limfocitima iz slezene miša imuniziranog pet dana ranije.

željeni antigen. Stanična fuzija se postiže njihovim miješanjem u prisutnosti polietilen glikola, koji inducira fuziju staničnih membrana, a zatim ih zasijava u hranjivu podlogu koja omogućava rast i reprodukciju samo hibridnih stanica (hibridoma). Hibridomi se razmnožavaju u tečnom mediju, gde dalje rastu i luče antitela u tečnost kulture, samo jedne vrste, i to u neograničenim količinama. Ova antitijela se nazivaju monoklonska. Da bi povećali učestalost stvaranja antitijela, pribjegavaju kloniranju hibridoma, tj. odabiru pojedinačnih kolonija hibridoma sposobnih da izazovu stvaranje najvećeg broja antitijela željenog tipa. Monoklonska antitijela su našla široku upotrebu u medicini za dijagnozu i liječenje brojnih bolesti. Međutim, najvažnija prednost monoklonske tehnologije je da može proizvesti antitijela protiv materijala koji se ne mogu pročistiti. Naprotiv, monoklonska antitijela se mogu dobiti protiv staničnih (plazma) membrana životinjskih neurona. Da bi se to postiglo, miševi se imuniziraju izoliranim neuronskim membranama, nakon čega se njihovi limfociti slezene kombinuju sa stanicama mijeloma, a zatim se postupi kako je gore opisano.

Rice. 131. Dobijanje monoklonskih antitijela

GENETSKO INŽENJERSTVO I MEDICINA

Genetski inženjering se pokazao vrlo perspektivnim za medicinu, prije svega u stvaranju novih tehnologija za proizvodnju fiziološki aktivnih proteina koji se koriste kao lijekovi (insulin, somatostatin, interferoni, somatotropin itd.).

Inzulin se koristi za liječenje pacijenata sa dijabetesom, koji je treći najčešći uzrok smrti (poslije bolesti srca i raka). Globalna potreba za inzulinom iznosi nekoliko desetina kilograma. Tradicionalno se dobiva iz žlijezda gušterače svinja i krava, ali se hormoni ovih životinja malo razlikuju od ljudskog inzulina. Svinjski inzulin se razlikuje u jednoj aminokiselini, dok se kravlji inzulin razlikuje u tri. Vjeruje se da životinjski inzulin često uzrokuje nuspojave. Iako se kemijska sinteza inzulina provodi dugo vremena, do sada je industrijska proizvodnja hormona ostala vrlo skupa. Sada se jeftin inzulin proizvodi metodom genetskog inženjeringa kemijsko-enzimskom sintezom inzulinskog gena, nakon čega slijedi uvođenje ovog gena u Escherichia coli, koja potom sintetizira hormon. Ovaj inzulin je više "biološki", jer je hemijski identičan insulinu koji proizvode ljudske ćelije pankreasa.

Interferoni su proteini koje sintetiziraju stanice uglavnom kao odgovor na infekciju tijela virusima. Interferone karakterizira specifičnost vrste. Na primjer, kod ljudi postoje tri grupe interferona koje proizvode različite stanice pod kontrolom odgovarajućih gena. Interes za interferone je određen činjenicom da se oni široko koriste u kliničkoj praksi za liječenje mnogih ljudskih bolesti, posebno virusnih.

Budući da su velike veličine, molekuli interferona nisu lako dostupni za sintezu. Stoga se većina interferona sada dobiva iz ljudske krvi, ali je prinos od ovog načina proizvodnje mali. U međuvremenu, potreba za interferonom je izuzetno velika. Ovo je postavilo zadatak pronalaženja efikasne metode za proizvodnju interferona u industrijskim količinama. Genetski inženjering je osnova moderne proizvodnje „bakterijskog“ interferona.

Povećao se utjecaj genetskog inženjeringa na tehnologiju onih ljekovitih supstanci koje su dugo stvarane biološkom tehnologijom. Još u 40-50-im godinama. XX vijek je napravljeno

biološka industrija za proizvodnju antibiotika, koji čine najefikasniji dio medicinskog arsenala moderne medicine. Međutim, posljednjih godina došlo je do značajnog porasta otpornosti bakterija na lijekove, posebno na antibiotike. Razlog je rasprostranjena distribucija plazmida koji određuju otpornost bakterija na lijekove u mikrobnom svijetu. Zbog toga su mnogi ranije poznati antibiotici izgubili svoju nekadašnju efikasnost. Jedini način da se prevaziđe rezistencija bakterija na antibiotike do sada je traženje novih antibiotika. Prema procjenama stručnjaka, u svijetu se svake godine stvori oko 300 novih antibiotika. Međutim, većina njih je ili neučinkovita ili toksična. Svake godine se u praksu uvodi svega nekoliko antibiotika, što nas tjera ne samo da održavamo, već i povećavamo kapacitete industrije antibiotika na temelju razvoja genetskog inženjeringa.

Osnovni zadaci genetskog inženjeringa u onim tehnologijama medicinskih supstanci u kojima su mikroorganizmi proizvođači lekova određeni su potrebom genetskog inženjeringa rekonstrukcije ovih poslednjih u cilju povećanja njihove aktivnosti. Na istom

Od tada je počela da se sprovodi ideja o stvaranju lekova u obliku malih molekula, što doprinosi njihovoj većoj efikasnosti.

