1. Δυνατότητες γενετικής μηχανικής. 4

2. Ιστορία της γενετικής μηχανικής. 6

3. Η γενετική μηχανική ως επιστήμη. Μέθοδοι γενετικής μηχανικής. 10

4. Τομείς εφαρμογής της γενετικής μηχανικής. 12

5. Επιστημονικά στοιχεία για τους κινδύνους της γενετικής μηχανικής. 18

Συμπέρασμα. 22

Αναφορές.. 23

Εισαγωγή

Το θέμα της γενετικής μηχανικής έχει γίνει πρόσφατα όλο και πιο δημοφιλές. Δίνεται μεγαλύτερη προσοχή στις αρνητικές συνέπειες που μπορεί να οδηγήσει η ανάπτυξη αυτού του κλάδου της επιστήμης και πολύ μικρή κάλυψη δίνεται στα οφέλη που μπορεί να επιφέρει η γενετική μηχανική.

Ο πιο πολλά υποσχόμενος τομέας εφαρμογής είναι η παραγωγή φαρμάκων με χρήση τεχνολογιών γενετικής μηχανικής. Πρόσφατα, κατέστη δυνατή η λήψη χρήσιμων εμβολίων με βάση διαγονιδιακά φυτά. Εξίσου μικρότερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η παραγωγή προϊόντων διατροφής που χρησιμοποιούν τις ίδιες τεχνολογίες.

Η γενετική μηχανική είναι η επιστήμη του μέλλοντος. Αυτή τη στιγμή, σε όλο τον κόσμο, εκατομμύρια εκτάρια γης σπέρνονται με διαγονιδιακά φυτά, δημιουργούνται μοναδικά ιατρικά σκευάσματα και νέοι παραγωγοί χρήσιμων ουσιών. Με την πάροδο του χρόνου, η γενετική μηχανική θα καταστήσει δυνατή την επίτευξη νέων προόδων στην ιατρική, τη γεωργία, τη βιομηχανία τροφίμων και την κτηνοτροφία.

Σκοπός αυτής της εργασίας είναι να μελετήσει τα χαρακτηριστικά της δυνατότητας, το ιστορικό ανάπτυξης και τους τομείς εφαρμογής της γενετικής μηχανικής.

1. Δυνατότητες γενετικής μηχανικής

Ένα σημαντικό μέρος της βιοτεχνολογίας είναι η γενετική μηχανική. Γεννημένη στις αρχές της δεκαετίας του '70, έχει σημειώσει μεγάλη επιτυχία σήμερα. Οι τεχνικές γενετικής μηχανικής μετατρέπουν κύτταρα βακτηρίων, ζυμομυκήτων και θηλαστικών σε «εργοστάσια» για τη μεγάλης κλίμακας παραγωγή οποιασδήποτε πρωτεΐνης. Αυτό καθιστά δυνατή τη λεπτομερή ανάλυση της δομής και των λειτουργιών των πρωτεϊνών και τη χρήση τους ως φάρμακα. Επί του παρόντος, η Escherichia coli (E. coli) έχει γίνει προμηθευτής τόσο σημαντικών ορμονών όπως η ινσουλίνη και η σωματοτροπίνη. Παλαιότερα, η ινσουλίνη λαμβανόταν από ζωικά παγκρεατικά κύτταρα, επομένως το κόστος της ήταν πολύ υψηλό. Για να ληφθούν 100 g κρυσταλλικής ινσουλίνης απαιτούνται 800-1000 kg παγκρέατος και ένας αδένας αγελάδας ζυγίζει 200 ​​- 250 γραμμάρια. Αυτό έκανε την ινσουλίνη ακριβή και δυσπρόσιτη για ένα ευρύ φάσμα διαβητικών. Το 1978, ερευνητές από την Genentech παρήγαγαν για πρώτη φορά ινσουλίνη σε ένα ειδικά κατασκευασμένο στέλεχος Escherichia coli. Η ινσουλίνη αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες Α και Β, μήκους 20 και 30 αμινοξέων. Όταν συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς, σχηματίζεται φυσική ινσουλίνη διπλής αλυσίδας. Έχει αποδειχθεί ότι δεν περιέχει πρωτεΐνες E. coli, ενδοτοξίνες και άλλες ακαθαρσίες, δεν προκαλεί παρενέργειες όπως η ζωική ινσουλίνη και δεν έχει βιολογική δράση

είναι διαφορετικό. Στη συνέχεια, συντέθηκε προϊνσουλίνη σε κύτταρα E. coli, για τα οποία συντέθηκε ένα αντίγραφο DNA σε ένα εκμαγείο RNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση. Μετά τον καθαρισμό της προϊνσουλίνης που προέκυψε, χωρίστηκε σε φυσική ινσουλίνη, ενώ τα στάδια εκχύλισης και απομόνωσης της ορμόνης ελαχιστοποιήθηκαν. Από 1000 λίτρα υγρού καλλιέργειας, μπορούν να ληφθούν έως και 200 ​​γραμμάρια της ορμόνης, που ισοδυναμεί με την ποσότητα ινσουλίνης που εκκρίνεται από 1600 κιλά παγκρέατος ενός χοίρου ή μιας αγελάδας.

Η σωματοτροπίνη είναι μια ανθρώπινη αυξητική ορμόνη που εκκρίνεται από την υπόφυση. Η ανεπάρκεια αυτής της ορμόνης οδηγεί σε νανισμό της υπόφυσης. Εάν η σωματοτροπίνη χορηγείται σε δόσεις των 10 mg ανά κιλό σωματικού βάρους τρεις φορές την εβδομάδα, τότε σε ένα χρόνο ένα παιδί που πάσχει από την έλλειψή της μπορεί να αυξηθεί κατά 6 εκ. Παλαιότερα, λαμβανόταν από πτωματικό υλικό, από ένα πτώμα: 4 - 6 mg σωματοτροπίνης ως προς το τελικό φαρμακευτικό προϊόν. Έτσι, οι διαθέσιμες ποσότητες της ορμόνης ήταν περιορισμένες, επιπλέον, η ορμόνη που λαμβανόταν με αυτή τη μέθοδο ήταν ετερογενής και μπορούσε να περιέχει ιούς βραδείας ανάπτυξης. Το 1980, η εταιρεία Genentec ανέπτυξε μια τεχνολογία για την παραγωγή σωματοτροπίνης χρησιμοποιώντας βακτήρια, η οποία δεν είχε αυτά τα μειονεκτήματα. Το 1982, η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη ελήφθη σε καλλιέργεια E. coli και ζωικών κυττάρων στο Ινστιτούτο Παστέρ στη Γαλλία και το 1984 ξεκίνησε η βιομηχανική παραγωγή ινσουλίνης στην ΕΣΣΔ. Στην παραγωγή ιντερφερόνης χρησιμοποιούνται τόσο E. coli, S. cerevisae (ζυμομύκητα) όσο και καλλιέργεια ινοβλαστών ή μετασχηματισμένων λευκοκυττάρων. Με παρόμοιες μεθόδους λαμβάνονται επίσης ασφαλή και φθηνά εμβόλια.

Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA βασίζεται στην παραγωγή πολύ ειδικών ανιχνευτών DNA, οι οποίοι χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων στους ιστούς, τον εντοπισμό γονιδίων στα χρωμοσώματα και την αναγνώριση γονιδίων με σχετικές λειτουργίες (για παράδειγμα, σε ανθρώπους και κοτόπουλο). Οι ανιχνευτές DNA χρησιμοποιούνται επίσης στη διάγνωση διαφόρων ασθενειών.

Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA κατέστησε δυνατή μια μη συμβατική προσέγγιση γονιδίων πρωτεΐνης που ονομάζεται αντίστροφη γενετική. Σε αυτή την προσέγγιση, μια πρωτεΐνη απομονώνεται από ένα κύτταρο, το γονίδιο αυτής της πρωτεΐνης κλωνοποιείται και τροποποιείται, δημιουργώντας ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που κωδικοποιεί μια αλλοιωμένη μορφή της πρωτεΐνης. Το προκύπτον γονίδιο εισάγεται στο κύτταρο. Εάν εκφραστεί, το κύτταρο που το φέρει και οι απόγονοί του θα συνθέσουν την τροποποιημένη πρωτεΐνη. Με αυτόν τον τρόπο μπορούν να διορθωθούν τα ελαττωματικά γονίδια και να αντιμετωπιστούν οι κληρονομικές ασθένειες.

Εάν το υβριδικό DNA εισαχθεί σε ένα γονιμοποιημένο ωάριο, μπορούν να παραχθούν διαγονιδιακοί οργανισμοί που εκφράζουν το μεταλλαγμένο γονίδιο και το μεταδίδουν στους απογόνους τους. Ο γενετικός μετασχηματισμός των ζώων καθιστά δυνατό τον καθορισμό του ρόλου των μεμονωμένων γονιδίων και των πρωτεϊνικών τους προϊόντων τόσο στη ρύθμιση της δραστηριότητας άλλων γονιδίων όσο και σε διάφορες παθολογικές διεργασίες. Με τη βοήθεια της γενετικής μηχανικής έχουν δημιουργηθεί σειρές ζώων ανθεκτικών σε ιογενείς ασθένειες, καθώς και ράτσες ζώων με χαρακτηριστικά ευεργετικά για τον άνθρωπο. Για παράδειγμα, η μικροέγχυση ανασυνδυασμένου DNA που περιέχει το γονίδιο σωματοτροπίνης βοοειδών σε ζυγώτη κουνελιού κατέστησε δυνατή τη λήψη ενός διαγονιδιακού ζώου με υπερπαραγωγή αυτής της ορμόνης. Τα προκύπτοντα ζώα είχαν έντονη ακρομεγαλία.

Οι φορείς της υλικής βάσης των γονιδίων είναι τα χρωμοσώματα, τα οποία περιλαμβάνουν το DNA και τις πρωτεΐνες. Όμως τα γονίδια σχηματισμού δεν είναι χημικά, αλλά λειτουργικά. Από λειτουργική άποψη, το DNA αποτελείται από πολλά μπλοκ που αποθηκεύουν μια συγκεκριμένη ποσότητα πληροφοριών - γονιδίων. Η δράση του γονιδίου βασίζεται στην ικανότητά του να προσδιορίζει την πρωτεϊνοσύνθεση μέσω RNA. Το μόριο DNA περιέχει, σαν να λέγαμε, πληροφορίες που καθορίζουν τη χημική δομή των μορίων πρωτεΐνης. Ένα γονίδιο είναι ένα τμήμα ενός μορίου DNA που περιέχει πληροφορίες σχετικά με την πρωτογενή δομή οποιασδήποτε πρωτεΐνης (ένα γονίδιο - μία πρωτεΐνη). Επειδή υπάρχουν δεκάδες χιλιάδες πρωτεΐνες στους οργανισμούς, υπάρχουν δεκάδες χιλιάδες γονίδια. Το σύνολο όλων των γονιδίων ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμά του. Όλα τα κύτταρα του σώματος περιέχουν το ίδιο σύνολο γονιδίων, αλλά καθένα από αυτά υλοποιεί ένα διαφορετικό μέρος των αποθηκευμένων πληροφοριών. Επομένως, για παράδειγμα, τα νευρικά κύτταρα διαφέρουν από τα ηπατικά κύτταρα τόσο σε δομικά, λειτουργικά όσο και σε βιολογικά χαρακτηριστικά.

Τώρα, είναι ακόμη δύσκολο να προβλέψουμε όλες τις πιθανότητες που θα πραγματοποιηθούν τις επόμενες δεκαετίες.

2. Ιστορία της γενετικής μηχανικής

Η ιστορία των υψηλών βιοϊατρικών τεχνολογιών, των μεθόδων γενετικής έρευνας, καθώς και της ίδιας της γενετικής μηχανικής, σχετίζεται άμεσα με την αιώνια επιθυμία του ανθρώπου να βελτιώσει τις ράτσες των οικόσιτων ζώων και των καλλιεργούμενων φυτών που καλλιεργούνται από ανθρώπους. Επιλέγοντας ορισμένα άτομα από ομάδες ζώων και φυτών και διασταυρώνοντάς τα μεταξύ τους, ο άνθρωπος, χωρίς να έχει σωστή ιδέα για την εσωτερική ουσία των διεργασιών που συμβαίνουν μέσα στα έμβια όντα, ωστόσο, για πολλές εκατοντάδες και χιλιάδες χρόνια, δημιούργησε βελτιωμένη ράτσες ζώων και ποικιλίες φυτών που είχαν ορισμένες χρήσιμες και απαραίτητες για τους ανθρώπους ιδιότητες.

Τον 18ο και τον 19ο αιώνα έγιναν πολλές προσπάθειες για να μάθουν πώς μεταδίδονται τα χαρακτηριστικά από γενιά σε γενιά. Μια σημαντική ανακάλυψη έγινε το 1760 από τον βοτανολόγο Koelreuther, ο οποίος διασταύρωσε δύο είδη καπνού, μεταφέροντας γύρη από τους στήμονες ενός είδους στα ύπερα ενός άλλου είδους. Τα φυτά που ελήφθησαν από υβριδικούς σπόρους είχαν χαρακτηριστικά ενδιάμεσα μεταξύ αυτών και των δύο γονέων. Ο Koelreuter έβγαλε το λογικό συμπέρασμα από αυτό ότι τα γονικά χαρακτηριστικά μεταδίδονται τόσο μέσω της γύρης (κύτταρα σπόρων) όσο και μέσω των ωαρίων (ωαρίων). Ωστόσο, ούτε ο ίδιος ούτε οι σύγχρονοί του, που ασχολούνταν με τον υβριδισμό φυτών και ζώων, δεν μπόρεσαν να αποκαλύψουν τη φύση του μηχανισμού μετάδοσης της κληρονομικότητας. Αυτό εξηγείται εν μέρει από το γεγονός ότι εκείνη την εποχή η κυτταρολογική βάση αυτού του μηχανισμού δεν ήταν ακόμη γνωστή, αλλά κυρίως από το γεγονός ότι οι επιστήμονες προσπάθησαν να μελετήσουν την κληρονομικότητα όλων των χαρακτηριστικών του φυτού ταυτόχρονα.

Η επιστημονική προσέγγιση για τη μελέτη της κληρονομικότητας ορισμένων χαρακτηριστικών και ιδιοτήτων αναπτύχθηκε από τον Αυστριακό Καθολικό μοναχό Γκρέγκορ Μέντελ, ο οποίος το καλοκαίρι του 1865 ξεκίνησε τα πειράματά του στον υβριδισμό φυτών (διασταύρωση διαφόρων ποικιλιών μπιζελιών) στην επικράτεια του μοναστηριού του. Ήταν ο πρώτος που ανακάλυψε τους βασικούς νόμους της γενετικής. Ο Γκρέγκορ Μέντελ πέτυχε γιατί μελέτησε την κληρονομικότητα μεμονωμένων, σαφώς διακριτών (αντιθετικών) χαρακτηριστικών, μέτρησε τον αριθμό των απογόνων κάθε τύπου και κράτησε προσεκτικά λεπτομερή αρχεία όλων των πειραμάτων διασταύρωσής του. Η εξοικείωση με τα βασικά των μαθηματικών του επέτρεψε να ερμηνεύσει σωστά τα δεδομένα που ελήφθησαν και να υποθέσει την υπόθεση ότι κάθε χαρακτηριστικό καθορίζεται από δύο κληρονομικούς παράγοντες. Ένας ταλαντούχος μοναχός-ερευνητής μπόρεσε αργότερα να δείξει ξεκάθαρα ότι οι κληρονομικές ιδιότητες δεν αναμειγνύονται, αλλά μεταδίδονται στους απογόνους με τη μορφή ορισμένων μονάδων. Αυτό το λαμπρό συμπέρασμα επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια πλήρως όταν κατέστη δυνατό να δούμε χρωμοσώματα και να ανακαλύψουμε τα χαρακτηριστικά διαφορετικών τύπων κυτταρικής διαίρεσης: μίτωση (σωματικά κύτταρα - κύτταρα σώματος), μείωση (σεξουαλική, αναπαραγωγική, βλαστική) και γονιμοποίηση.

Ο Μέντελ ανέφερε τα αποτελέσματα της δουλειάς του σε μια συνάντηση της Εταιρείας Φυσικολόγων Brunn και τα δημοσίευσε στα πρακτικά αυτής της εταιρείας. Η σημασία των αποτελεσμάτων του δεν έγινε κατανοητή από τους συγχρόνους του και αυτές οι μελέτες δεν τράβηξαν την προσοχή των κτηνοτρόφων φυτών και των φυσικών επιστημόνων για σχεδόν 35 χρόνια.

Το 1900, αφού έγιναν γνωστές οι λεπτομέρειες της κυτταρικής διαίρεσης ανά τύπο μίτωσης, η μείωση και η ίδια η γονιμοποίηση, τρεις ερευνητές - ο de Vries στην Ολλανδία, ο Correns στη Γερμανία και ο Chermak στην Αυστρία - διεξήγαγαν μια σειρά πειραμάτων και, ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλον, ανακάλυψαν εκ νέου τους νόμους της κληρονομικότητας, που περιγράφηκαν προηγουμένως από τον Μέντελ. Αργότερα, έχοντας ανακαλύψει ένα άρθρο του Μέντελ στο οποίο αυτοί οι νόμοι διατυπώθηκαν ξεκάθαρα 35 χρόνια νωρίτερα, αυτοί οι επιστήμονες απέτισαν ομόφωνα φόρο τιμής στον μοναχό επιστήμονα ονομάζοντας τους δύο βασικούς νόμους της κληρονομικότητας μετά από αυτόν.

Την πρώτη δεκαετία του 20ου αιώνα πραγματοποιήθηκαν πειράματα με μεγάλη ποικιλία φυτών και ζώων και πολυάριθμες παρατηρήσεις σχετικά με την κληρονομικότητα των χαρακτήρων στον άνθρωπο, που έδειξαν ξεκάθαρα ότι σε όλους αυτούς τους οργανισμούς η κληρονομικότητα υπακούει στους ίδιους βασικούς νόμους. Διαπιστώθηκε ότι οι παράγοντες που περιγράφει ο Mendel που καθορίζουν ένα μεμονωμένο χαρακτηριστικό εντοπίζονται στα χρωμοσώματα του κυτταρικού πυρήνα. Στη συνέχεια, το 1909, αυτές οι μονάδες ονομάστηκαν γονίδια από τον Δανό βοτανολόγο Johansen (από την ελληνική λέξη "ge-nos" - γένος, προέλευση) και ο Αμερικανός επιστήμονας William Sutton παρατήρησε μια εκπληκτική ομοιότητα μεταξύ της συμπεριφοράς των χρωμοσωμάτων κατά το σχηματισμό του γαμετές (σεξουαλικά κύτταρα), η γονιμοποίησή τους και η μετάδοση μεντελιανών κληρονομικών παραγόντων - γονιδίων. Με βάση αυτές τις ευφυείς ανακαλύψεις, δημιουργήθηκε η λεγόμενη χρωμοσωμική θεωρία της κληρονομικότητας.

Στην πραγματικότητα, η ίδια η γενετική, ως επιστήμη της κληρονομικότητας και της μεταβλητότητας των ζωντανών οργανισμών και των μεθόδων ελέγχου τους, προέκυψε στις αρχές του 20ου αιώνα. Ο Αμερικανός γενετιστής T. Morgan, μαζί με τους συνεργάτες του, πραγματοποίησαν πολυάριθμα πειράματα που κατέστησαν δυνατή την αποκάλυψη της γενετικής βάσης του προσδιορισμού του φύλου και την εξήγηση μιας σειράς ασυνήθιστων μορφών κληρονομικότητας στις οποίες η μετάδοση ενός χαρακτηριστικού εξαρτάται από το φύλο του ατόμου. (τα λεγόμενα χαρακτηριστικά που συνδέονται με το φύλο). Το επόμενο σημαντικό βήμα προόδου έγινε το 1927, όταν ο G. Möller διαπίστωσε ότι ακτινοβολώντας τη μύγα Drosophila και άλλους οργανισμούς με ακτίνες Χ, ήταν δυνατό να προκληθούν τεχνητά γονιδιακές αλλαγές σε αυτές, δηλαδή μεταλλάξεις. Αυτό κατέστησε δυνατή την απόκτηση πολλών νέων μεταλλαγμένων γονιδίων - πρόσθετο υλικό για τη μελέτη της κληρονομικότητας. Τα δεδομένα για τη φύση των μεταλλάξεων χρησίμευσαν ως ένα από τα κλειδιά για την κατανόηση και τη δομή των ίδιων των γονιδίων.

Στη δεκαετία του 20 του αιώνα μας, Σοβιετικοί επιστήμονες της σχολής του A.S. Ο Serebrovsky πραγματοποίησε τα πρώτα πειράματα που έδειξαν πόσο πολύπλοκο είναι το γονίδιο. Αυτές οι ιδέες χρησιμοποιήθηκαν από τους J. Watson και F. Crick, οι οποίοι κατάφεραν το 1953 στην Αγγλία να δημιουργήσουν ένα μοντέλο DNA και να αποκρυπτογραφήσουν τον γενετικό κώδικα. Η μετέπειτα ερευνητική εργασία που σχετίζεται με τη στοχευμένη δημιουργία νέων συνδυασμών γενετικού υλικού οδήγησε στην εμφάνιση της ίδιας της γενετικής μηχανικής.

Ταυτόχρονα, στη δεκαετία του '40, ξεκίνησε μια πειραματική μελέτη των σχέσεων μεταξύ γονιδίων και ενζύμων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε ευρέως ένα άλλο αντικείμενο - το καλούπι Neurospora, από το οποίο ήταν δυνατή η τεχνητή λήψη και μελέτη ορισμένων βιοχημικών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την απώλεια ενός ή του άλλου ειδικού ενζύμου (πρωτεΐνη). Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, οι πιο συνηθισμένοι στόχοι της γενετικής έρευνας ήταν το Escherichia coli και ορισμένοι βακτηριοφάγοι που μολύνουν αυτό το βακτήριο.

Από τις αρχές κιόλας του 20ου αιώνα, υπάρχει συνεχές ενδιαφέρον για τη μελέτη της κληρονομικότητας ορισμένων (ειδικών) χαρακτηριστικών στον άνθρωπο και για την κληρονομική μετάδοση επιθυμητών και ανεπιθύμητων χαρακτηριστικών σε οικόσιτα ζώα και καλλιεργούμενα φυτά. Βασισμένοι σε μια συνεχώς αυξανόμενη γνώση των γενετικών προτύπων, οι γενετιστές και οι κτηνοτρόφοι έχουν μάθει, σχεδόν κατά παραγγελία, να εκτρέφουν φυλές ζώων που μπορούν να επιβιώσουν σε ζεστά κλίματα, αγελάδες που παράγουν πολύ γάλα με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, κοτόπουλα που γεννούν μεγάλα αυγά με λεπτά κοχύλια, και ποικιλίες καλαμποκιού και σιταριού, που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε ορισμένες ασθένειες.

Το 1972 ελήφθη το πρώτο υβριδικό (ανασυνδυασμένο) DNA στις ΗΠΑ στο εργαστήριο του P. Berg. Συναρπαστικές ιδέες στον τομέα της ανθρώπινης γενετικής και των μεθόδων γενετικής έρευνας έχουν αρχίσει να αναπτύσσονται ευρέως και να εφαρμόζονται στην ίδια την ιατρική. Στη δεκαετία του '70 άρχισε η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος. Για περισσότερες από δεκαετίες, υπάρχει ένα έργο που ονομάζεται Ανθρώπινο Γονιδίωμα. Από τα 3 δισεκατομμύρια ζεύγη νουκλεοτιδίων που είναι διατεταγμένα σε συνεχή συνεχή διέλευση, μόνο περίπου 10 εκατομμύρια χαρακτήρες έχουν διαβαστεί μέχρι στιγμής. Παράλληλα δημιουργούνται νέες γενετικές τεχνικές που αυξάνουν την ταχύτητα ανάγνωσης του DNA. Διευθυντής του Ιατρικού Γενετικού Κέντρου της Ρωσικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών V.I. Ο Ιβάνοφ σίγουρα πιστεύει ότι «όλο το γονιδίωμα θα διαβαστεί γύρω στο 2020».

3. Η γενετική μηχανική ως επιστήμη. Μέθοδοι γενετικής μηχανικής

Η γενετική μηχανική είναι η in vitro κατασκευή λειτουργικά ενεργών γενετικών δομών (ανασυνδυασμένο DNA), ή με άλλα λόγια, η δημιουργία τεχνητών γενετικών προγραμμάτων (Baev A.A.). Σύμφωνα με τον Ε.Σ. Η γενετική μηχανική Piruzyan είναι ένα σύστημα πειραματικών τεχνικών που καθιστούν δυνατή την κατασκευή τεχνητών γενετικών δομών στο εργαστήριο (in vitro) με τη μορφή των λεγόμενων ανασυνδυασμένων ή υβριδικών μορίων DNA.

Μιλάμε για την κατευθυνόμενη, σύμφωνα με προκαθορισμένο πρόγραμμα, κατασκευή μοριακών γενετικών συστημάτων έξω από το σώμα με την μετέπειτα εισαγωγή τους σε ζωντανό οργανισμό. Σε αυτή την περίπτωση, το ανασυνδυασμένο DNA γίνεται αναπόσπαστο μέρος της γενετικής συσκευής του οργανισμού-δέκτη και του προσδίδει νέες μοναδικές γενετικές, βιοχημικές και στη συνέχεια φυσιολογικές ιδιότητες.

Ο στόχος της εφαρμοσμένης γενετικής μηχανικής είναι να σχεδιάσει τέτοια μόρια ανασυνδυασμένου DNA που, όταν εισαχθούν στη γενετική συσκευή, θα έδιναν στο σώμα ιδιότητες χρήσιμες για τον άνθρωπο.

Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιεί τις ακόλουθες μεθόδους:

Ειδική διάσπαση του DNA από νουκλεάσες περιορισμού, επιτάχυνση της απομόνωσης και χειρισμού μεμονωμένων γονιδίων.

Ταχεία αλληλούχιση όλων των νουκλεοτιδίων σε ένα καθαρισμένο θραύσμα DNA, που καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό των ορίων του γονιδίου και της αλληλουχίας αμινοξέων που κωδικοποιείται από αυτό.

Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA;

Υβριδισμός νουκλεϊκού οξέος, ο οποίος επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών RNA ή DNA με μεγαλύτερη ακρίβεια και ευαισθησία, με βάση την ικανότητά τους να δεσμεύουν συμπληρωματικές αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων.

Κλωνοποίηση DNA: in vitro ενίσχυση χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή εισαγωγή θραύσματος DNA σε βακτηριακό κύτταρο, το οποίο, μετά από τέτοιο μετασχηματισμό, αναπαράγει αυτό το θραύσμα σε εκατομμύρια αντίγραφα.

Εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA σε κύτταρα ή οργανισμούς.

4. Τομείς εφαρμογής της γενετικής μηχανικής

Οι τρέχουσες επιστημονικές ανακαλύψεις στον τομέα της ανθρώπινης γενετικής είναι στην πραγματικότητα επαναστατικής σημασίας, καθώς μιλάμε για τη δυνατότητα δημιουργίας ενός «χάρτη του ανθρώπινου γονιδιώματος» ή «παθολογικής ανατομίας του ανθρώπινου γονιδιώματος». Αυτός ο γενετικός χάρτης θα καταστήσει δυνατό τον προσδιορισμό της θέσης των γονιδίων στη μακρά έλικα του DNA που ευθύνονται για ορισμένες κληρονομικές ασθένειες. Σύμφωνα με γενετικούς επιστήμονες, αυτές οι απεριόριστες δυνατότητες αποτέλεσαν τη βάση για την ιδέα της χρήσης της λεγόμενης γονιδιακής θεραπείας στην κλινική πράξη, η οποία είναι ένας τύπος θεραπείας για ασθενείς που περιλαμβάνει την αντικατάσταση των προσβεβλημένων γονιδίων χρησιμοποιώντας υψηλές βιοϊατρικές τεχνολογίες και γενετική μηχανική. Η εισβολή στη σύνθεση των ανθρώπινων γονιδιακών συστημάτων και η διασφάλιση της ζωτικής τους δραστηριότητας είναι δυνατή τόσο σε επίπεδο σωματικών (όλα τα σωματικά κύτταρα με ορισμένες δομικές και λειτουργικές διαφορές) κυττάρων του σώματος όσο και σε επίπεδο αναπαραγωγικών, αναπαραγωγικών (βλαστικών) και βλαστικών (εμβρυϊκά) κύτταρα.

Η γενετική μηχανική ως είδος θεραπείας - η θεραπεία μιας συγκεκριμένης γενετικά καθορισμένης ασθένειας - σχετίζεται με την παροχή ενός αντίστοιχου μη ελαττωματικού μορίου DNA με σκοπό την αντικατάστασή του με τη βοήθεια ενός γονιδίου - ένα τμήμα ενός χρωμοσώματος που περιέχει ένα ελάττωμα, ή για ενσωμάτωση στο ανθρώπινο γενετικό υλικό με συγχώνευση με τα λεγόμενα σωματικά κύτταρα του ανθρώπινου σώματος που έχουν γενετικό ελάττωμα. Το καθήκον της γενετικής μηχανικής σε σχέση με ένα άτομο είναι να παρέχει ένα κατάλληλο στοχευμένο αποτέλεσμα σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο για να το διορθώσει προς τη σωστή λειτουργία του και να παρέχει σε ένα άτομο που πάσχει από κληρονομική ασθένεια μια φυσιολογική, αναλλοίωτη εκδοχή του γονιδίου. Σε αντίθεση με τη φαρμακευτική θεραπεία, αυτή η θεραπεία, που ονομάζεται γενετική μηχανική, θα είναι προφανώς σε θέση να παρέχει στον ασθενή μακροχρόνια, παρατεταμένη, εξαιρετικά αποτελεσματική θεραπεία που φέρνει μεγάλη ανακούφιση και οφέλη.

Ωστόσο, όλες οι σύγχρονες μέθοδοι εισαγωγής DNA σε ζωντανούς οργανισμούς δεν είναι σε θέση να το κατευθύνουν και να το παραδώσουν σε έναν συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων που περιέχουν ένα αλλοιωμένο και επομένως δυσλειτουργικό γονίδιο. Με άλλα λόγια, η λεγόμενη κατευθυνόμενη μεταφορά, η μεταφορά γονιδίων στο σώμα (στο μοντέλο «in vivo») είναι επί του παρόντος αδύνατη.

Μια άλλη μεθοδολογική προσέγγιση, βασισμένη στην εξαγωγή από το σώμα του ασθενούς ενός συγκεκριμένου πληθυσμού κυττάρων που περιέχουν το προσβεβλημένο γονίδιο και τον χειρισμό του γενετικού υλικού αντικαθιστώντας ελαττωματικά γονίδια στα κύτταρα χρησιμοποιώντας γενετική μηχανική (στο μοντέλο «in vitro») και επιστρέφοντάς τα σε αυτό. θέση στο σώμα, όπου ελήφθησαν από τον ασθενή είναι σήμερα δυνατή σε ιατρικά γενετικά κέντρα. Αυτή η μέθοδος γονιδιακής θεραπείας μέσω γενετικής μηχανικής έχει ήδη χρησιμοποιηθεί σε μια πειραματική προσπάθεια να θεραπεύσει δύο ασθενείς που πάσχουν από μια σπάνια γενετική ασθένεια που ονομάζεται βήτα θαλασσαιμία, η οποία, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία, προκαλείται επίσης από την παρουσία κακής μορφής και ως εκ τούτου εσφαλμένης λειτουργίας. πρωτεΐνη στα ερυθρά αιμοσφαίρια. Η ουσία του χειρισμού ήταν ότι τα λεγόμενα βλαστοκύτταρα απομονώθηκαν από τον μυελό των οστών αυτών των ασθενών, στα χρωμοσώματα των οποίων εισήχθη το τμήμα DNA που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή της φυσιολογικής πρωτεΐνης αιμοσφαιρίνης - το γονίδιο. Αφού τα δυσλειτουργικά βλαστοκύτταρα που είχαν απομείνει στον μυελό των οστών των ασθενών καταστράφηκαν σχεδόν ολοκληρωτικά, οι ασθενείς έλαβαν ένεση με γενετικά τροποποιημένα βλαστοκύτταρα. Δυστυχώς, αυτές οι δύο προσπάθειες ήταν κλινικά ανεπιτυχείς, καθώς οι ασθενείς πέθαναν. Αυτή η πρώτη περίπτωση γενετικής μηχανικής σε νοσοκομειακό περιβάλλον δεν εγκρίθηκε ούτε εγκρίθηκε από τις αρμόδιες επιτροπές αναθεώρησης και οι συμμετέχοντες της καταδικάστηκαν έντονα για κατάφωρη παραβίαση των κανόνων έρευνας στον τομέα της ανθρώπινης γενετικής.

Η γενετική μηχανική των αναπαραγωγικών (αναπαραγωγικών) κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε εντελώς διαφορετικές συνέπειες, καθώς η εισαγωγή DNA σε αυτά τα κύτταρα διαφέρει από τη διόρθωση ενός γενετικού ελαττώματος σε σωματικά (σωματικά, μη αναπαραγωγικά) κύτταρα. Είναι γνωστό ότι η εισαγωγή άλλων γονιδίων στα χρωμοσώματα των γεννητικών κυττάρων οδηγεί στη μετάδοσή τους στις επόμενες γενιές. Κατ' αρχήν, μπορεί κανείς να φανταστεί την προσθήκη ορισμένων τμημάτων DNA για να αντικαταστήσει ελαττωματικά τμήματα στο γενετικό υλικό κάθε αναπαραγωγικού κυττάρου ενός συγκεκριμένου ατόμου που επηρεάζεται από τη μία ή την άλλη γενετικά καθορισμένη ασθένεια.

Πράγματι, αυτό έχει επιτευχθεί σε ποντίκια. Έτσι, ελήφθη ένα ωάριο από την ωοθήκη ενός θηλυκού, το οποίο στη συνέχεια γονιμοποιήθηκε in vitro (in vitro) και στη συνέχεια ένα τμήμα ξένου DNA εισήχθη στο χρωμόσωμα του γονιμοποιημένου ωαρίου. Το ίδιο το γονιμοποιημένο ωάριο με ένα τροποποιημένο γονιδίωμα εμφυτεύτηκε (εισαχθεί) στη μητρική μήτρα ενός θηλυκού ποντικού. Η πηγή ξένου DNA στο ένα πείραμα ήταν γενετικό υλικό κουνελιού και στο άλλο ανθρώπινο γενετικό υλικό.

Προκειμένου να ανιχνευθεί κατά την περίοδο της εμβρυϊκής ανάπτυξης η πιθανότητα απόκτησης παιδιού με ορισμένες γενετικές ανωμαλίες, όπως το σύνδρομο Down ή η νόσος Tay-Sachs, χρησιμοποιείται μια ερευνητική τεχνική που ονομάζεται αμνιοπαρακέντηση - μια προγεννητική ανάλυση, κατά την οποία ένα δείγμα βιολογικού υγρού που περιέχει γεννητικά κύτταρα, που λαμβάνονται από τον αμνιακό σάκο νωρίς στο δεύτερο τρίμηνο της εγκυμοσύνης. Επιπλέον, αναπτύχθηκε περαιτέρω η τεχνική της εξαγωγής διαφόρων εμβρυϊκών κυττάρων από ένα δείγμα του αίματος του πλακούντα της μητέρας. Τα κύτταρα της μήτρας που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο μπορούν επί του παρόντος να χρησιμοποιηθούν μόνο για τον εντοπισμό ενός περιορισμένου αριθμού γενετικά καθορισμένων ασθενειών στις οποίες υπάρχουν έντονες, σοβαρές διαταραχές στη δομή του DNA και αλλαγές που προσδιορίζονται με τη χρήση βιοχημικών εξετάσεων. Η γενετική μηχανική που χρησιμοποιεί ανασυνδυασμένο DNA κατά τη διάρκεια της προγεννητικής έρευνας ανοίγει τη δυνατότητα σωστής διάγνωσης διαφόρων και πολυάριθμων κληρονομικών ασθενειών.

Σε αυτή την περίπτωση, αναπτύσσονται τεχνικές για τη δημιουργία των λεγόμενων γονιδιακών «ανιχνευτών», χρησιμοποιώντας τους οποίους είναι δυνατό να προσδιοριστεί εάν ένα χρωμόσωμα περιέχει ένα φυσιολογικό, αμετάβλητο γονίδιο ή ένα ανώμαλο, ελαττωματικό γονίδιο. Επιπλέον, η γενετική μηχανική που σχετίζεται με τη χρήση του ανασυνδυασμένου DNA, το οποίο βρίσκεται σε ένα από τα στάδια του σχηματισμού του, θα επιτρέψει στο μέλλον να πραγματοποιηθεί ο λεγόμενος «σχεδιασμός» των ανθρώπινων γονιδίων, έτσι ώστε ένα συγκεκριμένο γονίδιο που φέρει παραμορφωμένες, παθολογικές πληροφορίες και επομένως ενδιαφέρει τους γενετιστές, θα μπορούσε να εντοπιστεί εγκαίρως και αρκετά γρήγορα κατ' αναλογία με τη μέθοδο χρήσης ενός άλλου γονιδίου με «επισήμανση». Αυτή η περίπλοκη ιατρική και βιολογική τεχνική θα πρέπει να βοηθήσει στον προσδιορισμό της θέσης οποιουδήποτε γονιδίου στα κύτταρα της μήτρας, και όχι μόνο σε εκείνα στα οποία είναι πιθανό να ανιχνευθούν διάφορες διαταραχές χρησιμοποιώντας την τεχνική της αμνιοπαρακέντησης.