Imunološka biotehnologija je prvenstveno povezana sa proizvodnjom vakcina nove generacije za prevenciju zaraznih bolesti ljudi i životinja. Prvi komercijalni proizvodi stvoreni genetskim inženjeringom bile su vakcine protiv humanog hepatitisa, slinavke i šapa i nekih drugih. Izuzetno važan pravac u ovoj oblasti vezan je za proizvodnju monoklonskih antitijela, reagenasa neophodnih za dijagnostiku patogena, kao i za pročišćavanje hormona, vitamina, proteina različite prirode (enzimi, toksini itd.).

Od značajnog praktičnog interesa je metoda proizvodnje vještačkog hemoglobina unošenjem gena hemoglobina u biljke duhana, gdje se pod kontrolom ovih gena proizvode α- i β-lanci globina koji se kombinuju u hemoglobin. Hemoglobin koji se sintetiše u ćelijama biljaka duvana je potpuno funkcionalan (veže kiseonik). Ćelijski inženjering, u primjeni na ljude, povezan je ne samo s rješavanjem temeljnih problema ljudske biologije, već i sa prevladavanjem, prije svega, ženske neplodnosti. Budući da je učestalost pozitivnih slučajeva implantacije embrija dobijenih u matericu žene in vitro, je mali, a zatim se dobijaju monozigotni embriji blizanaca in vitro takođe je važno, jer se povećavaju mogućnosti ponovljenih implantacija zbog “rezervnih” embriona. Od posebnog interesa su izgledi za korištenje matičnih stanica kao izvora zamjene stanica i tkiva u liječenju bolesti kao što su dijabetes, ozljede kičmene moždine, bol u srcu, osteoartritis i Parkinsonova bolest. Ali da bi se ostvarili ovi izgledi, potrebno je dubinsko proučavanje biologije matičnih ćelija.

U primeni genetskog inženjeringa u odnosu na medicinske probleme, poseban značaj dobija zadatak razvoja metoda genetskog inženjeringa za radikalno lečenje naslednih bolesti, koje se, nažalost, još uvek ne mogu lečiti postojećim metodama. Sadržaj ovog zadatka je da se razviju načini korekcije (normalizacije) mutacija koje rezultiraju nasljednim oboljenjima, te da se osigura prenošenje “korekcija” naslijeđem. Vjeruje se da će uspješan razvoj metoda genetskog inženjeringa za liječenje nasljednih bolesti biti

doprinose podacima o ljudskom genomu dobijenim kao rezultat međunarodnog naučnog programa „Ljudski genom“.

EKOLOŠKI PROBLEMI GENETSKOG INŽENJERSTVA

Podižući biotehnologiju na novi nivo, genetski inženjering je takođe našao primenu u razvoju načina za identifikaciju i eliminaciju zagađivača životne sredine. Posebno su konstruisani sojevi bakterija koji su jedinstveni pokazatelji mutagene aktivnosti hemijskih kontaminanata. S druge strane, sojevi bakterija su genetski modifikovani da sadrže plazmide, pod čijom kontrolom se odvija sinteza enzima koji su sposobni da unište mnoga hemijska jedinjenja koja zagađuju životnu sredinu. Konkretno, neke bakterije koje sadrže plazmid sposobne su razgraditi naftu i naftne derivate u bezopasne spojeve koji su dospjeli u okoliš kao rezultat raznih nesreća ili drugih nepovoljnih razloga.

Međutim, genetski inženjering je transformacija genetskog materijala koji ne postoji u prirodi. Shodno tome, proizvodi genetskog inženjeringa su potpuno novi proizvodi koji ne postoje u prirodi. Dakle, zbog nepoznate prirode svojih proizvoda, i sam je opasan kako za prirodu i okolinu, tako i za osoblje koje radi u laboratorijama u kojima koriste metode genetskog inženjeringa ili rade sa strukturama stvorenim tokom rada genetskog inženjeringa.

Kako su mogućnosti kloniranja gena neograničene, već na samom početku ovih istraživanja među naučnicima su se pojavila pitanja o prirodi organizama koji se stvaraju. Istovremeno, sugerisan je niz nepoželjnih posledica ove metodologije, a ove pretpostavke su našle i podršku u široj javnosti. Posebno su se pojavila neslaganja oko svojstava bakterija koje su primile životinjske gene u eksperimentima genetskog inženjeringa. Na primjer, zadržavaju li se bakterije E. coli njihovu vrstu identiteta zbog sadržaja unesenih gena životinjskog porijekla (na primjer gen za inzulin) ili ih treba smatrati novom vrstom? Nadalje, koliko su takve bakterije izdržljive, u kojim ekološkim nišama mogu

postoji? Ali najvažnija stvar je počela da se javlja zabrinutost da bi se tokom proizvodnje i manipulacije rekombinantnim molekulima DNK mogle stvoriti genetske strukture sa svojstvima koja su bila nepredviđena i opasna po ljudsko zdravlje za istorijski uspostavljenu ekološku ravnotežu. Istovremeno su počeli pozivi na moratorij na genetski inženjering. Ovi pozivi izazvali su međunarodnu negodovanje i doveli do međunarodne konferencije, koja je održana 1975. u Sjedinjenim Državama, na kojoj se naširoko raspravljalo o mogućim implikacijama istraživanja u ovoj oblasti. Zatim, u zemljama u kojima se genetski inženjering počeo razvijati, razvijena su pravila za rad sa rekombinantnim molekulima DNK. Ova pravila imaju za cilj spriječavanje ulaska proizvoda laboratorija genetskog inženjeringa u okolinu.