Από αυτή την άποψη, τα τελευταία χρόνια, έχουν εμφανιστεί νέοι τομείς βιοϊατρικών επιστημών, όπως, για παράδειγμα, οι τεχνολογίες υψηλών DNA, η εμβρυοθεραπεία και η κυτταρική θεραπεία (κυτταροθεραπεία), δηλαδή η ενδομήτρια διάγνωση και θεραπεία μιας γενετικά καθορισμένης ασθένειας τόσο στην εκπαιδευτικό στάδιο και την ανάπτυξη του εμβρύου (έμβρυο), και στο στάδιο της ωρίμανσης του εμβρύου. Η εισβολή και ο χειρισμός του εμβρυϊκού υλικού έχει άμεσο αντίκτυπο στην κληρονομικότητα των γενετικών αλλαγών, αφού έχουν την ικανότητα να μεταδίδονται από γενιά σε γενιά. Επιπλέον, η ίδια η γενετική διάγνωση αρχίζει να εξελίσσεται σε γενετική πρόβλεψη, δηλαδή στον καθορισμό της μελλοντικής μοίρας ενός ατόμου, ενοποιώντας τις κύριες επαναστατικές αλλαγές στην ίδια την ιατρική, η οποία, ως αποτέλεσμα πολύπλοκων ιατρογενετικών πειραμάτων και τεχνικών, κέρδισε την ευκαιρία πολύ πριν από την εμφάνιση της «κλινικής εικόνας της νόσου», μερικές φορές ακόμη και πριν από τη γέννηση ενός ατόμου, για να προσδιοριστεί ποιες κληρονομικές παθήσεις τον απειλούν. Έτσι, χάρη στις προσπάθειες γενετιστών και ειδικών στον τομέα της γενετικής μηχανικής, γεννήθηκε η λεγόμενη «προγνωστική ιατρική» στα βάθη των βιοϊατρικών επιστημών, δηλαδή η ιατρική που «κάνει προβλέψεις για το μέλλον».

Ταυτόχρονα, διάφορες τεχνολογίες και μέθοδοι γενετικής μηχανικής καθιστούν δυνατή την πρόβλεψη στην προγεννητική περίοδο της ανάπτυξης ενός παιδιού, πριν από τη γέννησή του, όχι μόνο την παρουσία μιας συγκεκριμένης κληρονομικής ασθένειας, αλλά και τη λεπτομερή περιγραφή της ιατρικής και γενετικής ιδιότητες του αναπτυσσόμενου εμβρύου και του εμβρύου.

Με τη συσσώρευση νέων δεδομένων για τη γενετική χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος και την περιγραφή (αλληλουχία) του DNA του, καθώς και επειδή οι σύγχρονες μέθοδοι μελέτης των πολυμορφισμών του DNA που αναπτύσσονται καθιστούν δυνατή τη διάθεση γενετικών πληροφοριών σχετικά με ορισμένες δομικές και λειτουργικές ( συμπεριλαμβανομένων των παθολογικών) χαρακτηριστικών του ανθρώπινου σώματος, τα οποία, προφανώς, θα εμφανιστούν στο μέλλον, αλλά δεν είναι ακόμη αισθητά τώρα, καθίσταται δυνατή η απόκτηση, με τη βοήθεια ιατρικής γενετικής διάγνωσης, όλων των γενετικών πληροφοριών για το παιδί όχι μόνο προκλινικά, δηλαδή πριν από την εκδήλωση ορισμένης κληρονομικής ασθένειας, και προγεννητικά, δηλαδή πριν από τη γέννησή του, αλλά και προληπτικά, δηλαδή πριν από τη σύλληψή της.

Στο άμεσο μέλλον, χάρη στην επιτυχία και την πρόοδο στον τομέα της ιατρικής γενετικής διάγνωσης, θα είναι δυνατό, βάσει διαγνωστικών δεδομένων DNA, να κρίνουμε με αρκετή σιγουριά, για παράδειγμα, ποιο είναι το ύψος, οι νοητικές ικανότητες, η προδιάθεση για ορισμένες ασθένειες. (ιδιαίτερα ο καρκίνος) θα είναι.ή ψυχική), καταδικασμένη στην εκδήλωση και ανάπτυξη οποιωνδήποτε κληρονομικών ασθενειών.

Οι σύγχρονες ιατρικές και βιολογικές τεχνολογίες καθιστούν δυνατό τον εντοπισμό διαφόρων διαταραχών στα γονίδια που μπορούν να εκδηλωθούν και να προκαλέσουν ορισμένες ασθένειες, όχι μόνο στο στάδιο μιας κλινικά έντονης ασθένειας, αλλά και όταν δεν υπάρχουν ακόμη σημάδια παθολογίας και η ίδια η ασθένεια δεν θα εκδηλωθεί τόσο σύντομα. Παραδείγματα αυτού περιλαμβάνουν τη νόσο του Αλτσχάιμερ και τη χορεία του Χάντινγκτον, που επηρεάζουν ένα άτομο ηλικίας άνω των 40 ετών ή ακόμη και 70 ετών. Ωστόσο, ακόμη και σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι δυνατό να εντοπιστούν γονίδια που μπορούν να προκαλέσουν παρόμοιες ασθένειες στον άνθρωπο, ακόμη και πριν από τη σύλληψη της ασθενούς. Είναι επίσης γνωστό ότι ο σακχαρώδης διαβήτης μπορεί να ταξινομηθεί ως μία από αυτές τις ασθένειες. Η προδιάθεση για αυτήν την ασθένεια και η ίδια η γενετικά καθορισμένη παθολογία είναι κληρονομικές και μπορεί να εκδηλωθούν σε περίπτωση μη συμμόρφωσης με έναν συγκεκριμένο τρόπο ζωής στην ενήλικη ζωή ή την τρίτη ηλικία. Μπορούμε να πούμε με εύλογη βεβαιότητα ότι εάν και οι δύο γονείς ή ένας από αυτούς πάσχουν από διαβήτη, τότε η πιθανότητα κληρονομικότητας του γονιδίου του «διαβήτη» ή ενός συνδυασμού τέτοιων γονιδίων μεταβιβάζεται στα παιδιά.

Στην περίπτωση αυτή, αποδεικνύεται ότι είναι δυνατή η διεξαγωγή κατάλληλων ιατρικών και βιολογικών μελετών και η σωστή διάγνωση παρουσία μικροσκοπικά μικρών ποσοτήτων βιολογικού υλικού. Μερικές φορές για αυτό αρκούν μερικά μεμονωμένα κύτταρα, τα οποία θα πολλαπλασιαστούν σε καλλιέργεια in vitro και από αυτά θα ληφθεί ένα «γενετικό πορτρέτο» του ελεγχόμενου ατόμου, φυσικά, όχι για όλα τα γονίδια του γονιδιώματός του (υπάρχουν δεκάδες χιλιάδες από αυτά!), αλλά για εκείνα από αυτά, για τα οποία υπάρχουν βάσιμοι λόγοι να υποπτευόμαστε την παρουσία ορισμένων ελαττωμάτων. Η ταυτόχρονη ανάπτυξη μεθόδων κυτταρικής και γενετικής μηχανικής θα επιτρέψει, στα επόμενα στάδια της γνώσης του γονιδιώματος, να ανοίξει η πρακτική δυνατότητα αυθαίρετης και, κυρίως, για θεραπευτικούς σκοπούς, αλλαγής της αλληλουχίας και της σειράς των γονιδίων, τη σύνθεση και τη δομή τους.

Η ιατρική δεν είναι ο μόνος τομέας εφαρμογής της γενετικής μηχανικής. Υπάρχει η γενετική μηχανική των φυτών και η γενετική μηχανική των βακτηριολογικών κυττάρων.

Πρόσφατα, έχουν προκύψει νέες ευκαιρίες για την απόκτηση «βρώσιμων» εμβολίων που βασίζονται σε διαγονιδιακά φυτά.

Μεγάλη πρόοδος έχει σημειωθεί στα διαγονιδιακά φυτά στον κόσμο. Οφείλονται σε μεγάλο βαθμό στο γεγονός ότι το πρόβλημα της απόκτησης ενός οργανισμού από ένα κύτταρο, μια ομάδα κυττάρων ή ένα ανώριμο έμβρυο σε φυτά δεν είναι πλέον πολύ δύσκολο. Οι κυτταρικές τεχνολογίες, η καλλιέργεια ιστών και η δημιουργία αναγεννητικών ουσιών χρησιμοποιούνται ευρέως στη σύγχρονη επιστήμη.

Ας εξετάσουμε τα επιτεύγματα στον τομέα της καλλιέργειας φυτών που επιτεύχθηκαν στο Σιβηρικό Ινστιτούτο Φυσιολογίας και Βιοχημείας Φυτών του Παραρτήματος Σιβηρίας της Ρωσικής Ακαδημίας Επιστημών.

Έτσι, τα τελευταία χρόνια, ένας αριθμός διαγονιδιακών φυτών έχει ληφθεί μεταφέροντας στο γονιδίωμά τους τα γονίδια ugt, acp, acb, accc και άλλα που απομονώθηκαν από διάφορα φυτικά αντικείμενα.

Ως αποτέλεσμα της εισαγωγής αυτών των γονιδίων, εμφανίστηκαν διαγονιδιακά φυτά σιταριού, πατάτας, ντομάτας, αγγουριού, σόγιας, αρακάς, ελαιοκράμβης, φράουλας, ασπέν και μερικά άλλα.

Η εισαγωγή των γονιδίων πραγματοποιήθηκε είτε με «στόχευση» ιστών από ένα «γονιδιακό πιστόλι» (το σχέδιο του οποίου αναπτύχθηκε στο ινστιτούτο μας), είτε από έναν γενετικό φορέα που βασίζεται σε ένα αγροβακτηριακό πλασμίδιο με ενσωματωμένα γονίδια-στόχους και αντίστοιχους προαγωγείς .

Ως αποτέλεσμα, σχηματίστηκε ένας αριθμός νέων διαγονιδιακών μορφών. Εδώ είναι μερικά από αυτά.

Το διαγονιδιακό σιτάρι (2 ποικιλίες), το οποίο έχει σημαντικά πιο εντατική ανάπτυξη και υλοτόμηση, είναι πιθανώς πιο ανθεκτικό στην ξηρασία και σε άλλους δυσμενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες. Μελετώνται η παραγωγικότητά του και η κληρονομικότητα των αποκτηθέντων ιδιοτήτων του.

Διαγονιδιακές πατάτες, οι οποίες παρακολουθούνται εδώ και τρία χρόνια. Παράγει σταθερά απόδοση 50-90 τοις εκατό υψηλότερη από τον μάρτυρα, έχει αποκτήσει σχεδόν πλήρη αντοχή στα ζιζανιοκτόνα αυξίνης και, επιπλέον, οι κόνδυλοι του «μαυρίζουν» σημαντικά λιγότερο στα κοψίματα λόγω μείωσης της δραστηριότητας της πολυφαινολοοξειδάσης.

Διαγονιδιακή ντομάτα (αρκετές ποικιλίες), που χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη θαμνότητα και απόδοση. Σε ένα θερμοκήπιο, η απόδοσή του είναι έως και 46 κιλά ανά τετραγωνικό μέτρο (πάνω από δύο φορές υψηλότερη από τον έλεγχο).

Το διαγονιδιακό αγγούρι (αρκετές ποικιλίες) παράγει μεγαλύτερο αριθμό γόνιμων λουλουδιών και, κατά συνέπεια, καρπών με απόδοση έως 21 κιλά ανά τετραγωνικό μέτρο έναντι 13,7 στον μάρτυρα.

Υπάρχουν διαγονιδιακές μορφές άλλων φυτών, πολλά από τα οποία έχουν επίσης μια σειρά από χρήσιμα οικονομικά χαρακτηριστικά.

Η γενετική μηχανική είναι η επιστήμη του σήμερα και του αύριο. Ήδη, δεκάδες εκατομμύρια εκτάρια σπέρνονται με διαγονιδιακά φυτά σε όλο τον κόσμο, δημιουργούνται νέα φάρμακα και νέοι παραγωγοί χρήσιμων ουσιών. Με την πάροδο του χρόνου, η γενετική μηχανική θα γίνει ένα όλο και πιο ισχυρό εργαλείο για νέες προόδους στην ιατρική, την κτηνιατρική, τη φαρμακολογία, τη βιομηχανία τροφίμων και τη γεωργία.

5. Επιστημονικά στοιχεία για τους κινδύνους της γενετικής μηχανικής

Πρέπει να σημειωθεί ότι παράλληλα με την πρόοδο που φέρνει η ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής, υπάρχουν και ορισμένα στοιχεία για τους κινδύνους της γενετικής μηχανικής, τα κυριότερα από τα οποία παρουσιάζονται παρακάτω.

1. Η γενετική μηχανική είναι θεμελιωδώς διαφορετική από την ανάπτυξη νέων ποικιλιών και φυλών. Η τεχνητή προσθήκη ξένων γονιδίων διαταράσσει σε μεγάλο βαθμό τον λεπτομερώς ρυθμισμένο γενετικό έλεγχο ενός φυσιολογικού κυττάρου. Ο χειρισμός των γονιδίων είναι θεμελιωδώς διαφορετικός από τον συνδυασμό μητρικών και πατρικών χρωμοσωμάτων που συμβαίνει σε φυσικές διασταυρώσεις.

2. Επί του παρόντος, η γενετική μηχανική είναι τεχνικά ατελής, καθώς δεν είναι σε θέση να ελέγξει τη διαδικασία εισαγωγής ενός νέου γονιδίου. Επομένως, είναι αδύνατο να προβλεφθεί η θέση εισαγωγής και τα αποτελέσματα του προστιθέμενου γονιδίου. Ακόμα κι αν η θέση ενός γονιδίου μπορεί να προσδιοριστεί αφού έχει εισαχθεί στο γονιδίωμα, οι διαθέσιμες πληροφορίες DNA είναι πολύ ελλιπείς για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων.

3. Ως αποτέλεσμα της τεχνητής προσθήκης ξένου γονιδίου, μπορεί απροσδόκητα να σχηματιστούν επικίνδυνες ουσίες. Στη χειρότερη περίπτωση, αυτά μπορεί να είναι τοξικές ουσίες, αλλεργιογόνα ή άλλες ουσίες επιβλαβείς για την υγεία. Οι πληροφορίες σχετικά με αυτούς τους τύπους δυνατοτήτων είναι ακόμη πολύ ελλιπείς.

4. Δεν υπάρχουν απολύτως αξιόπιστες μέθοδοι για τον έλεγχο της αβλαβούς. Περισσότερο από το 10% των σοβαρών παρενεργειών των νέων φαρμάκων δεν μπορεί να ανιχνευθεί, παρά τις προσεκτικά διενεργηθείσες μελέτες ασφάλειας. Ο κίνδυνος να μην εντοπιστούν οι επικίνδυνες ιδιότητες των νέων γενετικά τροποποιημένων τροφίμων είναι πιθανό να είναι σημαντικά μεγαλύτερος από ό,τι στην περίπτωση των φαρμάκων.

5. Οι τρέχουσες απαιτήσεις για δοκιμές για αβλαβή είναι εξαιρετικά ανεπαρκείς. Είναι ξεκάθαρα σχεδιασμένα για να απλοποιήσουν τη διαδικασία έγκρισης. Επιτρέπουν τη χρήση εξαιρετικά μη ευαίσθητων μεθόδων δοκιμών αβλαβότητας. Υπάρχει επομένως σημαντικός κίνδυνος τα επικίνδυνα τρόφιμα να μπορούν να περάσουν από επιθεώρηση απαρατήρητα.

6. Τα τρόφιμα που έχουν δημιουργηθεί μέχρι σήμερα με τη χρήση γενετικής μηχανικής δεν έχουν καμία σημαντική αξία για την ανθρωπότητα. Αυτά τα προϊόντα ικανοποιούν κυρίως εμπορικά συμφέροντα.

7. Οι γνώσεις σχετικά με τις επιπτώσεις των γενετικά τροποποιημένων οργανισμών που εισάγονται στο περιβάλλον είναι εντελώς ανεπαρκείς. Δεν έχει ακόμη αποδειχθεί ότι οι οργανισμοί που τροποποιούνται με γενετική μηχανική δεν θα έχουν επιβλαβείς επιπτώσεις στο περιβάλλον. Οι περιβαλλοντολόγοι έχουν προτείνει διάφορες πιθανές περιβαλλοντικές επιπλοκές. Για παράδειγμα, υπάρχουν πολλές ευκαιρίες για ανεξέλεγκτη εξάπλωση δυνητικά επιβλαβών γονιδίων που χρησιμοποιούνται από τη γενετική μηχανική, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς γονιδίων από βακτήρια και ιούς. Οι επιπλοκές που προκαλούνται από το περιβάλλον είναι πιθανό να είναι αδύνατο να διορθωθούν επειδή τα γονίδια που απελευθερώνονται δεν μπορούν να ληφθούν πίσω.

8. Μπορεί να εμφανιστούν νέοι και επικίνδυνοι ιοί. Έχει αποδειχθεί πειραματικά ότι τα ιικά γονίδια που είναι ενσωματωμένα στο γονιδίωμα μπορούν να συνδυαστούν με τα γονίδια των μολυσματικών ιών (ο λεγόμενος ανασυνδυασμός). Αυτοί οι νέοι ιοί μπορεί να είναι πιο επιθετικοί από τους αρχικούς. Οι ιοί μπορεί επίσης να γίνουν λιγότερο συγκεκριμένοι για τα είδη. Για παράδειγμα, οι ιοί των φυτών μπορούν να γίνουν επιβλαβείς για τα ωφέλιμα έντομα, τα ζώα, αλλά και τον άνθρωπο.

9. Η γνώση της κληρονομικής ουσίας, του DNA, είναι πολύ ελλιπής. Η λειτουργία μόνο του 3% του DNA είναι γνωστή. Είναι επικίνδυνο να χειραγωγούμε πολύπλοκα συστήματα για τα οποία η γνώση είναι ελλιπής. Η εκτεταμένη εμπειρία στους τομείς της βιολογίας, της οικολογίας και της ιατρικής δείχνει ότι αυτό μπορεί να προκαλέσει σοβαρά απρόβλεπτα προβλήματα και διαταραχές.

10. Η γενετική μηχανική δεν θα βοηθήσει στην επίλυση του προβλήματος της παγκόσμιας πείνας. Ο ισχυρισμός ότι η γενετική μηχανική μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην επίλυση του προβλήματος της παγκόσμιας πείνας είναι ένας επιστημονικά αβάσιμος μύθος.

συμπέρασμα

Η γενετική μηχανική είναι μια μέθοδος βιοτεχνολογίας που ασχολείται με την έρευνα για την αναδιάρθρωση των γονότυπων. Ο γονότυπος δεν είναι απλώς ένα μηχανικό άθροισμα γονιδίων, αλλά ένα πολύπλοκο σύστημα που αναπτύχθηκε κατά την εξέλιξη των οργανισμών. Η γενετική μηχανική καθιστά δυνατή τη μεταφορά γενετικών πληροφοριών από έναν οργανισμό στον άλλο μέσω εργασιών in vitro. Η μεταφορά γονιδίων καθιστά δυνατή την υπέρβαση των φραγμών μεταξύ των ειδών και τη μεταφορά μεμονωμένων κληρονομικών χαρακτηριστικών ενός οργανισμού σε έναν άλλο.

Η αναδιάταξη των γονοτύπων, κατά την εκτέλεση εργασιών γενετικής μηχανικής, αντιπροσωπεύει ποιοτικές αλλαγές στα γονίδια που δεν σχετίζονται με αλλαγές στη δομή των χρωμοσωμάτων ορατών σε μικροσκόπιο. Οι γονιδιακές αλλαγές σχετίζονται κυρίως με τον μετασχηματισμό της χημικής δομής του DNA. Οι πληροφορίες σχετικά με τη δομή μιας πρωτεΐνης, γραμμένες ως αλληλουχία νουκλεοτιδίων, υλοποιούνται ως αλληλουχία αμινοξέων στο μόριο της συντιθέμενης πρωτεΐνης. Μια αλλαγή στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων στο χρωμοσωμικό DNA, η απώλεια μερικών και η συμπερίληψη άλλων νουκλεοτιδίων, αλλάζει τη σύνθεση των μορίων RNA που σχηματίζονται στο DNA και αυτό, με τη σειρά του, καθορίζει μια νέα αλληλουχία αμινοξέων κατά τη σύνθεση. Ως αποτέλεσμα, μια νέα πρωτεΐνη αρχίζει να συντίθεται στο κύτταρο, η οποία οδηγεί στην εμφάνιση νέων ιδιοτήτων στον οργανισμό. Η ουσία των μεθόδων γενετικής μηχανικής είναι ότι μεμονωμένα γονίδια ή ομάδες γονιδίων εισάγονται ή αποκλείονται από τον γονότυπο ενός οργανισμού. Ως αποτέλεσμα της εισαγωγής ενός γονιδίου που προηγουμένως απουσίαζε στον γονότυπο, το κύτταρο μπορεί να αναγκαστεί να συνθέσει πρωτεΐνες που δεν είχε συνθέσει προηγουμένως.

Βιβλιογραφία

2. Lee A., Tinland B. Ενσωμάτωση του t-DNA στο γονιδίωμα του φυτού: πρωτότυπο και πραγματικότητα // Φυσιολογία φυτών. 2000. - Τόμος 47. - Αρ. 3.

3. Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. et al. Genetics of plant development. - Αγία Πετρούπολη: Nauka, 2000. - 539 σελ.

4. Lyadskaya M. Η γενετική μηχανική μπορεί να κάνει τα πάντα - ακόμη και να καλλιεργήσει ένα εμβόλιο στον κήπο // Φαρμακευτικό Δελτίο. - 2000. - Νο. 7.

5. Romanov G. A. Γενετική μηχανική των φυτών και τρόποι επίλυσης του προβλήματος της βιοασφάλειας // Φυσιολογία φυτών, 2000. - Τόμος 47. - Αρ. 3.

6. Salyaev R. Μύθοι και πραγματικότητες της γενετικής μηχανικής // Επιστήμη στη Σιβηρία. - 2002. - Νο. 7.

7. Favorova O. O. Θεραπεία με γονίδια - μυθοπλασία ή πραγματικότητα; // Φαρμακευτικό Δελτίο. - 2002. - Νο. 5.

Kuzmina N.A. Βασικές αρχές της βιοτεχνολογίας: εγχειρίδιο. - Ομσκ: OGPU, 2001. - 256 σελ.

Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. et al. Genetics of plant development. - Αγία Πετρούπολη: Nauka, 2000. - 539 σελ.

Lyadskaya M. Η γενετική μηχανική μπορεί να κάνει τα πάντα - ακόμη και να αναπτύξει ένα εμβόλιο στον κήπο // Φαρμακευτικό Δελτίο. - 2000. - Νο. 7.

Kuzmina N.A. Βασικές αρχές της βιοτεχνολογίας: εγχειρίδιο. - Ομσκ: OGPU, 2001. - 256 σελ.

Favorova O. O. Θεραπεία με γονίδια - φαντασία ή πραγματικότητα; // Φαρμακευτικό Δελτίο. - 2002. - Νο. 5.

Salyaev R. Μύθοι και πραγματικότητες της γενετικής μηχανικής // Επιστήμη στη Σιβηρία. - 2002. - Νο. 7.

Kuzmina N.A. Βασικές αρχές της βιοτεχνολογίας: εγχειρίδιο. - Ομσκ: OGPU, 2001. - 256 σελ.

Γενετική (γενετική) μηχανική

Γενετική (γενετική) μηχανική– τεχνητή κατασκευή γενετικών δομών και κληρονομικά τροποποιημένων οργανισμών. Η γενετική μηχανική είναι ένα τμήμα (εφαρμοσμένο κλάδο) της μοριακής γενετικής που σχετίζεται με τη στοχευμένη δημιουργία νέων μορίων DNA ικανών να πολλαπλασιάζονται σε ένα κύτταρο ξενιστή. Σε αυτή την περίπτωση, εμφανίζεται μια τεχνητή, σκόπιμη αλλαγή στον γονότυπο του οργανισμού (μικροοργανισμός) και ο σχηματισμός νέων χαρακτηριστικών και ιδιοτήτων. Η γενετική μηχανική ασχολείται με την αποκωδικοποίηση της δομής των γονιδίων, τη σύνθεση και την κλωνοποίησή τους και την εισαγωγή γονιδίων που απομονώνονται από τα κύτταρα των ζωντανών οργανισμών στα κύτταρα των φυτών και των ζώων προκειμένου να αλλάξουν συγκεκριμένα τα γενετικά τους χαρακτηριστικά.

Καλά ανεπτυγμένες μέθοδοι γενετικής μηχανικής είναι η διαγένεση, η μικροβιολογική σύνθεση κ.λπ.

Διαγένεση– μεταφορά γονιδίων από έναν τύπο οργανισμού στον άλλο. Η διαγένεση πραγματοποιείται με κοπή και ραφή τμημάτων DNA με τη συμμετοχή ενζύμων - περιοριστικών ενζύμων και λιγασών.

Στάδια διαγένεσης:

α) απομόνωση γονιδίων (θραύσματα DNA) από βακτηριακά, φυτικά ή ζωικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο περιοριστικά ένζυμα;

β) σύνδεση (σύνδεση) γονιδίων (θραύσματα DNA) με πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ένζυμο λιγάσες;

γ) εισαγωγή ενός υβριδικού πλασμιδικού DNA που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο στο κύτταρο ξενιστή.

δ) αντιγραφή (κλωνοποίηση) αυτού του γονιδίου στο κύτταρο ξενιστή και διασφάλιση της λειτουργίας του σύμφωνα με το σχήμα: «Κώδικας DNA – μεταγραφή – μετάφραση – πρωτεΐνη»

Εργαλεία γενετικής μηχανικήςείναι ένζυμα που ανακαλύφθηκαν το 1974 - περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες περιορισμού).Τα περιοριστικά ένζυμα αναγνωρίζουν τμήματα (θέσεις) του DNA και κάνουν τομές σε κλώνους DNA. Στα άκρα κάθε θραύσματος, σχηματίζονται μονόκλωνες ουρές, που ονομάζονται " κολλώδη άκρα"αφού μπορούν, όπως λέγαμε, να κολλήσουν μεταξύ τους λόγω συμπληρωματικότητας.

Τα περιοριστικά ένζυμα αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων DNA σε δίκλωνο DNA. Το ένζυμο περιορισμού στη συνέχεια προσκολλάται στην αναγνωρισμένη θέση νουκλεοτιδίου και την κόβει στη θέση προσκόλλησης. Συχνότερα, τα περιοριστικά ένζυμα αναγνωρίζουν περιοχές 4-6 ζευγών νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο DNA και κόβουν και τους δύο κλώνους DNA στη μέση αυτών των περιοχών ή συνήθως με μια μετατόπιση. Παραδείγματα περιοριστικών ενζύμων: ένζυμο περιορισμού Eco RI, το οποίο αναγνωρίζει ένα θραύσμα DNA έξι νουκλεοτιδίων GAATTC (το σημείο κοπής μεταξύ των νουκλεοτιδίων G και Α και των δύο κλώνων DNA). ένζυμο περιορισμού Hind IIIαναγνωρίζει την περιοχή AAGCTT (το σημείο κοπής μεταξύ των νουκλεοτιδίων Α και Α και των δύο κλώνων DNA). ένζυμο περιορισμού Μπαμ Ιαναγνωρίζει την περιοχή GGATCC (το σημείο κοπής μεταξύ των νουκλεοτιδίων G και G και των δύο κλώνων DNA). ένζυμο περιορισμού Hae IIIαναγνωρίζει τη θέση GGC (τη θέση κοπής μεταξύ των νουκλεοτιδίων G και C και των δύο κλώνων DNA). ένζυμο περιορισμού Hpa IIαναγνωρίζει την περιοχή CCGG (το σημείο κοπής μεταξύ των νουκλεοτιδίων C και C και των δύο κλώνων DNA).

Στη συνέχεια, για να κατασκευαστεί ένας γενετικά τροποποιημένος οργανισμός, είναι απαραίτητο να εισαχθεί το επιθυμητό γονίδιο στο κύτταρο αυτού του οργανισμού. Η εισαγωγή ξένων γονιδίων στο σώμα πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας φορέας πλασμιδίου. Το διάνυσμα είναι πλασμίδιο – μικρό κυκλικό μόριο DNAπου εξάγεται από το κυτταρόπλασμα ενός βακτηριακού κυττάρου. Πλασμίδια– παράγοντες κληρονομικότητας που βρίσκονται έξω από τα χρωμοσώματα, που αντιπροσωπεύουν εξωχρωμοσωμικό DNA.

Ρύζι. 37.

ΕΝΑ– Σχέδιο εισαγωγής ξένου DNA σε βακτηριακό πλασμίδιο με χρήση ενζύμων (ενδονουκλεάση περιορισμού και λιγάση).

σι– Σχέδιο μεταφοράς ανθρώπινου γονιδίου υπεύθυνου για τη σύνθεση της ορμόνης ινσουλίνης και το σχηματισμό του φορέα DNA.

Ιδιότητες του πλασμιδίου: 1) έχει την ικανότητα για αυτόνομη αντιγραφή. 2) περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν αντιβιοτικά. 3) είναι σε θέση να ενσωματωθούν στο χρωμόσωμα του κυττάρου δέκτη. 4) αναγνωρίζει τμήματα του DNA που μπορούν να κοπούν από ένζυμα περιορισμού. 5) ένα ένζυμο περιορισμού μπορεί να κόψει το πλασμίδιο και να το μεταφέρει σε γραμμική κατάσταση. Οι ερευνητές χρησιμοποιούν αυτές τις ιδιότητες του πλασμιδίου για να αποκτήσουν ανασυνδυασμένο (υβριδικό) DNA.

Η αλληλουχία εισαγωγής DNA σε ένα πλασμίδιο (πλασμιδιακός φορέας) χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο περιορισμού(Εικ. 37 Α):

1) περιορισμός– κοπή του μορίου DNA με περιοριστικό ένζυμο, σχηματισμός θραυσμάτων DNA και απομόνωση του απαιτούμενου γονιδίου;

2) συμπερίληψη του απομονωμένου γονιδίου σε ένα πλασμίδιοδηλ. λήψη ανασυνδυασμένου (υβριδικού) DNA με εισαγωγή ενός θραύσματος ξένου DNA σε ένα πλασμίδιο.

3) απολίνωση– ενζυμική διασύνδεση λιγάσηπλασμίδιο (φορέας) και ξένα θραύσματα DNA. Στην περίπτωση αυτή, τα άκρα του φορέα και του ξένου DNA (τα λεγόμενα «κολλώδη άκρα») είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους.

4) μεταμόρφωση– εισαγωγή ενός ανασυνδυασμένου πλασμιδίου στο γονιδίωμα ενός άλλου κυττάρου (κυττάρου λήπτη), ιδίως ενός βακτηριακού κυττάρου.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα πλασμίδια διεισδύουν μόνο σε ένα μέρος των θεραπευόμενων βακτηρίων. Τα μετασχηματισμένα βακτήρια, μαζί με τα πλασμίδια, αποκτούν αντοχή σε ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό, γεγονός που καθιστά δυνατό τον διαχωρισμό τους από τα μη μετασχηματισμένα βακτήρια που πεθαίνουν σε ένα μέσο που περιέχει ένα αντιβιοτικό. Κάθε ένα από τα μετασχηματισμένα βακτήρια, τοποθετημένο σε ένα θρεπτικό μέσο, ​​πολλαπλασιάζεται και σχηματίζει μια αποικία πολλών χιλιάδων απογόνων - έναν κλώνο.

5) διαλογής– επιλογή μεταξύ μετασχηματισμένων βακτηρίων αυτών που περιέχουν πλασμίδια με το επιθυμητό γονίδιο.

Διαγονιδιακά ζώα και φυτά

Κλωνοποιημένα γονίδια εισάγονται σε αυγά θηλαστικών ή φυτικούς πρωτοπλάστες (ένα απομονωμένο κύτταρο χωρίς κυτταρικό τοίχωμα) χρησιμοποιώντας μικροέγχυση και στη συνέχεια αναπτύσσονται ζώα ή φυτά από αυτά, στο γονιδίωμα των οποίων λειτουργούν ξένα γονίδια. Τα φυτά και τα ζώα των οποίων το γονιδίωμα έχει αλλοιωθεί μέσω εργασιών γενετικής μηχανικής ονομάζονται διαγονιδιακές οργανώσεις (διαγονιδιακά φυτά και ζώα), γιατί περιέχει ξένα γονίδια. Ελήφθησαν διαγονιδιακά ποντίκια, κουνέλια, χοίροι και πρόβατα. Το γονιδίωμά τους περιέχει γονίδια από βακτήρια, θηλαστικά και ανθρώπους. Έχουν ληφθεί διαγονιδιακά φυτά (καλαμπόκι, πιπεριές, ντομάτες, σιτάρι, σίκαλη, όσπρια, πατάτες κ.λπ.) που περιέχουν γονίδια από μη συγγενικά είδη. Τα διαγονιδιακά φυτά είναι ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα, τα έντομα, τις δυσμενείς συνθήκες βροχής κ.λπ. Το πρόβλημα της αλλαγής της κληρονομικότητας πολλών αγροτικών φυτών σταδιακά λύνεται.

Γενετικός χάρτης χρωμοσωμάτων. Γονιδιακή θεραπεία

Ένας γενετικός χάρτης χρωμοσωμάτων είναι ένα διάγραμμα της σχετικής διάταξης των γονιδίων που βρίσκονται στην ίδια ομάδα σύνδεσης. Τέτοιοι χάρτες καταρτίζονται για κάθε ζεύγος ομόλογων χρωμοσωμάτων. Ο γενετικός χάρτης δείχνει τη σειρά των γονιδίων στο χρωμόσωμα και την απόσταση μεταξύ τους (το ποσοστό διασταύρωσης μεταξύ ορισμένων γονιδίων). Έτσι, η δημιουργία νέων στελεχών μικροοργανισμών ικανών να συνθέτουν ορμόνες, πρωτεΐνες και φάρμακα βασίζεται στη γνώση των γενετικών χαρτών των μικροοργανισμών. Οι ανθρώπινοι γενετικοί χάρτες είναι απαραίτητοι για την ιατρική γενετική. Η γνώση σχετικά με τον εντοπισμό ενός γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα χρησιμοποιείται στη διάγνωση μιας σειράς κληρονομικών ασθενειών, καθώς και στη γονιδιακή θεραπεία για τη διόρθωση της δομής και της λειτουργίας των γονιδίων.

Γονιδιακή θεραπεία -αντικατάσταση ελαττωματικών γονιδίων με άθικτα ή διόρθωση της δομής τους.

Για την καταπολέμηση κληρονομικών, ογκολογικών και σχετιζόμενων με την ηλικία ασθενειών, αναπτύσσονται μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας που είναι ασφαλείς για τα ανθρώπινα κύτταρα. Χρησιμοποιώντας μεθόδους γονιδιακής θεραπείας, είναι δυνατή η αντικατάσταση ελαττωματικών γονιδίων στο σώμα στα οποία έχουν σημειωθεί σημειακές μεταλλάξεις με άθικτα. Στις μέρες μας, οι επιστήμονες κατακτούν μεθόδους ανθρώπινη βιοασφάλεια:εισαγωγή των απαραίτητων γονιδίων στα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος. Αυτό θα σας επιτρέψει να απαλλαγείτε από πολλές κληρονομικές ασθένειες.

Μικροβιολογική σύνθεση

Οι μέθοδοι γενετικής μηχανικής κατέστησαν δυνατή την εφαρμογή μικροβιολογική σύνθεση(Εικ. 37 Β). Χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής, οι μικροβιολόγοι μπόρεσαν να αποκτήσουν στελέχη βακτηρίων, χάρη στα οποία πραγματοποιείται με επιτυχία η μικροβιολογική σύνθεση. Για να γίνει αυτό, επιλέγονται τα απαραίτητα βακτηριακά κύτταρα που δεν περιέχουν πλασμίδια. Απομονώνονται μόρια DNA με δεδομένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων, τα οποία καθορίζουν την ανάπτυξη του επιθυμητού χαρακτηριστικού. Ένα πλασμίδιο με ενσωματωμένο τμήμα DNA (γονιδίωμα) εισάγεται σε ένα βακτηριακό κύτταρο, στο οποίο αρχίζει να λειτουργεί το ενσωματωμένο τμήμα DNA (αντιγραφή, μεταγραφή, διαδικασίες μετάφρασης) και η απαιτούμενη πρωτεΐνη (ιντερφερόνη, γενφερόνη, ανοσοσφαιρίνη, ινσουλίνη, σωματοτροπίνη, κ.λπ.) συντίθεται στο βακτηριακό κύτταρο. ). Σε βιομηχανικές ποσότητες λαμβάνονται ορμόνες (ινσουλίνη, σωματοτροπίνη), πολλά αμινοξέα, αντιβιοτικά, εμβόλια κλπ. Τέτοια βακτήρια πολλαπλασιάζονται σε βιομηχανική κλίμακα και παράγουν την απαραίτητη πρωτεΐνη.