Drugi aspekt neželjenih posljedica rada genetskog inženjeringa povezan je sa opasnošću po zdravlje osoblja koje radi u laboratorijama u kojima se koriste metode genetskog inženjeringa, budući da se u takvim laboratorijama koriste fenol, etidijum bromid i UV zračenje, koji su faktori štetni po zdravlje. Osim toga, u ovim laboratorijama postoji mogućnost kontaminacije bakterijama koje sadrže rekombinantne DNK molekule koje kontroliraju neželjena svojstva, kao što je otpornost bakterija na lijekove. Ove i druge tačke određuju potrebu za poboljšanjem nivoa sigurnosti u radu genetskog inženjeringa.

Konačno, problemi opasnosti genetski modifikovanih proizvoda (genetski modifikovani paradajz, krompir, kukuruz, soja), kao i proizvoda kao što su hleb, paste, bombone, sladoled, sir, biljno ulje, proizvodi od mesa, koji u velikom broju o slučajevima se naširoko raspravlja u društvu, zemlje, posebno u SAD, postale su široko rasprostranjene. Tokom 12.000 godina poljoprivrede, ljudi su konzumirali hranu koja dolazi iz prirodnih izvora. Stoga se pretpostavlja da će genetski modificirana hrana unijeti nove toksine, alergene, bakterije i karcinogene u ljudski organizam, što će dovesti do potpuno novih bolesti za buduće generacije. Ovo postavlja pitanje istinske naučne procene genetski modifikovane hrane.

PITANJA ZA DISKUSIJU

1. Šta se podrazumijeva pod genetskim, ćelijskim i genetskim inženjeringom? Postoji li razlika između ovih koncepata i molekularnog kloniranja?

2. Koja je progresivnost genetskog inženjeringa u odnosu na druge metode koje se koriste u biologiji?

3. Navedite glavne “alatke” genetskog inženjeringa.

4. Šta su restrikcijski enzimi, koja su njihova svojstva i uloga u genetskom inženjeringu?

5. Da li svi restrikcijski enzimi formiraju “ljepljive” krajeve DNK koja se proučava i da li struktura “ljepljivih” krajeva ovisi o vrsti restrikcijskog enzima?

6. Definirajte genetske vektore. Postoje li prirodni vektori?

7. Kako se genetski vektori dobijaju u laboratoriji? Koji biološki objekti su polazni materijal za dobijanje vektora?

8. Koja je maksimalna dužina sekvenci azotnih baza DNK koje se još mogu uključiti u genetski vektor? Da li se vektori razlikuju po "snazi"?

9. Okarakterizirati svojstva DNK ligaze i odrediti njenu ulogu u genetskom inženjeringu.

10. Kako je klonirani DNK segment (gen) povezan sa genetskim vektorom?

11. Koja je učestalost uvođenja rekombinantnih DNK molekula u bakterijske ćelije?

12. Na kom principu se zasniva selekcija bakterijskih ćelija koje sadrže rekombinantne DNK molekule? Navedite jedan primjer takvog odabira.

14. Mnogi sojevi bakterija imaju iste enzime koji osiguravaju njihov metabolizam na gotovo isti način. U međuvremenu, nukleotidna specifičnost bakterijskih restrikcijskih modifikacija sistema je drugačija. Možete li objasniti ovaj fenomen?

15. Zašto sekvence DNK koje predstavljaju mjesta za prepoznavanje restrikcijskih enzima ne mogu sadržavati više od osam parova baza?

16. Koliko puta će se sekvenca HGC, koju prepoznaje restrikcijski enzim Hae III, pojaviti u segmentu DNK od 50.000 baznih parova sa 30, 50 i 70 posto sadržaja GC?

17. Restrikcioni enzimi Bam HI i Bgl I tope sekvence G GATCC i T GATCA, respektivno. Da li je moguće uključiti fragmente DNK proizvedene Bgl I restrikcijom u Bam HI mjesto? Ako jeste, zašto? Ako korišteni plazmid (vektor) sadrži jedno Bgl I restrikcijsko mjesto, na kojem hranljivom mediju se taj plazmid može odabrati za bakterije?

18. Izračunajte učestalost bakterijske transformacije po molekulu DNK ako se formira 5-10 5 transformanata na 5000 baznih parova plazmida?