Χρησιμοποιώντας γενετικές μεθόδους, ελήφθη ένα στέλεχος του μικροοργανισμού Pseudomonas denitrificans, το οποίο παράγει δεκάδες φορές περισσότερη βιταμίνη C και βιταμίνες Β από την αρχική μορφή. ένα νέο στέλεχος του βακτηρίου Micrococcus glutamicus εκκρίνει εκατοντάδες φορές περισσότερο αμινοξύ λυσίνη από την αρχική (άγρια) καλλιέργεια του βακτηρίου που παράγει λυσίνη.

Κυτταρική μηχανική

Κυτταρική μηχανική– καλλιέργεια μεμονωμένων κυττάρων ή ιστών σε ειδικά τεχνητά μέσα, ανάπτυξη μεθόδων δημιουργίας νέου τύπου κυττάρων με υβριδισμό τους, αντικατάσταση χρωμοσωμάτων και ανάπτυξη υβριδίων από αυτά.

1. Μέθοδος ιστοκαλλιέργειας

Η μέθοδος συνίσταται στην καλλιέργεια απομονωμένων κυττάρων ή κομματιών ιστού σε ένα τεχνητό θρεπτικό μέσο υπό κατάλληλες μικροκλιματικές συνθήκες. Ως αποτέλεσμα της καλλιέργειας, φυτικά κύτταρα ή κομμάτια ιστού αναγεννώνται σε ένα ολόκληρο φυτό. Με μικροκλωνικό πολλαπλασιασμό μεμονωμένων κυττάρων ή κομματιών ιστού (συνήθως το κορυφαίο μερίστωμα ενός στελέχους ή ρίζας), μπορούν να ληφθούν πολλά χρήσιμα φυτά. Οι μικροκλιματικές συνθήκες και τα θρεπτικά μέσα για την αναγέννηση καλλωπιστικών, πολιτιστικών και φαρμακευτικών φυτών επιλέγονται πειραματικά. Η ιστοκαλλιέργεια χρησιμοποιείται επίσης για την παραγωγή διπλοειδών φυτών μετά την επεξεργασία των αρχικών απλοειδών μορφών με κολχικίνη.

2. Σωματικός υβριδισμός

Ο σωματικός υβριδισμός περιλαμβάνει την παραγωγή υβριδικών κυττάρων και από αυτά - νέες μορφές. τεχνητή γονιμοποίηση ωαρίων.

Λήψη νέων υβριδικών φυτών με σύντηξη πρωτοπλαστών (πυρήνας και κυτταρόπλασμα) διαφόρων κυττάρων σε καλλιέργεια ιστών. Για τη σύντηξη πρωτοπλαστών, το φυτικό κυτταρικό τοίχωμα καταστρέφεται με τη βοήθεια ενζύμων και λαμβάνεται ένας απομονωμένος πρωτοπλάστης. Όταν καλλιεργούνται τέτοιοι πρωτοπλάστες διαφορετικών ειδών φυτών, συγχωνεύονται και σχηματίζουν μορφές με νέα χρήσιμα χαρακτηριστικά. Η τεχνητή γονιμοποίηση των ωαρίων πραγματοποιείται με τη μέθοδο της εξωσωματικής γονιμοποίησης (IVF), η οποία επιτρέπει τη γονιμοποίηση των ωαρίων in vitro με επακόλουθη εμφύτευση του εμβρύου σε πρώιμο στάδιο ανάπτυξης και την αντιμετώπιση ορισμένων μορφών στειρότητας στον άνθρωπο.

3. Χρωμοσωμική μηχανική– αντικατάσταση μεμονωμένων χρωμοσωμάτων σε φυτικά κύτταρα ή προσθήκη νέων. Τα διπλοειδή έχουν ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων και τέτοιοι οργανισμοί ονομάζονται δισωματικοί. Αν μείνει ένα χρωμόσωμα σε οποιοδήποτε ζεύγος, τότε σχηματίζεται μονοσωμία. Εάν προσθέσετε ένα τρίτο ομόλογο χρωμόσωμα σε οποιοδήποτε ζεύγος, σχηματίζεται ένα τρισωμικό κ.λπ. Είναι δυνατόν να αντικατασταθούν μεμονωμένα χρωμοσώματα ενός είδους με χρωμοσώματα άλλου είδους. Ελήφθη οι μορφές ονομάζονται υποκατεστημένες.

Γενετική μηχανική

Η σύγχρονη βιολογία διαφέρει θεμελιωδώς από την παραδοσιακή βιολογία όχι μόνο στο μεγαλύτερο βάθος ανάπτυξης των γνωστικών ιδεών, αλλά και σε μια στενότερη σχέση με τη ζωή της κοινωνίας και με την πρακτική. Μπορούμε να πούμε ότι στην εποχή μας η βιολογία έχει γίνει ένα μέσο μεταμόρφωσης του ζωντανού κόσμου προκειμένου να ικανοποιηθούν οι υλικές ανάγκες της κοινωνίας. Αυτό το συμπέρασμα καταδεικνύεται κυρίως από τη στενή σύνδεση της βιολογίας με τη βιοτεχνολογία, η οποία έχει γίνει ο σημαντικότερος τομέας παραγωγής υλικού, ισότιμος εταίρος των μηχανικών και χημικών τεχνολογιών που δημιουργούνται από τον άνθρωπο, καθώς και με την ιατρική.

Από την έναρξή τους, η βιολογία και η βιοτεχνολογία αναπτύχθηκαν πάντα μαζί, με τη βιολογία να αποτελεί την επιστημονική βάση της βιοτεχνολογίας από την αρχή. Ωστόσο, για μεγάλο χρονικό διάστημα, η έλλειψη των δικών της δεδομένων δεν επέτρεψε στη βιολογία να ασκήσει πολύ μεγάλη επιρροή στη βιοτεχνολογία. Η κατάσταση άλλαξε δραματικά με τη δημιουργία στο δεύτερο μισό του 20ού αιώνα. μεθοδολογία γενετικής μηχανικής,που νοείται ως γενετικός χειρισμός με σκοπό την κατασκευή νέων και την ανακατασκευή υπαρχόντων γονότυπων. Όντας από τη φύση της μεθοδολογικό επίτευγμα, η γενετική μηχανική δεν οδήγησε σε ρήξη στις υπάρχουσες ιδέες για τα βιολογικά φαινόμενα, δεν επηρέασε τις θεμελιώδεις αρχές της βιολογίας, όπως η ραδιοαστρονομία δεν κλόνισε τις θεμελιώδεις αρχές της αστροφυσικής, την καθιέρωση της « μηχανικό ισοδύναμο θερμότητας» δεν οδήγησε σε αλλαγή στους νόμους της θερμικής αγωγιμότητας, αλλά η απόδειξη ότι η ατομική θεωρία της ύλης δεν άλλαξε τις σχέσεις μεταξύ θερμοδυναμικής, υδροδυναμικής και της θεωρίας της ελαστικότητας (A.A. Baev).

Ωστόσο, η γενετική μηχανική έχει ανοίξει μια νέα εποχή στη βιολογία για το λόγο ότι έχουν εμφανιστεί νέες ευκαιρίες για διείσδυση στα βάθη των βιολογικών φαινομένων προκειμένου να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι μορφές ύπαρξης της ζωντανής ύλης, να μελετηθεί αποτελεσματικότερα η δομή και η λειτουργία των γονιδίων στο το μοριακό επίπεδο και να κατανοήσουν τους λεπτούς μηχανισμούς λειτουργίας τους.γενετική συσκευή. Η επιτυχία της γενετικής μηχανικής σημαίνει επανάσταση στη σύγχρονη

Φυσικές Επιστήμες. Καθορίζουν τα κριτήρια για την αξία των σύγχρονων ιδεών σχετικά με τα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των μοριακών και κυτταρικών επιπέδων της ζωντανής ύλης. Τα σύγχρονα δεδομένα για τα έμβια όντα είναι τεράστιας εκπαιδευτικής σημασίας, επειδή παρέχουν κατανόηση μιας από τις πιο σημαντικές πτυχές του οργανικού κόσμου και ως εκ τούτου συμβάλλουν ανεκτίμητη στη δημιουργία μιας επιστημονικής εικόνας του κόσμου. Έτσι, επεκτείνοντας δραματικά τη γνωστική της βάση, η βιολογία μέσω της γενετικής μηχανικής είχε επίσης ηγετική επιρροή στην άνοδο της βιοτεχνολογίας.

Η γενετική μηχανική δημιουργεί τη βάση για την κατανόηση των μεθόδων και των τρόπων «κατασκευής» νέων ή βελτίωσης των υπαρχόντων οργανισμών, δίνοντάς τους μεγαλύτερη οικονομική αξία και την ικανότητα να αυξάνουν απότομα την παραγωγικότητα των βιοτεχνολογικών διεργασιών. Ωστόσο, η γενετική μηχανική έχει δημιουργήσει νέους ορίζοντες για την ιατρική στη διάγνωση και θεραπεία πολλών ασθενειών, τόσο μη κληρονομικών όσο και κληρονομικών. Άνοιξε νέους δρόμους στην αναζήτηση νέων φαρμάκων και υλικών που χρησιμοποιούνται στην ιατρική. Η γενετική μηχανική και η βιοτεχνολογία έχουν τονώσει την ανάπτυξη τεχνικών βιοανοτεχνολογίας.

Στο πλαίσιο της γενετικής μηχανικής υπάρχουν γενετικήΚαι κυτταρικόςμηχανική. Η γενετική μηχανική αναφέρεται σε χειρισμούς για τη δημιουργία ανασυνδυασμένων μορίων DNA. Αυτή η μεθοδολογία αναφέρεται συχνά ως μοριακή κλωνοποίηση, κλωνοποίηση γονιδίων, τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA ή απλώς γενετικός χειρισμός. Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι τα αντικείμενα της γενετικής μηχανικής είναι μόρια DNA και μεμονωμένα γονίδια. Αντίθετα, η κυτταρική μηχανική αναφέρεται στον γενετικό χειρισμό απομονωμένων μεμονωμένων κυττάρων ή ομάδων κυττάρων φυτών και ζώων.

Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΚΑΙ ΤΑ ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΤΗΣ

Η γενετική μηχανική είναι ένα σύνολο από διάφορες πειραματικές τεχνικές (τεχνικές) που παρέχουν σχεδιασμό (ανακατασκευή) και κλωνοποίηση μορίων και γονιδίων DNA για συγκεκριμένους σκοπούς.

Οι μέθοδοι γενετικής μηχανικής χρησιμοποιούνται με μια συγκεκριμένη σειρά (Εικ. 127) και διακρίνονται διάφορα στάδια στην υλοποίηση.

όχι ένα τυπικό πείραμα γενετικής μηχανικής που στοχεύει στην κλωνοποίηση ενός γονιδίου, συγκεκριμένα:

1. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από τα κύτταρα του οργανισμού ενδιαφέροντος (αρχική) και απομόνωση του φορέα DNA.

2. Κοπή (περιορισμός) του DNA του αρχικού οργανισμού σε θραύσματα που περιέχουν γονίδια ενδιαφέροντος χρησιμοποιώντας ένα από τα περιοριστικά ένζυμα και απομόνωση αυτών των γονιδίων από το μείγμα περιορισμού. Ταυτόχρονα, το DNA του φορέα κόβεται (περιορίζεται), μετατρέποντάς το από κυκλική δομή σε γραμμική.

3. Σύνδεση του ενδιαφέροντος τμήματος DNA (γονίδιο) με τον φορέα DNA προκειμένου να ληφθούν υβριδικά μόρια DNA.

4. Εισαγωγή μορίων ανασυνδυασμένου DNA με μετασχηματισμό σε κάποιον άλλο οργανισμό, για παράδειγμα σε Ε. coliή σωματικά κύτταρα.

5. Σπορά βακτηρίων στα οποία εισήχθησαν υβριδικά μόρια DNA σε θρεπτικά μέσα που επιτρέπουν την ανάπτυξη μόνο κυττάρων που περιέχουν μόρια υβριδικού DNA.

6. Προσδιορισμός αποικιών που αποτελούνται από βακτήρια που περιέχουν υβριδικά μόρια DNA.

7. Απομόνωση κλωνοποιημένου DNA (κλωνοποιημένα γονίδια) και χαρακτηρισμός του, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας αζωτούχων βάσεων στο κλωνοποιημένο θραύσμα DNA.

Ρύζι. 127.Διαδοχικά στάδια ενός πειράματος γενετικής μηχανικής

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, τα βακτήρια ανέπτυξαν την ικανότητα να συνθέτουν τα λεγόμενα περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες), τα οποία έγιναν μέρος του κυτταρικού (βακτηριακού) συστήματος τροποποίησης περιορισμού. Στα βακτήρια, τα συστήματα περιορισμού-τροποποίησης είναι ένα ενδοκυτταρικό ανοσοποιητικό σύστημα για προστασία από ξένο DNA. Σε αντίθεση με τους ανώτερους οργανισμούς, στους οποίους η αναγνώριση και η καταστροφή ιών, βακτηρίων και άλλων παθογόνων γίνεται εξωκυτταρικά, στα βακτήρια, η προστασία από ξένο DNA (DNA φυτών και ζώων στα σώματα των οποίων ζουν) συμβαίνει ενδοκυτταρικά, δηλ. όταν ξένο DNA διεισδύει στο κυτταρόπλασμα των βακτηρίων. Προκειμένου να προστατευθούν, τα βακτήρια έχουν επίσης εξελίξει την ικανότητα να «επισημάνουν» το δικό τους DNA με βάσεις μεθυλίωσης σε ορισμένες αλληλουχίες. Για τον ίδιο λόγο, το ξένο DNA, λόγω της απουσίας ομάδων μεθυλίου στις ίδιες αλληλουχίες, τήκεται (κόβεται) σε θραύσματα από διάφορα βακτηριακά περιοριστικά ένζυμα και στη συνέχεια αποικοδομείται από βακτηριακές εξωνουκλεάσες σε μηδενικά. Μπορούμε να πούμε ότι με αυτόν τον τρόπο τα βακτήρια προστατεύονται από το DNA των φυτών και των ζώων, στο σώμα των οποίων ζουν προσωρινά (ως παθογόνα) ή μόνιμα (ως σαπρόφυτα).

Τα περιοριστικά ένζυμα απομονώθηκαν αρχικά από Ε. coliτο 1968. Αποδείχθηκε ότι είναι ικανά να κόβουν (λιώνουν) μόρια DNA σε διαφορετικές θέσεις περιορισμού (θέσεις). Αυτά τα ένζυμα ονομάστηκαν ενδονουκλεάσες τάξης Ι. Στη συνέχεια ανακαλύφθηκαν ενδονουκλεάσες κατηγορίας ΙΙ σε βακτήρια, τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά θέσεις περιορισμού σε ξένο DNA και επίσης πραγματοποιούν περιορισμό σε αυτές τις θέσεις. Είναι ένζυμα αυτής της κατηγορίας που άρχισαν να χρησιμοποιούνται στη γενετική μηχανική. Ταυτόχρονα, ανακαλύφθηκαν ένζυμα κατηγορίας III που λιώνουν το DNA κοντά σε θέσεις αναγνώρισης, αλλά αυτά τα ένζυμα δεν είναι σημαντικά στη γενετική μηχανική.

Η δράση του συστήματος περιορισμού-τροποποίησης «εξορθολογίζεται» από τις λεγόμενες παλινδρομικές (αναγνωριστικές) αλληλουχίες αζωτούχων βάσεων, οι οποίες είναι θέσεις περιορισμού του DNA. Οι παλινδρομικές ακολουθίες είναι ακολουθίες βάσεων που διαβάζονται με τον ίδιο τρόπο προς τα εμπρός και προς τα πίσω, όπως μια ακολουθία γραμμάτων ραντάρ.Δεδομένου ότι οι κλώνοι DNA έχουν αντιπαράλληλη κατεύθυνση, μια ακολουθία θεωρείται παλινδρομική εάν είναι πανομοιότυπη όταν διαβάζεται προς την κατεύθυνση από το 5" προς το άκρο 3" στο επάνω μέρος και στον κάτω κλώνο από το άκρο 3" προς το 5". , συγκεκριμένα:

Τα παλίνδρομα μπορούν να είναι οποιουδήποτε μεγέθους, αλλά τα περισσότερα παλίνδρομα που χρησιμοποιούνται ως θέσεις αναγνώρισης περιοριστικών ενζύμων αποτελούνται από 4, 5, 6 και σπάνια 8 βάσεις.

Τα περιοριστικά ένζυμα είναι ένα απολύτως απαραίτητο εργαλείο στη γενετική μηχανική για την αποκοπή θραυσμάτων ενδιαφέροντος (γονίδια) από μεγάλα μόρια DNA. Εφόσον είναι γνωστά περισσότερα από 100 ένζυμα περιορισμού, αυτό επιτρέπει την επιλογή περιοριστικών ενζύμων και την επιλεκτική εκτομή θραυσμάτων από το αρχικό DNA.

Ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό των περιοριστικών ενζύμων είναι ότι κόβουν μόρια σε πολλά θραύσματα (περιορισμούς) DNA με βήματα, με αποτέλεσμα στα προκύπτοντα άκρα η μία αλυσίδα να είναι μεγαλύτερη από την άλλη, σχηματίζοντας ένα είδος ουράς. Τέτοια άκρα (ουρές) ονομάζονται «κολλώδη» άκρα, καθώς είναι ικανά να αυτοσυμπληρωθούν.

Ας εξετάσουμε τα αποτελέσματα του περιορισμού χρησιμοποιώντας το παράδειγμα ενός από τα πιο γνωστά περιοριστικά ένζυμα Eco RIαπό το σύστημα τροποποίησης περιορισμών E. coI.Αντί να λιώσει το DNA στο κέντρο της παλινδρομικής αλληλουχίας αναγνώρισης, αυτό το ένζυμο λιώνει το DNA έξω από το κέντρο και παράγει 4 αυτοσυμπληρωματικά («κολλώδη») άκρα που αποτελούνται από διαφορετικούς αριθμούς νουκλεοτιδίων, και συγκεκριμένα:

Αυτά τα κολλώδη άκρα είναι χρήσιμα σε πειράματα γενετικής μηχανικής επειδή μπορούν να επανασυνδεθούν συμπληρωματικά σε χαμηλές θερμοκρασίες, επιτρέποντας αποτελεσματικό κλείσιμο θραυσμάτων DNA.

Οι θέσεις αναγνώρισης και οι θέσεις τήξης στην περίπτωση άλλων περιοριστικών ενζύμων έχουν διαφορετικό περιεχόμενο, και συγκεκριμένα:

Μετά τον περιορισμό του DNA, απομονώνονται θραύσματα DNA περιορισμού (τεμάχια περιορισμού DNA) από το μείγμα περιορισμού, τα οποία στη συνέχεια είναι απαραίτητα για συνδυασμό με τον φορέα. Για την απομόνωση περιοριστικών ενζύμων DNA, χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση, καθώς με αυτή τη μέθοδο είναι πολύ εύκολο να κλασματοποιηθεί το περιορισμένο DNA λόγω του μεγέθους των περιοριστικών θραυσμάτων και των σταθερών αναλογιών ηλεκτρικού φορτίου-μάζας. Τα θραύσματα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο μεταναστεύουν κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης με συχνότητα που εξαρτάται από το μέγεθός τους (μάζα). Όσο μεγαλύτερο (μακρύτερο) είναι το θραύσμα, τόσο πιο αργά μεταναστεύει στο ηλεκτρικό πεδίο. Το υλικό που χρησιμοποιείται για την ηλεκτροφόρηση είναι μη φορτίσιμη αγαρόζη ή πολυακρυλαμίδιο. Για την αναγνώριση θραυσμάτων, χρησιμοποιείται βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο χρωματίζει τα θραύσματα, γεγονός που καθιστά ευκολότερο τον εντοπισμό τους.

Η αποτελεσματικότητα της ηλεκτροφόρησης είναι πολύ υψηλή, καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό θραυσμάτων των οποίων τα μεγέθη κυμαίνονται από 2 έως 50.000 βάσεις.

Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα θραύσματα απομονώνονται από την αγαρόζη χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους. Με βάση τα αποτελέσματα σύγκρισης μεγεθών

των περιοριστικών ενζύμων του ίδιου DNA που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας διαφορετικά ένζυμα περιορισμού, κατασκευάζονται χάρτες περιορισμού, οι οποίοι δείχνουν τις θέσεις περιορισμού καθενός από τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιούνται. Πρακτικά, οι χάρτες περιορισμού καθιστούν δυνατό τον προσδιορισμό όχι μόνο του μεγέθους των θέσεων περιορισμού, αλλά και τον προσδιορισμό της θέσης των τόπων ορισμένων γονιδίων στα μόρια του DNA.

Δεδομένου ότι σε ανώτερους οργανισμούς, συντίθεται ετερογενές DNA κατά τη μεταγραφή, η οποία διορθώνεται με επεξεργασία, η γενετική μηχανική χρησιμοποιεί συνήθως συμπληρωματικό DNA (cDNA), το οποίο λαμβάνεται χρησιμοποιώντας mRNA ως πρότυπο, στο οποίο η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει μονόκλωνο DNA (cDNA). , το οποίο είναι αντίγραφο του mRNA. Αυτά τα μονόκλωνα DNA στη συνέχεια μετατρέπονται σε δίκλωνο DNA. Το cDNA θεωρείται ότι περιέχει συνεχείς αλληλουχίες νουκλεοτιδίων (μεταγραφή και μετάφραση). Είναι το cDNA που χρησιμοποιείται για περιορισμό.

Θραύσματα DNA (περιορισμοί) που απομονώνονται μετά από ηλεκτροφόρηση από πηκτώματα αγαρόζης μπορούν προκαταρκτικά να υποβληθούν σε προσδιορισμό αλληλουχίας, δηλ. να προσδιορίσετε τη νουκλεοτιδική τους αλληλουχία. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται χημικές και ενζυμικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας. Η χημική μέθοδος βασίζεται στη λήψη θραυσμάτων επισημασμένων με ραδιενεργό φώσφορο (32 Ρ) και στην αφαίρεση μιας από τις βάσεις από αυτά τα θραύσματα, ακολουθούμενη από τη λήψη υπόψη των αποτελεσμάτων της αυτοραδιογραφίας πηκτωμάτων που περιέχουν αυτά τα θραύσματα. Η ενζυματική μέθοδος βασίζεται στην εισαγωγή ενός νουκλεοτιδίου στο τέλος του αναλυόμενου θραύσματος, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη σύνθεση διαφορετικών θραυσμάτων in vitro,αναλύθηκε για αλληλουχία νουκλεοτιδίων ηλεκτροφορητικά. Για να μελετήσετε συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο DNA, χρησιμοποιήστε

επίσης υβριδισμός DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern

και νότια λεκέδες.

Γενετικοί φορείς. Το τμήμα DNA (γονίδιο) που προορίζεται για μοριακή κλωνοποίηση πρέπει να έχει την ικανότητα να αναδιπλασιάζεται όταν μεταφέρεται σε βακτηριακό κύτταρο, δηλ. να είναι ένα αντίγραφο. Ωστόσο, δεν έχει τέτοια ικανότητα. Επομένως, για να εξασφαλιστεί η μεταφορά και η ανίχνευση των κλωνοποιημένων γονιδίων στα κύτταρα, συνδυάζονται με τους λεγόμενους γενετικούς φορείς. Το τελευταίο πρέπει να έχει τουλάχιστον δύο ιδιότητες. Πρώτον, τα διανύσματα πρέπει να είναι ικανά για αναπαραγωγή

σε κύτταρα και σε πολλά άκρα. Δεύτερον, πρέπει να παρέχουν τη δυνατότητα επιλογής κελιών που περιέχουν τον φορέα, δηλ. έχουν έναν δείκτη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αντι-επιλογή κυττάρων που περιέχουν τον φορέα μαζί με το κλωνοποιημένο γονίδιο (μόρια ανασυνδυασμένου DNA). Τα πλασμίδια και οι φάγοι πληρούν αυτές τις απαιτήσεις. Τα πλασμίδια είναι καλοί φορείς επειδή είναι αντίγραφα και μπορούν να περιέχουν γονίδια για αντοχή σε οποιοδήποτε αντιβιοτικό, γεγονός που επιτρέπει την επιλογή βακτηρίων για αντοχή σε αυτό το αντιβιοτικό και, επομένως, την εύκολη ανίχνευση μορίων ανασυνδυασμένου DNA

(Εικ. 128).

Ρύζι. 128.Διάνυσμα pBRl

Εφόσον δεν υπάρχουν φυσικοί φορείς πλασμιδίου, όλοι οι γνωστοί μέχρι σήμερα πλασμιδικοί φορείς έχουν κατασκευαστεί τεχνητά. Το αρχικό υλικό για τη δημιουργία ενός αριθμού γενετικών φορέων ήταν τα R-πλασμίδια, στα οποία η περίσσεια αλληλουχιών DNA, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με πολλαπλές θέσεις περιορισμού, αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα. Αυτή η διαγραφή προσδιορίστηκε από το γεγονός ότι ο φορέας πλασμιδίου θα πρέπει να έχει μόνο μία θέση αναγνώρισης για ένα ένζυμο περιορισμού, και αυτή η θέση θα πρέπει να βρίσκεται σε μια λειτουργικά ασήμαντη περιοχή του πλασμιδικού γονιδιώματος. Για παράδειγμα, ο φορέας πλασμιδίου pBR 322, ο οποίος έχει γονίδια αντίστασης στην αμπικιλλίνη και την τετρακυκλίνη, γεγονός που το καθιστά πολύ βολικό

για την επιλογή βακτηρίων που περιέχουν το κλωνοποιημένο τμήμα DNA, έχει μεμονωμένες θέσεις περιορισμού για περισσότερα από 20 ένζυμα περιορισμού, συμπεριλαμβανομένων γνωστών περιοριστικών ενζύμων όπως Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II και Sal I.

Οι φορείς φάγων έχουν επίσης έναν αριθμό πλεονεκτημάτων. Μπορεί να περιλαμβάνουν μεγαλύτερα (μακρύτερα) κλωνοποιημένα θραύσματα DNA σε σύγκριση με φορείς πλάσματος. Περαιτέρω, η μεταφορά του κλωνοποιημένου θραύσματος από φάγους σε κύτταρα ως αποτέλεσμα της μόλυνσης των τελευταίων είναι πιο αποτελεσματική από τον μετασχηματισμό του DNA. Τέλος, οι φορείς φάγων επιτρέπουν πιο αποτελεσματική διαλογή (αναγνώριση) στην επιφάνεια άγαρ αποικιών που περιέχουν κύτταρα που φέρουν το γονίδιο που κλωνοποιείται. Πολλοί φορείς φάγων βασίζονται στον λάμδα φάγο.

Εκτός από τους φάγους, χρησιμοποιούνται επίσης άλλοι ιικοί φορείς που κατασκευάζονται με βάση τον ιό του έρπητα, καθώς και φορείς που κατασκευάζονται με βάση το DNA του ζυμομύκητα.

Εάν η κλωνοποίηση γονιδίων πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας κύτταρα θηλαστικών ή φυτών, τότε οι απαιτήσεις για φορείς είναι οι ίδιες όπως στην περίπτωση της κλωνοποίησης σε βακτηριακά κύτταρα.

Κατασκευή μορίων ανασυνδυασμένου DNA. Η άμεση κατασκευή των μορίων ανασυνδυασμένου DNA ακολουθεί αφού ληφθούν οι περιορισμοί του μελετημένου DNA και του DNA του φορέα. Συνίσταται στην ένωση των περιοριστικών τμημάτων του υπό μελέτη DNA με τον περιορισμό του DNA φορέα, το οποίο, ως αποτέλεσμα του περιορισμού, μετατρέπεται από κυκλικό σε γραμμικό DNA.

Για τη σύνδεση θραυσμάτων του υπό μελέτη DNA με τον φορέα DNA, χρησιμοποιείται DNA λιγάση (Εικ. 129). Η σύνδεση θα είναι επιτυχής εάν οι δομές αλληλασφάλισης έχουν 3"-υδροξυλικές και 5"-φωσφορικές ομάδες και εάν αυτές οι ομάδες είναι τοποθετημένες κατάλληλα η μία σε σχέση με την άλλη. Τα θραύσματα συνδυάζονται μέσω των κολλωδών άκρων τους ως αποτέλεσμα της αυτοσυμπληρωματικότητας. Σε υψηλές συγκεντρώσεις θραυσμάτων, τα τελευταία από καιρό σε καιρό γίνονται στη σωστή θέση (το ένα απέναντι από το άλλο). Πολλά περιοριστικά ένζυμα, όπως το EcoRI, παράγουν κολλώδη άκρα που αποτελούνται από τέσσερις βάσεις. Η διαδικασία απολίνωσης των «κολλωδών» άκρων, που αποτελούνται από τέσσερις βάσεις, συμβαίνει σε χαμηλή θερμοκρασία (έως 12? C).

Ρύζι. 129.Απολίνωση DNA

Εάν η περιοριστική πέψη παράγει θραύσματα χωρίς κολλώδη άκρα, αυτά μετατρέπονται «αναγκαστικά» σε μόρια με κολλώδη άκρα χρησιμοποιώντας το ένζυμο τρανσφεράση. Αυτό το ένζυμο προσθέτει νουκλεοτίδια στο άκρο 3" του DNA. Μια ουρά πολυ-Α μπορεί να προστεθεί σε ένα θραύσμα και μια ουρά πολυ-Τ στο άλλο. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιείται επίσης για τη δημιουργία οποιωνδήποτε επιθυμητών άκρων DNA. Η αρχή της PCR βασίζεται στη μετουσίωση του DNA που απομονώνεται από τα κύτταρα και την «ανόπτηση» του με την προσθήκη ολιγονουκλεοτιδίων DNA που αποτελούνται από 15-20 νουκλεοτίδια το καθένα στις αλυσίδες επαναδιάταξης. αποστάσεις 50-2000 νουκλεοτιδίων Αποτελώντας «σπόρο» για τη σύνθεση DNA in vitro,επιτρέπουν στην πολυμεράση DNA να αντιγράψει εκείνες τις τομές που βρίσκονται μεταξύ των «εκκινητών». Αυτή η αντιγραφή παράγει μεγάλο αριθμό αντιγράφων του θραύσματος DNA που μελετάται.

Εισαγωγή μορίων ανασυνδυασμένου DNA στα κύτταρα. Αφού το θραύσμα DNA ενδιαφέροντος (γονίδιο) συγχωνευθεί με έναν γενετικό φορέα χρησιμοποιώντας λιγάση DNA, τα προκύπτοντα ανασυνδυασμένα μόρια εισάγονται στα κύτταρα προκειμένου να επιτευχθεί η αντιγραφή τους (λόγω του γενετικού φορέα) και να αυξηθεί ο αριθμός των αντιγράφων. Ο πιο δημοφιλής τρόπος εισαγωγής μορίων ανασυνδυασμένου DNA στα κύτταρα, στα οποία ένα πλασμίδιο χρησιμεύει ως φορέας, είναι ο μετασχηματισμός Ε. coli.Για το σκοπό αυτό, τα βακτηριακά κύτταρα υποβάλλονται σε προεπεξεργασία με ασβέστιο ή ρουβίδιο (ιόντα), κατά σειρά

ώστε να γίνουν «ικανοί» στην αντίληψη του ανασυνδυασμένου DNA. Για να αυξηθεί η συχνότητα διείσδυσης του DNA στα κύτταρα, χρησιμοποιείται η μέθοδος ηλεκτροδιάτρησης, η οποία περιλαμβάνει τη σύντομη έκθεση των κυττάρων σε έντονο ηλεκτρικό πεδίο. Αυτή η θεραπεία δημιουργεί κοιλότητες στις κυτταρικές μεμβράνες, οι οποίες επιτρέπουν στα κύτταρα να αντιλαμβάνονται καλύτερα το DNA. Μετά την εισαγωγή μορίων ανασυνδυασμένου DNA σε βακτήρια, τα τελευταία επιστρώνονται σε MPA (άγαρ πεπτόνης κρέατος) εμπλουτισμένο με αντιβιοτικά για την επιλογή των επιθυμητών κυττάρων, δηλ. κύτταρα που περιέχουν ανασυνδυασμένα μόρια DNA. Η συχνότητα μετασχηματισμού είναι χαμηλή. Τυπικά, εμφανίζεται ένας μετασχηματιστής ανά 105 σπόρους κύτταρα. Εάν ο φορέας είναι φάγος, τότε καταφεύγουν σε επιμόλυνση κυττάρων (βακτηρίων ή ζυμομυκήτων) με τον φάγο. Όσο για τα ζωικά σωματικά κύτταρα, αυτά διαμολύνονται με DNA παρουσία χημικών ουσιών που διευκολύνουν τη διέλευση του DNA μέσω των πλασματικών μεμβρανών. Είναι επίσης δυνατές οι άμεσες μικροενέσεις DNA σε ωοκύτταρα, καλλιεργημένα σωματικά κύτταρα και έμβρυα θηλαστικών.

Το πιο σημαντικό σημείο που σχετίζεται με τη μοριακή κλωνοποίηση είναι η αναζήτηση ενός τρόπου για να προσδιοριστεί εάν το κλωνοποιημένο θραύσμα περιλαμβάνεται πράγματι στον φορέα και, μαζί με τον φορέα, σχηματίζοντας ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA, εισέρχεται στα κύτταρα. Εάν μιλάμε για βακτηριακά κύτταρα, τότε μία από τις μεθόδους βασίζεται στη συνεκτίμηση της αδρανοποίησης παρεμβολής του γονιδίου αντίστασης στο πλασμίδιο (φορέας). Για παράδειγμα, στον πλασμιδιακό φορέα pBR 322, ο οποίος καθορίζει την αντίσταση στην αμπικιλλίνη και την τετρακυκλίνη, η μόνη θέση για το ένζυμο περιορισμού Pst I βρίσκεται στη θέση που καταλαμβάνεται από το γονίδιο αντοχής στην αμπικιλλίνη. Η σύντηξη PstI σε αυτή τη θέση δημιουργεί κολλώδη άκρα, επιτρέποντας την απολίνωση του κλωνοποιημένου θραύσματος στο DNA του φορέα. Ωστόσο, σε αυτή την περίπτωση, το γονίδιο αντοχής στην αμπικιλλίνη στο πλασμίδιο (φορέας) απενεργοποιείται, ενώ το γονίδιο αντοχής στην τετρακυκλίνη στον φορέα παραμένει ανέπαφο. Είναι το γονίδιο αντίστασης στην τετρακυκλίνη που χρησιμοποιείται για την επιλογή κυττάρων που μετασχηματίζονται από μόρια ανασυνδυασμένου DNA. Αυτό καθιστά δυνατό να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα των αποικιών που αναπτύσσονται σε ένα μέσο με τετρακυκλίνη περιέχουν πραγματικά μόρια ανασυνδυασμένου DNA· ελέγχονται με τη λεγόμενη «δοκιμή σημείου» σε ένα ζευγάρι πιάτων με στερεό μέσο, ​​ένα από τα οποία περιέχει αμπικιλλίνη. ενώ το άλλο στερείται αυτό το αντιβιοτικό. Το DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί είναι

μόνο σε προϊόντα μετασχηματισμού ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη. Όσον αφορά τα μετασχηματισμένα κύτταρα που είναι ταυτόχρονα ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη και στην τετρακυκλίνη (ArTc), περιέχουν μόρια πλασμιδίου (φορείς) που απέκτησαν αυθόρμητα κυκλικό σχήμα χωρίς την συμπερίληψη ξένου (κλωνοποιήσιμου) DNA.

Μια άλλη μέθοδος για την ανίχνευση της εισαγωγής ξένων (κλωνοποιήσιμων) θραυσμάτων σε έναν πλασμιδιακό φορέα βασίζεται στη χρήση ενός φορέα που περιέχει το γονίδιο β-γαλακτοσιδάσης. Η εισαγωγή ξένου DNA σε αυτό το γονίδιο απενεργοποιεί αναπόφευκτα τη σύνθεση της β-γαλακτοσιδάσης, η οποία μπορεί να ανιχνευθεί με την τοποθέτηση των μετασχηματισμένων κυττάρων σε μέσα που περιέχουν υποστρώματα β-γαλακτοσιδάσης. Αυτό το μέσο επιτρέπει την επιλογή έγχρωμων αποικιών κυττάρων. Υπάρχουν και άλλες μέθοδοι.

Όπως σημειώθηκε ήδη, γραμμικά θραύσματα περιορισμού του DNA του φορέα είναι ικανά να αποκαταστήσουν την κυκλική δομή χωρίς να συμπεριλαμβάνουν κλωνοποιημένα τμήματα. Για να μειωθεί η συχνότητα του αυθόρμητου σχηματισμού τέτοιων μορίων DNA κυκλικού φορέα, οι περιοριστές DNA φορέων υποβάλλονται σε επεξεργασία με φωσφατάση. Ως αποτέλεσμα αυτού, ο σχηματισμός κυκλικών μορίων DNA καθίσταται αδύνατος, αφού τα άκρα 5"-PO 4 που είναι απαραίτητα για τη δράση της λιγάσης θα απουσιάζουν.