19. Da li je moguće klonirati tačku replikacije DNK 0? E. coli i ako da, kako?

20. Da li je moguće odrediti koliko je DNK molekula potrebno za transformaciju jedne ćelije? E. coli?

21. Da li je moguće odrediti mjesto spajanja na mRNA pomoću lančane reakcije polimeraze?

22. Kako se lančana reakcija polimeraze može koristiti za uvođenje željenog restriktivnog mjesta na mjesto od interesa na fragmentu DNK koji se klonira?

23. Navedite metode ćelijskog inženjeringa primijenjene na životinje. Koja je ekonomska vrijednost životinja proizvedenih ovim metodama?

24. Definirajte pojmove “transgene biljke” i “transgene životinje”. Da li transgeni organizmi zadržavaju svoj identitet vrste ili se mogu smatrati organizmima novih vrsta?

25. Šta su hibridomi i monoklonska antitela? Kako ih dobijate?

26. Da li je ćelijski inženjering primjenjiv na ljude?

27. Pretpostavimo da je ubrizgavanje stranog DNK u mišje jaje i implantacija ovako oplođenog jajeta u tijelo miša rezultirala trudnoćom i rođenjem miševa koji sadrže kopije ubrizgane DNK u genomu. Međutim, mali miševi su se ispostavili kao mozaici, tj. Neke njihove ćelije sadrže kopije ubrizgane DNK, druge nemaju ovu DNK. Možete li objasniti prirodu ovog fenomena?

28. Smatrate li hranu pripremljenu od genetski modificiranih proizvoda genetski opasnom?

29. Da li je potrebno naučno testiranje genetski modifikovane hrane?

Znanje je određeno onim što potvrđujemo kao Istinu.

P.A. Florenski, 1923

GENETIČKI INŽENJERING, skup metoda biohemije i molekularne genetike, uz pomoć kojih se vrši usmjerena kombinacija genetskih informacija bilo kojeg organizma. Genetski inženjering omogućava prevazilaženje prirodnih međuvrstskih barijera koje onemogućavaju razmjenu genetskih informacija između taksonomski udaljenih vrsta organizama, te stvaranje ćelija i organizama s kombinacijama gena kojih u prirodi nema, sa određenim naslijeđenim svojstvima. Glavni objekt uticaja genetskog inženjeringa je nosilac genetske informacije - deoksiribonukleinska kiselina (DNK), čiji se molekul obično sastoji od dva lanca. Stroga specifičnost uparivanja purinskih i pirimidinskih baza određuje svojstvo komplementarnosti - međusobnu korespondenciju nukleotida u dva lanca. Stvaranje novih kombinacija gena pokazalo se mogućim zbog fundamentalne sličnosti u strukturi molekula DNK u svim vrstama organizama, a stvarna univerzalnost genetskog koda osigurava ekspresiju stranih gena (manifestaciju njihove funkcionalne aktivnosti) u bilo kojoj vrsti ćelije. Tome je doprinijelo i akumuliranje znanja iz oblasti hemije nukleinskih kiselina, identifikacija molekularnih karakteristika organizacije i funkcionisanja gena (uključujući uspostavljanje mehanizama za regulaciju njihove ekspresije i mogućnost podređivanja gena delovanju gena). stranih” regulatornih elemenata), razvoj metoda sekvenciranja DNK, otkriće lančane reakcije polimeraze, koja je omogućila brzu sintetizaciju bilo kojeg fragmenta DNK. Važni preduvjeti za nastanak genetskog inženjeringa bili su: otkriće plazmida sposobnih za autonomnu replikaciju i prijenos iz jedne bakterijske ćelije u drugu, te fenomen transdukcije - prijenos određenih gena bakteriofagom, što je omogućilo formuliranje ideje o vektori: molekuli - nosioci gena. Enzimi uključeni u transformaciju nukleinskih kiselina odigrali su ogromnu ulogu u razvoju metodologije genetskog inženjeringa: restrikcijski enzimi (prepoznaju striktno definirane sekvence - mjesta - u molekulama DNK i "presijeku" dvostruki lanac na tim mjestima), DNK ligaze (kovalentno se vežu pojedinačni fragmenti DNK), reverzna transkriptaza (sintetizuje komplementarnu kopiju DNK, ili cDNK, na RNK šablonu) itd. Tek sa njihovom dostupnošću, stvaranje veštačkih struktura postalo je tehnički izvodljiv zadatak. Enzimi se koriste za dobijanje pojedinačnih DNK fragmenata (gena) i stvaranje molekularnih hibrida - rekombinantne DNK (recDNA) zasnovane na DNK plazmida i virusa. Potonji isporučuju željeni gen u ćeliju domaćina, osiguravajući njegovu reprodukciju tamo (kloniranje) i formiranje konačnog genskog produkta (njegovu ekspresiju).

Principi stvaranja rekombinantnih molekula DNK. Termin “genetski inženjering” postao je raširen nakon što su P. Berg i njegove kolege prvi put dobili rekombinantnu DNK 1972. godine, koja je bila hibrid u kojem su fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenog virusa (bakteriofaga λ) i DNK virusa majmuna SV40. kombinovano (slika 1). Godine 1973. S. Cohen i saradnici su koristili plazmid pSC101 i restrikcijski enzim (EcoRI), koji ga razbija na jednom mjestu na način da se formiraju kratki komplementarni jednolančani "repovi" (obično 4-6 nukleotida). na krajevima dvolančane DNK molekule. Nazivaju se "ljepljivim" jer se mogu pariti (kao da se drže zajedno) jedno s drugim. Kada se takva DNK pomiješa s fragmentima strane DNK tretirane istim restrikcijskim enzimom i imaju iste ljepljive krajeve, dobijeni su novi hibridni plazmidi, od kojih je svaki sadržavao najmanje jedan fragment strane DNK umetnut u EcoRI mjesto plazmida (Sl. 2) . Postalo je očigledno da se u takve plazmide mogu ubaciti fragmenti različitih stranih DNK dobijenih i od mikroorganizama i od viših eukariota.

Glavna moderna strategija za dobijanje recDNK je sljedeća:

1) fragmenti DNK koji pripadaju drugom organizmu koji sadrže određene gene ili vještački dobijene nukleotidne sekvence od interesa za istraživača se ubacuju u DNK plazmida ili virusa koji se može razmnožavati nezavisno od hromozoma;

2) dobijeni hibridni molekuli se uvode u osetljive prokariotske ili eukariotske ćelije, gde se repliciraju (umnožavaju, amplificiraju) zajedno sa DNK fragmentima ugrađenim u njih;

3) ćelijski klonovi se biraju u obliku kolonija na posebnim hranljivim podlogama (ili virusi u obliku čistih zona - plakova na sloju kontinuiranog rasta bakterijskih ćelija ili kultura životinjskog tkiva), koji sadrže potrebne vrste recDNA molekula i subjekta na sveobuhvatne strukturne i funkcionalne studije. Da bi se olakšala selekcija ćelija u kojima je prisutna recDNK, koriste se vektori koji sadrže jedan ili više markera. U plazmidima, na primjer, geni otpornosti na antibiotike mogu poslužiti kao takvi markeri (ćelije koje sadrže recDNK se biraju na osnovu njihove sposobnosti da rastu u prisustvu određenog antibiotika). RecDNA koja nosi željene gene se odabire i uvodi u ćelije primaoca. Od ovog trenutka počinje molekularno kloniranje - dobijanje kopija recDNK, a samim tim i kopija ciljnih gena u njegovom sastavu. Samo ako je moguće razdvojiti sve transficirane ili inficirane stanice, svaki klon će biti predstavljen zasebnom kolonijom stanica i sadržavat će specifičnu recDNK. U završnoj fazi vrši se identifikacija (pretraga) klonova koji sadrže željeni gen. Zasniva se na činjenici da umetanje u recDNK određuje neko jedinstveno svojstvo ćelije koja ga sadrži (na primjer, ekspresioni proizvod umetnutog gena). U eksperimentima molekularnog kloniranja, primjećuju se 2 osnovna principa: nijedna ćelija u kojoj se kloniranje recDNK ne smije primiti više od jednog molekula plazmida ili virusne čestice; potonji mora biti sposoban za replikaciju.

Širok spektar plazmidnih i virusnih DNK se koristi kao vektorski molekul u genetskom inženjeringu. Najpopularniji vektori za kloniranje sadrže nekoliko genetskih markera i imaju jedno mjesto djelovanja za različite restrikcijske enzime. Takve zahtjeve, na primjer, najbolje ispunjava plazmid pBR322, koji je konstruiran od prvobitno prirodnog plazmida korištenjem metoda korištenih pri radu sa recDNK; sadrži gene za otpornost na ampicilin i tetraciklin, kao i jedno mjesto za prepoznavanje za 19 različitih restrikcijskih enzima. Poseban slučaj vektora za kloniranje su ekspresioni vektori, koji uz amplifikaciju osiguravaju ispravnu i efikasnu ekspresiju stranih gena u ćelijama primaocima. U nekim slučajevima, molekularni vektori mogu osigurati integraciju strane DNK u genom ćelije ili virusa (nazivaju se integrativni vektori).

Jedan od najvažnijih zadataka genetskog inženjeringa je stvaranje sojeva bakterija ili kvasca, ćelijskih linija životinjskih ili biljnih tkiva, kao i transgenih biljaka i životinja (vidi Transgeni organizmi), koji bi osigurali efikasnu ekspresiju gena kloniranih u njima. Visok nivo proizvodnje proteina postiže se kada se geni kloniraju u vektorima sa više kopija, jer u ovom slučaju, ciljni gen će biti prisutan u velikim količinama u ćeliji. Važno je da sekvenca koja kodira DNK bude pod kontrolom promotora koji je efektivno prepoznat od ćelijske RNK polimeraze, i da je rezultujuća mRNA relativno stabilna i efikasno prevedena. Osim toga, strani protein sintetiziran u stanicama primatelja ne bi trebao biti podložan brzoj degradaciji unutarćelijskih proteaza. Prilikom stvaranja transgenih životinja i biljaka često se postiže tkivno specifična ekspresija uvedenih ciljnih gena.