Το σύνολο των αποικιών μετασχηματισμού που αναπτύσσονται σε ένα εκλεκτικό μέσο είναι ένα σύνολο κυττάρων που περιέχει κλώνους διαφορετικών θραυσμάτων (γονιδίων) του κλωνοποιημένου γονιδιώματος ή cDNA. Οι συλλογές αυτών των κλώνων σχηματίζουν τις λεγόμενες βιβλιοθήκες DNA, που χρησιμοποιούνται ευρέως σε εργασίες γενετικής μηχανικής.

Το τελικό στάδιο της κλωνοποίησης γονιδίων είναι η απομόνωση και η μελέτη του κλωνοποιημένου DNA, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας. Υποσχόμενα στελέχη βακτηρίων ή σωματικών κυττάρων που περιέχουν μόρια ανασυνδυασμένου DNA που ελέγχουν τη σύνθεση πρωτεϊνών ενδιαφέροντος που έχουν εμπορική αξία μεταφέρονται στη βιομηχανία.

ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Όπως σημειώθηκε στην αρχή του κεφαλαίου, η κυτταρική μηχανική αναφέρεται στον γενετικό χειρισμό απομονωμένων ζωικών και φυτικών κυττάρων. Αυτοί οι χειρισμοί πραγματοποιούνται συχνά in vitro,και κύριος στόχος τους είναι να αποκτήσουν γονότυπους αυτών των οργανισμών με συγκεκριμένες ιδιότητες, κυρίως οικονομικά χρήσιμες. Οσον αφορά-

Από τον άνθρωπο, η κυτταρική μηχανική αποδείχθηκε ότι ήταν εφαρμόσιμη στα γεννητικά του κύτταρα.

Απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη της κυτταρικής μηχανικής σε ανθρώπους και ζώα ήταν η ανάπτυξη μεθόδων για την καλλιέργεια των σωματικών τους κυττάρων σε τεχνητά θρεπτικά μέσα, καθώς και η λήψη υβριδίων σωματικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των διαειδικών υβριδίων. Με τη σειρά τους, οι πρόοδοι στην καλλιέργεια σωματικών κυττάρων έχουν επηρεάσει τη μελέτη των γεννητικών κυττάρων και τη γονιμοποίηση σε ανθρώπους και ζώα. Από τη δεκαετία του '60. ΧΧ αιώνα Σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο, πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα για τη μεταμόσχευση πυρήνων σωματικών κυττάρων σε ωάρια τεχνητά χωρίς πυρήνες. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων ήταν συχνά αντιφατικά, αλλά γενικά οδήγησαν στην ανακάλυψη της ικανότητας των κυτταρικών πυρήνων να διασφαλίζουν την κανονική ανάπτυξη του ωαρίου (βλ. Κεφάλαιο IV).

Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης της ανάπτυξης γονιμοποιημένων ωαρίων στη δεκαετία του '60. ΧΧ αιώνα Ξεκίνησαν επίσης έρευνες για τον προσδιορισμό της πιθανότητας γονιμοποίησης ωαρίων έξω από το σώμα της μητέρας. Πολύ γρήγορα, αυτές οι μελέτες οδήγησαν στην ανακάλυψη της δυνατότητας γονιμοποίησης ωαρίων με σπέρμα in vitro και στην περαιτέρω ανάπτυξη των εμβρύων που σχηματίζονται με αυτόν τον τρόπο όταν εμφυτεύονται στη μήτρα μιας γυναίκας. Η περαιτέρω βελτίωση των μεθόδων που αναπτύχθηκαν σε αυτόν τον τομέα οδήγησε στο γεγονός ότι η γέννηση παιδιών με «δοκιμαστικό σωλήνα» έχει γίνει πραγματικότητα. Ήδη από το 1981 γεννήθηκαν στον κόσμο 12 παιδιά, των οποίων η ζωή δόθηκε στο εργαστήριο, σε δοκιμαστικό σωλήνα. Επί του παρόντος, αυτό το τμήμα της κυτταρικής μηχανικής έχει γίνει ευρέως διαδεδομένο και ο αριθμός των παιδιών «δοκιμαστικού σωλήνα» είναι ήδη δεκάδες χιλιάδες (Εικ. 130). Στη Ρωσία, οι εργασίες για την απόκτηση παιδιών «δοκιμαστικού σωλήνα» ξεκίνησαν μόλις το 1986.

Το 1993, αναπτύχθηκε μια τεχνική για την παραγωγή μονοζυγωτικών ανθρώπινων διδύμων in vitroδιαιρώντας τα έμβρυα σε βλαστομερή και αυξάνοντας τα τελευταία σε 32 κύτταρα, μετά τα οποία θα μπορούσαν να εμφυτευθούν στη μήτρα μιας γυναίκας.

Επηρεασμένος από τα αποτελέσματα που σχετίζονται με την παραγωγή παιδιών «δοκιμαστικού σωλήνα», αναπτύχθηκε επίσης μια τεχνολογία στα ζώα, που ονομάζεται μεταφύτευσηέμβρυα. Συνδέεται με την ανάπτυξη μιας μεθόδου πρόκλησης πολυωορρηξίας, μεθόδων τεχνητής γονιμοποίησης ωαρίων και εμφύτευσης εμβρύων στο σώμα ζώων - θετών μητέρων. Η ουσία αυτής της τεχνολογίας έγκειται στα εξής:

shyu. Σε μια αγελάδα υψηλής παραγωγικότητας χορηγείται ένεση με ορμόνες, με αποτέλεσμα την πολυωορρηξία, η οποία περιλαμβάνει την ωρίμανση 10-20 κυττάρων ταυτόχρονα. Τα ωάρια στη συνέχεια γονιμοποιούνται τεχνητά με αρσενικά αναπαραγωγικά κύτταρα στον ωαγωγό. Την 7η-8η ημέρα, τα έμβρυα ξεπλένονται από τη μήτρα και μεταμοσχεύονται στις μήτρες άλλων αγελάδων (ανάδοχες μητέρες), οι οποίες στη συνέχεια γεννούν δίδυμα μοσχάρια. Τα μοσχάρια κληρονομούν τη γενετική κατάσταση των αρχικών γονέων τους.

Ρύζι. 130.Παιδιά δοκιμαστικού σωλήνα

Ένας άλλος τομέας της μηχανικής ζωικών κυττάρων είναι η δημιουργία διαγονιδιακών ζώων. Ο απλούστερος τρόπος για να αποκτήσετε τέτοια ζώα είναι να εισάγετε γραμμικά μόρια DNA στα αυγά των αρχικών ζώων. Τα ζώα που αναπτύσσονται από αυγά που γονιμοποιούνται με αυτόν τον τρόπο θα περιέχουν ένα αντίγραφο του εισαγόμενου γονιδίου σε ένα από τα χρωμοσώματά τους και, επιπλέον, θα περάσουν αυτό το γονίδιο στην κληρονομιά. Μια πιο περίπλοκη μέθοδος για την παραγωγή διαγονιδιακών ζώων αναπτύχθηκε σε ποντίκια που διαφέρουν ως προς το χρώμα του τριχώματος και συνοψίζεται στα εξής. Αρχικά, τα έμβρυα τεσσάρων ημερών αφαιρούνται από το σώμα ενός έγκυου γκρίζου ποντικιού και συνθλίβονται σε μεμονωμένα κύτταρα. Στη συνέχεια οι πυρήνες αφαιρούνται από τα εμβρυϊκά κύτταρα και μεταφέρονται στα αυγά μαύρων ποντικών, που προηγουμένως στερήθηκαν πυρήνες. Αυγά μαύρων ποντικών που περιέχουν ξένους πυρήνες τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες

με ένα θρεπτικό διάλυμα για περαιτέρω ανάπτυξη. Τα έμβρυα που αναπτύχθηκαν από τα ωάρια μαύρων ποντικών εμφυτεύονται στις μήτρες λευκών ποντικών. Έτσι, σε αυτά τα πειράματα, ήταν δυνατό να ληφθεί ένας κλώνος ποντικών με γκρι χρώμα τριχώματος, δηλ. κλωνοποίηση εμβρυϊκών κυττάρων με καθορισμένες ιδιότητες. Στο Κεφάλαιο IV, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της γονιμοποίησης τεχνητά αποπυρηνωμένα αυγά προβάτου με πυρηνικό υλικό από σωματικά κύτταρα ζώων του ίδιου είδους. Συγκεκριμένα, οι πυρήνες αφαιρέθηκαν από αυγά προβάτου και στη συνέχεια οι πυρήνες των σωματικών κυττάρων (εμβρυϊκά, εμβρυϊκά ή ενήλικα κύτταρα) εγχύθηκαν σε τέτοια ωάρια, μετά τα οποία τα ωάρια που γονιμοποιήθηκαν με αυτόν τον τρόπο εγχύθηκαν στη μήτρα ενήλικου προβάτου. Τα αρνιά που γεννήθηκαν ήταν πανομοιότυπα με τη δότρια προβατίνα. Ένα παράδειγμα είναι η Ντόλι το πρόβατο. Ελήφθησαν επίσης κλωνικοί μόσχοι, ποντίκια, κουνέλια, γάτες, μουλάρια και άλλα ζώα. Αυτή η κατασκευή διαγονιδιακών ζώων είναι ένας άμεσος τρόπος κλωνοποίησης ζώων με οικονομικά χρήσιμα χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων ατόμων ενός συγκεκριμένου φύλου.

Τα διαγονιδιακά ζώα λαμβάνονται επίσης χρησιμοποιώντας πρώτη ύλη που ανήκει σε διαφορετικά είδη. Συγκεκριμένα, υπάρχει μια γνωστή μέθοδος μεταφοράς του γονιδίου που ελέγχει την αυξητική ορμόνη από αρουραίους σε αυγά ποντικών, καθώς και μια μέθοδος συνδυασμού βλαστομερών προβάτου με βλαστομερή κατσίκας, που οδήγησε στην εμφάνιση υβριδικών ζώων (πρόβατα). Αυτά τα πειράματα δείχνουν τη δυνατότητα να ξεπεραστεί η ασυμβατότητα των ειδών στα πρώτα στάδια ανάπτυξης. Ιδιαίτερα ελκυστικές προοπτικές ανοίγονται (αν ξεπεραστεί πλήρως η ασυμβατότητα των ειδών) στον τρόπο γονιμοποίησης των ωαρίων ενός είδους με τους πυρήνες των σωματικών κυττάρων ενός άλλου είδους. Μιλάμε για την πραγματική προοπτική δημιουργίας οικονομικά πολύτιμων υβριδίων ζώων που δεν μπορούν να αποκτηθούν με διασταύρωση.

Πρέπει να σημειωθεί ότι το έργο της πυρηνικής μεταμόσχευσης δεν είναι ακόμη πολύ αποτελεσματικό. Πειράματα που έγιναν σε αμφίβια και θηλαστικά έχουν γενικά δείξει ότι η αποτελεσματικότητά τους είναι χαμηλή και εξαρτάται από την ασυμβατότητα μεταξύ των πυρήνων του δότη και των ωοκυττάρων-λήπτες. Επιπλέον, εμπόδιο στην επιτυχία αποτελούν και οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες που σχηματίζονται στους μεταμοσχευμένους πυρήνες κατά την περαιτέρω ανάπτυξη, οι οποίες συνοδεύονται από θάνατο διαγονιδιακών ζώων.

Στη διασταύρωση των μελετών υβριδισμού κυττάρων και ανοσολογικής έρευνας, προέκυψε ένα πρόβλημα που σχετίζεται με την παραγωγή και τη μελέτη των λεγόμενων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Όπως σημειώθηκε παραπάνω, τα αντισώματα που παράγονται από το σώμα ως απόκριση στην εισαγωγή ενός αντιγόνου (βακτήρια, ιοί, ερυθρά αιμοσφαίρια, κ.λπ.) είναι πρωτεΐνες που ονομάζονται ανοσοσφαιρίνες και αποτελούν θεμελιώδες μέρος του αμυντικού συστήματος του σώματος έναντι των παθογόνων. Αλλά κάθε ξένο σώμα που εισάγεται στο σώμα είναι ένα μείγμα διαφορετικών αντιγόνων που θα διεγείρουν την παραγωγή διαφορετικών αντισωμάτων. Για παράδειγμα, τα ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια διαθέτουν αντιγόνα όχι μόνο για τις ομάδες αίματος Α (II) και Β (III), αλλά και πολλά άλλα αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα Rh. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες στο κυτταρικό τοίχωμα των βακτηρίων ή στο καψίδιο των ιών μπορούν επίσης να δράσουν ως διαφορετικά αντιγόνα, προκαλώντας το σχηματισμό διαφορετικών αντισωμάτων. Ταυτόχρονα, τα λεμφοειδή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του σώματος αντιπροσωπεύονται συνήθως από κλώνους. Αυτό σημαίνει ότι και μόνο για αυτόν τον λόγο, τα αντισώματα στον ορό αίματος των ανοσοποιημένων ζώων είναι πάντα ένα μείγμα που αποτελείται από αντισώματα που παράγονται από κύτταρα διαφορετικών κλώνων. Εν τω μεταξύ, για πρακτικές ανάγκες χρειάζονται αντισώματα ενός μόνο τύπου, δηλ. οι λεγόμενοι μονοειδικοί οροί που περιέχουν αντισώματα ενός μόνο τύπου ή, όπως ονομάζονται, μονοκλωνικά αντισώματα.

Αναζητώντας μεθόδους για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων, Ελβετοί ερευνητές ανακάλυψαν το 1975 μια μέθοδο υβριδισμού μεταξύ λεμφοκυττάρων ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο και καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων του μυελού των οστών. Τέτοια υβρίδια ονομάζονται «υβρίδωμα». Από το «λεμφοκυτταρικό» τμήμα, που αντιπροσωπεύεται από ένα λεμφοκύτταρο ενός κλώνου, ένα μεμονωμένο υβρίδωμα κληρονομεί την ικανότητα να προκαλεί το σχηματισμό των απαραίτητων αντισωμάτων, ενός τύπου, και χάρη στο τμήμα «όγκος (μυέλωμα)» καθίσταται ικανό, όπως όλα τα καρκινικά κύτταρα, πολλαπλασιάζονται απεριόριστα σε τεχνητά θρεπτικά μέσα, δίνοντας μεγάλο πληθυσμό υβριδίων. Στο Σχ. 131 δείχνει ένα διάγραμμα της απομόνωσης των κυτταρικών σειρών που συνθέτουν μονοκλωνικά αντισώματα. Οι κυτταρικές σειρές μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού απομονώνονται με σύντηξη κυττάρων μυελώματος με λεμφοκύτταρα από τη σπλήνα ενός ποντικού που ανοσοποιήθηκε πέντε ημέρες πριν.

επιθυμητό αντιγόνο. Η κυτταρική σύντηξη επιτυγχάνεται με την ανάμειξή τους παρουσία πολυαιθυλενογλυκόλης, η οποία προκαλεί τη σύντηξη των κυτταρικών μεμβρανών και στη συνέχεια τη σπορά τους σε ένα θρεπτικό μέσο που επιτρέπει την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή μόνο υβριδικών κυττάρων (υβρίδωμα). Τα υβριδώματα πολλαπλασιάζονται σε υγρό μέσο, ​​όπου αναπτύσσονται περαιτέρω και εκκρίνουν αντισώματα στο υγρό καλλιέργειας, ενός μόνο τύπου και σε απεριόριστες ποσότητες. Αυτά τα αντισώματα ονομάζονται μονοκλωνικά. Για να αυξήσουν τη συχνότητα σχηματισμού αντισωμάτων, καταφεύγουν σε κλωνοποίηση υβριδωμάτων, δηλ. στην επιλογή μεμονωμένων αποικιών υβριδώματος ικανών να προκαλέσουν το σχηματισμό του μεγαλύτερου αριθμού αντισωμάτων του επιθυμητού τύπου. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν βρει ευρεία χρήση στην ιατρική για τη διάγνωση και τη θεραπεία ορισμένων ασθενειών. Ωστόσο, το πιο σημαντικό πλεονέκτημα της μονοκλωνικής τεχνολογίας είναι ότι μπορεί να παράγει αντισώματα έναντι υλικών που δεν μπορούν να καθαριστούν. Αντίθετα, μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να ληφθούν κατά των κυτταρικών (πλασματικών) μεμβρανών των ζωικών νευρώνων. Για να γίνει αυτό, τα ποντίκια ανοσοποιούνται με απομονωμένες νευρωνικές μεμβράνες, μετά τις οποίες τα λεμφοκύτταρα του σπληνός τους συνδυάζονται με κύτταρα μυελώματος και στη συνέχεια προχωρούν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ρύζι. 131. Λήψη μονοκλωνικών αντισωμάτων

ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Η γενετική μηχανική έχει αποδειχθεί πολλά υποσχόμενη για την ιατρική, κυρίως στη δημιουργία νέων τεχνολογιών για την παραγωγή φυσιολογικά ενεργών πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται ως φάρμακα (ινσουλίνη, σωματοστατίνη, ιντερφερόνες, σωματοτροπίνη κ.λπ.).

Η ινσουλίνη χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ασθενών με διαβήτη, που είναι η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου (μετά τις καρδιακές παθήσεις και τον καρκίνο). Η παγκόσμια ανάγκη για ινσουλίνη είναι αρκετές δεκάδες κιλά. Παραδοσιακά, λαμβάνεται από τους παγκρεατικούς αδένες των χοίρων και των αγελάδων, αλλά οι ορμόνες αυτών των ζώων είναι ελαφρώς διαφορετικές από την ανθρώπινη ινσουλίνη. Η ινσουλίνη χοίρου διαφέρει σε ένα αμινοξύ, ενώ η ινσουλίνη αγελάδας διαφέρει σε τρία. Πιστεύεται ότι η ζωική ινσουλίνη προκαλεί συχνά παρενέργειες. Αν και η χημική σύνθεση της ινσουλίνης έχει πραγματοποιηθεί εδώ και πολύ καιρό, μέχρι τώρα η βιομηχανική παραγωγή ορμονών παρέμενε πολύ ακριβή. Τώρα παράγεται φθηνή ινσουλίνη με τη μέθοδο της γενετικής μηχανικής με χημική-ενζυματική σύνθεση του γονιδίου της ινσουλίνης, ακολουθούμενη από την εισαγωγή αυτού του γονιδίου στο Escherichia coli, το οποίο στη συνέχεια συνθέτει την ορμόνη. Αυτή η ινσουλίνη είναι πιο «βιολογική», αφού είναι χημικά ίδια με την ινσουλίνη που παράγεται από τα ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα.