Budući da je genetski kod univerzalan, mogućnost ekspresije gena određena je samo prisustvom u njegovom sastavu signala za inicijaciju i završetak transkripcije i translacije, ispravno prepoznatih od strane ćelije domaćina. Budući da većina gena viših eukariota ima diskontinuiranu ekson-intron strukturu, kao rezultat transkripcije takvih gena, formira se prekursorska glasnička RNA (pre-mRNA) iz koje se, tokom naknadnog spajanja, nekodiraju sekvence - introni - se odvajaju i formira se zrela mRNA. Takvi geni se ne mogu eksprimirati u bakterijskim ćelijama gdje ne postoji sistem spajanja. Da bi se ova prepreka savladala, kopija DNK (cDNK) se sintetiše na zrelim mRNA molekulima pomoću reverzne transkriptaze, kojoj se drugi lanac dodaje pomoću DNK polimeraze. Takvi fragmenti DNK koji odgovaraju sekvenci kodirajućeg gena (više nisu odvojeni nitronima) mogu se umetnuti u odgovarajući molekularni vektor.

Poznavajući sekvencu aminokiselina ciljnog polipeptida, moguće je sintetizirati nukleotidnu sekvencu koja ga kodira, dobivši takozvani ekvivalentni gen, i integrirati ga u odgovarajući ekspresijski vektor. Prilikom kreiranja ekvivalentnog gena obično uzimaju u obzir degeneraciju genetskog koda (20 aminokiselina je kodirano 61 kodonom) i učestalost pojavljivanja kodona za svaku aminokiselinu u stanicama u koje se planira uvesti ovaj gen. , budući da se sastav kodona može značajno razlikovati u različitim organizmima. Pravilno odabrani kodoni mogu značajno povećati proizvodnju ciljnog proteina u ćeliji primaocu.

Važnost genetskog inženjeringa. Genetski inženjering je značajno proširio eksperimentalne granice molekularne biologije, jer je postalo moguće uvesti stranu DNK u različite vrste ćelija i proučavati njene funkcije. To je omogućilo da se identifikuju opšti biološki obrasci organizacije i izražavanja genetskih informacija u različitim organizmima. Ovaj pristup je otvorio izglede za stvaranje fundamentalno novih mikrobioloških proizvođača biološki aktivnih supstanci, kao i životinja i biljaka koje nose funkcionalno aktivne strane gene. Mnogi ranije nedostupni biološki aktivni ljudski proteini, uključujući interferone, interleukine, peptidne hormone, krvne faktore, počeli su se proizvoditi u velikim količinama u ćelijama bakterija, kvasca ili sisara i naširoko se koriste u medicini. Štoviše, postalo je moguće umjetno stvoriti gene koji kodiraju himerne polipeptide koji imaju svojstva dva ili više prirodnih proteina. Sve je to dalo snažan poticaj razvoju biotehnologije.

Glavni objekti genetskog inženjeringa su bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) i Bacilltis subtilis (bacillus hay), pekarski kvasac Saccharomices cerevisiae i različite ćelijske linije sisara. Spektar objekata uticaja genetskog inženjeringa stalno se širi. Intenzivno se razvijaju istraživačke oblasti stvaranja transgenih biljaka i životinja. Najnovije generacije cjepiva protiv različitih infektivnih uzročnika stvaraju se metodama genetskog inženjeringa (prva od njih stvorena je na bazi kvasca koji proizvodi površinski protein humanog virusa hepatitisa B). Velika pažnja posvećena je razvoju vektora za kloniranje na bazi virusa sisara i njihovoj upotrebi za stvaranje živih polivalentnih vakcina za veterinarske i medicinske potrebe, kao i molekularnih vektora za gensku terapiju tumora raka i nasljednih bolesti. Razvijena je metoda za direktno uvođenje recDNK u organizam ljudi i životinja, usmjeravajući proizvodnju antigena različitih infektivnih agenasa u njihovim stanicama (DNK vakcinacija). Najnoviji pravac genetskog inženjeringa je stvaranje jestivih vakcina na bazi transgenih biljaka, kao što su paradajz, šargarepa, krompir, kukuruz, zelena salata, itd., koje proizvode imunogene proteine ​​infektivnih agenasa.

Zabrinutosti povezane s eksperimentima genetskog inženjeringa. Ubrzo nakon prvih uspješnih eksperimenata na dobivanju recDNK, grupa naučnika predvođena P. Bergom predložila je ograničavanje provođenja niza eksperimenata genetskog inženjeringa. Ova zabrinutost bila je zasnovana na činjenici da je teško predvidjeti svojstva organizama koji sadrže strane genetske informacije. Mogu dobiti nepoželjne karakteristike, poremetiti ekološku ravnotežu i dovesti do pojave i širenja neobičnih bolesti kod ljudi, životinja i biljaka. Osim toga, uočeno je da je ljudska intervencija u genetski aparat živih organizama nemoralna i može uzrokovati nepoželjne društvene i etičke posljedice. 1975. o ovim problemima se raspravljalo na međunarodnoj konferenciji u Asilomaru (SAD). Učesnici su došli do zaključka da je potrebno nastaviti korištenje metoda genetskog inženjeringa, ali uz obavezno poštivanje određenih pravila i preporuka. Naknadno su ova pravila, ustanovljena u nizu zemalja, značajno relaksirana i svedena na tehnike uobičajene u mikrobiološkim istraživanjima, stvaranje posebnih zaštitnih uređaja koji sprečavaju širenje bioloških agenasa u životnoj sredini, upotrebu sigurnih vektora i ćelija recipijenata koji ne razmnožavaju se u prirodnim uslovima.

Često se genetski inženjering shvata samo kao rad sa recDNK, a izrazi "molekularno kloniranje", "kloniranje DNK" i "kloniranje gena" se koriste kao sinonimi za genetski inženjering. Međutim, svi ovi koncepti odražavaju sadržaj samo pojedinačnih operacija genetskog inženjeringa i stoga nisu ekvivalentni pojmu “genetski inženjering”. U Rusiji se izraz "genetski inženjering" široko koristi kao sinonim za genetski inženjering. Međutim, semantički sadržaj ovih pojmova je drugačiji: genetski inženjering ima za cilj stvaranje organizama s novim genetskim programom, dok termin “genetski inženjering” objašnjava kako se to radi – manipulacijom genima.

Lit.: Shchelkunov S. N. Kloniranje gena. Novosibirsk, 1986; aka. Genetski inženjering. 2. izdanje, Novosibirsk, 2004; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinantna DNK. M., 1986; Kloniranje DNK. Metode. M., 1988; Novo u kloniranju DNK: Metode. M., 1989.

Ekonomski značaj

Genetski inženjering služi za dobijanje željenih kvaliteta promenljivog ili genetski modifikovanog organizma. Za razliku od tradicionalne selekcije, tokom koje je genotip podložan promjenama samo indirektno, genetski inženjering omogućava direktnu intervenciju u genetskom aparatu tehnikom molekularnog kloniranja. Primjeri primjene genetskog inženjeringa su proizvodnja novih genetski modificiranih sorti žitarica, proizvodnja humanog inzulina korištenjem genetski modificiranih bakterija, proizvodnja eritropoetina u ćelijskoj kulturi ili nove rase eksperimentalnih miševa za naučna istraživanja.

Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska ćelija. Ćelije neophodne za industrijsku proizvodnju biraju se prema određenim karakteristikama, od kojih je najvažnija sposobnost da proizvedu, sintetiziraju, u najvećim mogućim količinama, određeno jedinjenje - aminokiselinu ili antibiotik, steroidni hormon ili organsku kiselinu. . Ponekad morate imati mikroorganizam koji može, na primjer, iskoristiti ulje ili otpadnu vodu kao “hranu” i preraditi ih u biomasu ili čak proteine ​​koji su sasvim prikladni za dodatke stočnoj hrani. Ponekad su nam potrebni organizmi koji se mogu razviti na povišenim temperaturama ili u prisustvu supstanci koje su sigurno smrtonosne za druge vrste mikroorganizama.

Zadatak dobivanja takvih industrijskih sojeva je vrlo važan, za njihovu modifikaciju i selekciju razvijene su brojne metode aktivnog utjecaja na ćeliju - od tretmana snažnim otrovima do radioaktivnog zračenja. Cilj ovih tehnika je jedan - postići promjene u nasljednom, genetskom aparatu ćelije. Njihov rezultat je proizvodnja brojnih mutantnih mikroba, od kojih na stotine i hiljade naučnici potom pokušavaju odabrati najprikladnije za određenu svrhu. Stvaranje metoda hemijske ili radijacijske mutageneze bilo je izvanredno dostignuće biologije i široko se koristi u modernim biotehnologija.

Ali njihove mogućnosti su ograničene prirodom samih mikroorganizama. Nisu u stanju sintetizirati niz vrijednih supstanci koje se akumuliraju u biljkama, prvenstveno u ljekovitom i eteričnom ulju. Ne mogu sintetizirati tvari koje su vrlo važne za život životinja i ljudi, brojne enzime, peptidne hormone, imune proteine, interferone i mnoge jednostavnije spojeve koji se sintetiziraju u tijelu životinja i ljudi. Naravno, mogućnosti mikroorganizama su daleko od iscrpljenosti. Od cjelokupnog obilja mikroorganizama, nauka, a posebno industrija, koristi samo mali dio. Za potrebe selekcije mikroorganizama od velikog su interesa, na primjer, anaerobne bakterije sposobne živjeti u nedostatku kisika, fototrofi koji koriste svjetlosnu energiju poput biljaka, kemoautotrofi, termofilne bakterije sposobne živjeti na temperaturama, kako je nedavno otkriveno, oko 110°C itd.

Pa ipak, ograničenja “prirodnog materijala” su očigledna. Pokušavali su i pokušavaju zaobići ograničenja uz pomoć kultura stanica i tkiva biljaka i životinja. Ovo je veoma važan i perspektivan put, koji se takođe sprovodi u biotehnologija. Tokom proteklih nekoliko decenija, naučnici su razvili metode pomoću kojih se pojedinačne ćelije tkiva biljke ili životinje mogu naterati da rastu i razmnožavaju se odvojeno od tela, poput ćelija bakterija. Ovo je bilo važno postignuće - dobivene ćelijske kulture se koriste za eksperimente i za industrijsku proizvodnju određenih supstanci koje se ne mogu dobiti bakterijskim kulturama.

Istorija razvoja i dostignuti nivo tehnologije

U drugoj polovini 20. veka došlo je do nekoliko važnih otkrića i izuma koji su u osnovi genetski inženjering. Višegodišnji pokušaji da se „pročitaju“ biološke informacije koje su „zapisane“ u genima uspješno su završene. Ovaj rad započeli su engleski naučnik F. Sanger i američki naučnik W. Gilbert (Nobelova nagrada za hemiju). Kao što je poznato, geni sadrže informacije-instrukcije za sintezu RNK molekula i proteina, uključujući enzime, u tijelu. Da bi se stanica prisilila da sintetizira nove tvari koje su za nju neuobičajene, potrebno je da se u njoj sintetiziraju odgovarajući skupovi enzima. A za to je potrebno ili namjerno promijeniti gene koji se nalaze u njemu, ili u njega uvesti nove, ranije odsutne gene. Promjene gena u živim stanicama su mutacije. Nastaju pod utjecajem, na primjer, mutagena - hemijskih otrova ili zračenja. Ali takve promjene se ne mogu kontrolirati niti usmjeravati. Stoga su naučnici svoje napore usmjerili na pokušaje da razviju metode za uvođenje novih, vrlo specifičnih gena potrebnih ljudima u ćelije.

Glavne faze rješavanja problema genetskog inženjeringa su sljedeće:

1. Dobivanje izolovanog gena. 2. Uvođenje gena u vektor za prijenos u tijelo. 3. Transfer vektora sa genom u modifikovani organizam. 4. Transformacija tjelesnih ćelija. 5. Selekcija genetski modifikovanih organizama ( GMO) i eliminisanje onih koji nisu uspješno modificirani.

Proces sinteze gena je sada vrlo dobro razvijen i čak u velikoj mjeri automatiziran. Postoje posebni uređaji opremljeni kompjuterima, u čijoj se memoriji pohranjuju programi za sintezu različitih nukleotidnih sekvenci. Ovaj aparat sintetiše DNK segmente dužine do 100-120 azotnih baza (oligonukleotida). Tehnika je postala široko rasprostranjena koja omogućava korištenje lančane reakcije polimeraze za sintezu DNK, uključujući mutantnu DNK. U njemu se za sintezu DNK šablona koristi termostabilni enzim DNK polimeraza, za koju se kao sjeme koriste umjetno sintetizirani komadići nukleinske kiseline – oligonukleotidi. Enzim reverzna transkriptaza omogućava, koristeći takve prajmere, da sintetiše DNK na šablonu RNK izolovane iz ćelija. DNK sintetizirana na ovaj način naziva se komplementarna DNK (RNA) ili cDNK. Izolovani, "hemijski čist" gen se takođe može dobiti iz biblioteke faga. Ovo je naziv preparata bakteriofaga, u čiji genom su ugrađeni nasumični fragmenti genoma ili cDNK, koje fag reprodukuje zajedno sa svom svojom DNK.

Tehnika uvođenja gena u bakterije razvijena je nakon što je Frederick Griffith otkrio fenomen bakterijske transformacije. Ovaj fenomen se zasniva na primitivnom seksualnom procesu, koji je u bakterijama praćen razmjenom malih fragmenata nehromozomske DNK, plazmida. Plazmidne tehnologije bile su osnova za uvođenje umjetnih gena u bakterijske stanice.

Značajne poteškoće bile su povezane s uvođenjem gotovog gena u nasljedni aparat biljnih i životinjskih stanica. Međutim, u prirodi postoje slučajevi kada se strana DNK (virusa ili bakteriofaga) uključi u genetski aparat ćelije i uz pomoć svojih metaboličkih mehanizama počinje sintetizirati "svoj" protein. Naučnici su proučavali karakteristike unošenja stranog DNK i koristili ga kao princip za uvođenje genetskog materijala u ćeliju. Ovaj proces se naziva transfekcija.

Ako su jednoćelijski organizmi ili višećelijske kulture ćelija podložni modifikaciji, tada u ovoj fazi počinje kloniranje, odnosno selekcija onih organizama i njihovih potomaka (klonova) koji su prošli modifikaciju. Kada je zadatak dobijanje višećelijskih organizama, ćelije sa izmenjenim genotipom se koriste za vegetativno razmnožavanje biljaka ili se unose u blastociste surogat majke kada su u pitanju životinje. Kao rezultat toga, mladunci se rađaju sa promijenjenim ili nepromijenjenim genotipom, među kojima se biraju i ukrštaju samo oni koji pokazuju očekivane promjene.

Primjena u naučnim istraživanjima

Iako u malom obimu, genetski inženjering se već koristi kako bi se ženama s nekim vrstama neplodnosti dala šansa da zatrudne. U tu svrhu koriste se jaja od zdrave žene. Kao rezultat, dijete nasljeđuje genotip od jednog oca i dvije majke.

Međutim, mogućnost značajnijih promjena u ljudskom genomu suočava se s nizom ozbiljnih etičkih problema.