Οι ιντερφερόνες είναι πρωτεΐνες που συντίθενται από τα κύτταρα κυρίως ως απόκριση σε μόλυνση του σώματος από ιούς. Οι ιντερφερόνες χαρακτηρίζονται από την ειδικότητα του είδους. Για παράδειγμα, στον άνθρωπο υπάρχουν τρεις ομάδες ιντερφερονών που παράγονται από διαφορετικά κύτταρα υπό τον έλεγχο των αντίστοιχων γονιδίων. Το ενδιαφέρον για τις ιντερφερόνες καθορίζεται από το γεγονός ότι χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πράξη για τη θεραπεία πολλών ανθρώπινων ασθενειών, ιδιαίτερα ιογενών.

Όντας μεγάλα σε μέγεθος, τα μόρια ιντερφερόνης δεν είναι εύκολα προσβάσιμα για σύνθεση. Επομένως, οι περισσότερες ιντερφερόνες λαμβάνονται πλέον από ανθρώπινο αίμα, αλλά η απόδοση από αυτή τη μέθοδο παραγωγής είναι μικρή. Εν τω μεταξύ, η ανάγκη για ιντερφερόνη είναι εξαιρετικά υψηλή. Αυτό έθεσε το καθήκον να βρεθεί μια αποτελεσματική μέθοδος για την παραγωγή ιντερφερόνης σε βιομηχανικές ποσότητες. Η γενετική μηχανική αποτελεί τη βάση της σύγχρονης παραγωγής «βακτηριακής» ιντερφερόνης.

Η επίδραση της γενετικής μηχανικής στην τεχνολογία εκείνων των φαρμακευτικών ουσιών που έχουν δημιουργηθεί εδώ και καιρό με τη χρήση βιολογικής τεχνολογίας έχει αυξηθεί. Πίσω στη δεκαετία του 40-50. ΧΧ αιώνα δημιουργήθηκε

βιολογικής βιομηχανίας για την παραγωγή αντιβιοτικών, τα οποία αποτελούν το πιο αποτελεσματικό μέρος του ιατρικού οπλοστασίου της σύγχρονης ιατρικής. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια παρατηρείται σημαντική αύξηση της ανθεκτικότητας των βακτηρίων στα φάρμακα, ιδιαίτερα στα αντιβιοτικά. Ο λόγος είναι η ευρεία κατανομή στον μικροβιακό κόσμο των πλασμιδίων που καθορίζουν την αντοχή στα φάρμακα των βακτηρίων. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο πολλά παλαιότερα διάσημα αντιβιοτικά έχουν χάσει την προηγούμενη αποτελεσματικότητά τους. Ο μόνος τρόπος για να ξεπεραστεί η βακτηριακή αντοχή στα αντιβιοτικά μέχρι στιγμής είναι η αναζήτηση νέων αντιβιοτικών. Σύμφωνα με τους ειδικούς, περίπου 300 νέα αντιβιοτικά δημιουργούνται κάθε χρόνο στον κόσμο. Ωστόσο, τα περισσότερα από αυτά είναι είτε αναποτελεσματικά είτε τοξικά. Μόνο λίγα αντιβιοτικά εισάγονται στην πράξη κάθε χρόνο, γεγονός που μας αναγκάζει όχι μόνο να διατηρήσουμε, αλλά και να αυξήσουμε την ικανότητα της βιομηχανίας αντιβιοτικών με βάση τις εξελίξεις της γενετικής μηχανικής.

Τα κύρια καθήκοντα της γενετικής μηχανικής σε εκείνες τις τεχνολογίες φαρμακευτικών ουσιών στις οποίες οι μικροοργανισμοί είναι παραγωγοί φαρμάκων καθορίζονται από την ανάγκη για ανακατασκευή γενετικής μηχανικής των τελευταίων προκειμένου να αυξηθεί η δραστηριότητά τους. Στο ίδιο

Έκτοτε άρχισε να εφαρμόζεται η ιδέα της δημιουργίας φαρμάκων με τη μορφή μικρών μορίων, γεγονός που συμβάλλει στη μεγαλύτερη αποτελεσματικότητά τους.

Η ανοσοποιητική βιοτεχνολογία συνδέεται πρωτίστως με την παραγωγή εμβολίων νέας γενιάς για την πρόληψη μολυσματικών ασθενειών σε ανθρώπους και ζώα. Τα πρώτα εμπορικά προϊόντα που δημιουργήθηκαν με τη χρήση γενετικής μηχανικής ήταν τα εμβόλια κατά της ανθρώπινης ηπατίτιδας, του αφθώδους πυρετού των ζώων και ορισμένων άλλων. Μια εξαιρετικά σημαντική κατεύθυνση σε αυτόν τον τομέα σχετίζεται με την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων, αντιδραστηρίων απαραίτητα για τη διάγνωση παθογόνων, καθώς και για τον καθαρισμό ορμονών, βιταμινών, πρωτεϊνών διαφόρων φύσεων (ένζυμα, τοξίνες κ.λπ.).

Σημαντικό πρακτικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η μέθοδος παραγωγής τεχνητής αιμοσφαιρίνης με την εισαγωγή γονιδίων αιμοσφαιρίνης σε φυτά καπνού, όπου υπό τον έλεγχο αυτών των γονιδίων παράγονται α- και β-αλυσίδες σφαιρίνης, οι οποίες συνδυάζονται σε αιμοσφαιρίνη. Η αιμοσφαιρίνη που συντίθεται στα κύτταρα των φυτών καπνού είναι πλήρως λειτουργική (δεσμεύει το οξυγόνο). Η κυτταρική μηχανική, όπως εφαρμόζεται στους ανθρώπους, συνδέεται όχι μόνο με την επίλυση θεμελιωδών προβλημάτων της ανθρώπινης βιολογίας, αλλά και με την υπέρβαση, πρώτα απ 'όλα, της γυναικείας υπογονιμότητας. Δεδομένου ότι η συχνότητα των θετικών περιπτώσεων εμφύτευσης εμβρύων που λαμβάνονται στη μήτρα των γυναικών in vitro,είναι μικρό, τότε αποκτά μονοζυγωτικά δίδυμα έμβρυα in vitroέχει επίσης σημασία, καθώς αυξάνονται οι δυνατότητες επαναλαμβανόμενων εμφυτευμάτων λόγω «εφεδρικών» εμβρύων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι προοπτικές χρήσης βλαστοκυττάρων ως πηγή αντικατάστασης κυττάρων και ιστών στη θεραπεία ασθενειών όπως ο διαβήτης, οι τραυματισμοί του νωτιαίου μυελού, ο καρδιακός πόνος, η οστεοαρθρίτιδα και η νόσος του Πάρκινσον. Αλλά για να πραγματοποιηθούν αυτές οι προοπτικές, είναι απαραίτητη μια εις βάθος μελέτη της βιολογίας των βλαστοκυττάρων.

Στη χρήση της γενετικής μηχανικής σε σχέση με ιατρικά προβλήματα, το έργο της ανάπτυξης μεθόδων γενετικής μηχανικής για τη ριζική θεραπεία κληρονομικών ασθενειών, οι οποίες, δυστυχώς, δεν μπορούν ακόμη να αντιμετωπιστούν με τις υπάρχουσες μεθόδους, έχει αποκτήσει ιδιαίτερη σημασία. Το περιεχόμενο αυτής της εργασίας είναι η ανάπτυξη τρόπων διόρθωσης (κανονικοποίησης) μεταλλάξεων που οδηγούν σε κληρονομικές ασθένειες και η διασφάλιση της μετάδοσης «διορθώσεων» με κληρονομικότητα. Πιστεύεται ότι η επιτυχής ανάπτυξη μεθόδων γενετικής μηχανικής για τη θεραπεία κληρονομικών ασθενειών θα είναι

συμβάλλουν σε δεδομένα για το ανθρώπινο γονιδίωμα που ελήφθησαν ως αποτέλεσμα του διεθνούς επιστημονικού προγράμματος «Human Genome».

ΟΙΚΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ

Ανεβάζοντας τη βιοτεχνολογία σε ένα νέο επίπεδο, η γενετική μηχανική έχει επίσης βρει εφαρμογή στην ανάπτυξη τρόπων εντοπισμού και εξάλειψης περιβαλλοντικών ρύπων. Συγκεκριμένα, έχουν κατασκευαστεί στελέχη βακτηρίων που αποτελούν μοναδικούς δείκτες της μεταλλαξογόνου δράσης των χημικών ρύπων. Από την άλλη πλευρά, τα βακτηριακά στελέχη έχουν κατασκευαστεί γενετικά ώστε να περιέχουν πλασμίδια, υπό τον έλεγχο των οποίων γίνεται η σύνθεση ενζύμων που είναι ικανά να καταστρέψουν πολλές χημικές ενώσεις που μολύνουν το περιβάλλον. Συγκεκριμένα, ορισμένα βακτήρια που περιέχουν πλασμίδια είναι ικανά να αποσυνθέσουν το λάδι και τα προϊόντα πετρελαίου σε αβλαβείς ενώσεις που έχουν καταλήξει στο περιβάλλον ως αποτέλεσμα διαφόρων ατυχημάτων ή άλλων δυσμενών λόγων.

Ωστόσο, η γενετική μηχανική είναι ο μετασχηματισμός γενετικού υλικού που δεν υπάρχει στη φύση. Κατά συνέπεια, τα προϊόντα γενετικής μηχανικής είναι εντελώς νέα προϊόντα που δεν υπάρχουν στη φύση. Ως εκ τούτου, λόγω της άγνωστης φύσης των προϊόντων της, η ίδια είναι γεμάτη κινδύνους τόσο για τη φύση και το περιβάλλον, όσο και για το προσωπικό που εργάζεται σε εργαστήρια όπου χρησιμοποιεί μεθόδους γενετικής μηχανικής ή εργάζεται με δομές που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια εργασιών γενετικής μηχανικής.

Δεδομένου ότι οι δυνατότητες κλωνοποίησης γονιδίων είναι απεριόριστες, ακόμη και στην αρχή αυτών των μελετών, προέκυψαν ερωτήματα μεταξύ των επιστημόνων σχετικά με τη φύση των οργανισμών που δημιουργούνται. Ταυτόχρονα, προτάθηκαν μια σειρά από ανεπιθύμητες συνέπειες αυτής της μεθοδολογίας και αυτές οι υποθέσεις βρήκαν υποστήριξη και στο ευρύ κοινό. Συγκεκριμένα, έχουν προκύψει διαφωνίες σχετικά με τις ιδιότητες των βακτηρίων που έλαβαν ζωικά γονίδια σε πειράματα γενετικής μηχανικής. Για παράδειγμα, διατηρούνται τα βακτήρια Ε. coliΗ ταυτότητα του είδους τους οφείλεται στο περιεχόμενο των εισαγόμενων γονιδίων ζωικής προέλευσης (για παράδειγμα, του γονιδίου της ινσουλίνης) ή πρέπει να θεωρηθούν νέο είδος; Επιπλέον, πόσο ανθεκτικά είναι τέτοια βακτήρια, σε ποιες οικολογικές θέσεις μπορούν

υπάρχει? Αλλά το πιο σημαντικό πράγμα άρχισε να είναι η ανάδυση ανησυχιών ότι κατά την παραγωγή και τον χειρισμό των μορίων ανασυνδυασμένου DNA θα μπορούσαν να δημιουργηθούν γενετικές δομές με ιδιότητες απρόβλεπτες και επικίνδυνες για την ανθρώπινη υγεία για την ιστορικά εδραιωμένη οικολογική ισορροπία. Ταυτόχρονα, ξεκίνησαν οι εκκλήσεις για μορατόριουμ στη γενετική μηχανική. Αυτές οι κλήσεις προκάλεσαν διεθνή κατακραυγή και οδήγησαν σε ένα διεθνές συνέδριο, το οποίο πραγματοποιήθηκε το 1975 στις Ηνωμένες Πολιτείες, στο οποίο συζητήθηκαν ευρέως οι πιθανές επιπτώσεις της έρευνας σε αυτόν τον τομέα. Στη συνέχεια, σε χώρες όπου άρχισε να αναπτύσσεται η γενετική μηχανική, αναπτύχθηκαν κανόνες για την εργασία με μόρια ανασυνδυασμένου DNA. Οι κανόνες αυτοί αποσκοπούν στην αποτροπή της εισόδου των προϊόντων των εργαστηρίων γενετικής μηχανικής στο περιβάλλον.

Μια άλλη πτυχή των ανεπιθύμητων συνεπειών της εργασίας γενετικής μηχανικής σχετίζεται με τον κίνδυνο για την υγεία του προσωπικού που εργάζεται σε εργαστήρια όπου χρησιμοποιούνται μέθοδοι γενετικής μηχανικής, καθώς αυτά τα εργαστήρια χρησιμοποιούν φαινόλη, βρωμιούχο αιθίδιο και υπεριώδη ακτινοβολία, που είναι επιβλαβείς για την υγεία παράγοντες. Επιπλέον, σε αυτά τα εργαστήρια υπάρχει η πιθανότητα μόλυνσης από βακτήρια που περιέχουν μόρια ανασυνδυασμένου DNA που ελέγχουν ανεπιθύμητες ιδιότητες, όπως η αντοχή στα φάρμακα των βακτηρίων. Αυτά και άλλα σημεία καθορίζουν την ανάγκη βελτίωσης του επιπέδου ασφάλειας στις εργασίες γενετικής μηχανικής.

Τέλος, τα προβλήματα των κινδύνων των γενετικά τροποποιημένων προϊόντων (γενετικά τροποποιημένες ντομάτες, πατάτες, καλαμπόκι, σόγια), καθώς και προϊόντα όπως ψωμί, πάστες, καραμέλες, παγωτό, τυρί, φυτικά έλαια, προϊόντα κρέατος, τα οποία σε έναν αριθμό των περιπτώσεων συζητούνται ευρέως στην κοινωνία.Χώρες, ιδίως στις ΗΠΑ, έχουν γίνει ευρέως διαδεδομένες. Για 12.000 χρόνια γεωργίας, οι άνθρωποι έχουν καταναλώσει τροφές που προέρχονται από φυσικές πηγές. Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι τα γενετικά τροποποιημένα τρόφιμα θα εισάγουν νέες τοξίνες, αλλεργιογόνα, βακτήρια και καρκινογόνες ουσίες στο ανθρώπινο σώμα, που θα οδηγήσουν σε εντελώς νέες ασθένειες για τις μελλοντικές γενιές. Αυτό εγείρει το ερώτημα μιας πραγματικά επιστημονικής αξιολόγησης των γενετικά τροποποιημένων τροφίμων.

ΘΕΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

1. Τι σημαίνει γενετική, κυτταρική και γενετική μηχανική; Υπάρχει διαφορά μεταξύ αυτών των εννοιών και της μοριακής κλωνοποίησης;

2. Ποια είναι η προοδευτικότητα της γενετικής μηχανικής σε σύγκριση με άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούνται στη βιολογία;

3. Καταγράψτε τα κύρια «εργαλεία» της γενετικής μηχανικής.

4. Τι είναι τα ένζυμα περιορισμού, ποιες είναι οι ιδιότητές τους και ο ρόλος τους στη γενετική μηχανική;

5. Όλα τα περιοριστικά ένζυμα σχηματίζουν «κολλώδη» άκρα του DNA που μελετάται και η δομή των «κολλωδών» άκρων εξαρτάται από τον τύπο του περιοριστικού ενζύμου;

6. Ορίστε τους γενετικούς φορείς. Υπάρχουν φυσικοί φορείς;

7. Πώς λαμβάνονται οι γενετικοί φορείς στο εργαστήριο; Ποια βιολογικά αντικείμενα είναι το αρχικό υλικό για τη λήψη φορέων;

8. Ποιο είναι το μέγιστο μήκος αλληλουχιών αζωτούχων βάσεων DNA που μπορούν ακόμα να συμπεριληφθούν σε έναν γενετικό φορέα; Διαφέρουν τα διανύσματα ως προς την «ισχύ»;

9. Χαρακτηρίστε τις ιδιότητες της DNA λιγάσης και προσδιορίστε το ρόλο της στη γενετική μηχανική.

10. Πώς συνδέεται το κλωνοποιημένο τμήμα DNA (γονίδιο) με τον γενετικό φορέα;

11. Ποια είναι η συχνότητα εισαγωγής μορίων ανασυνδυασμένου DNA σε βακτηριακά κύτταρα;

12. Σε ποια αρχή βασίζεται η επιλογή των βακτηριακών κυττάρων που περιέχουν μόρια ανασυνδυασμένου DNA; Δώστε ένα παράδειγμα τέτοιας επιλογής.

14. Πολλά στελέχη βακτηρίων έχουν τα ίδια ένζυμα που εξασφαλίζουν τον μεταβολισμό τους σχεδόν με τον ίδιο τρόπο. Εν τω μεταξύ, η νουκλεοτιδική ειδικότητα των βακτηριακών συστημάτων περιορισμού-τροποποίησης είναι διαφορετική. Μπορείτε να εξηγήσετε αυτό το φαινόμενο;

15. Γιατί οι αλληλουχίες DNA που αντιπροσωπεύουν θέσεις αναγνώρισης περιοριστικών ενζύμων δεν μπορούν να περιέχουν περισσότερα από οκτώ ζεύγη βάσεων;

16. Πόσες φορές θα εμφανιστεί η αλληλουχία HGC, που αναγνωρίζεται από το ένζυμο περιορισμού Hae III, σε ένα τμήμα DNA 50.000 ζευγών βάσεων με 30, 50 και 70 τοις εκατό περιεκτικότητα σε GC;

17. Τα περιοριστικά ένζυμα Bam HI και Bgl I λιώνουν τις αλληλουχίες G GATCC και T GATCA, αντίστοιχα. Είναι δυνατόν να συμπεριληφθούν θραύσματα DNA που παράγονται από περιορισμό Bgl I στη θέση Bam HI; Εάν ναι, γιατί; Εάν το πλασμίδιο (φορέας) που χρησιμοποιείται περιέχει μία θέση περιορισμού Bgl I, τότε σε ποιο θρεπτικό μέσο μπορεί να επιλεγεί αυτό το πλασμίδιο για βακτήρια;

18. Υπολογίστε τη συχνότητα του βακτηριακού μετασχηματισμού ανά μόριο DNA εάν σχηματίζονται 5-10 5 μετασχηματιστές ανά 5000 ζεύγη βάσεων πλασμιδίου;

19. Είναι δυνατή η κλωνοποίηση του σημείου 0 αντιγραφής DNA; Ε. coliκαι αν ναι, πώς;

20. Είναι δυνατόν να προσδιοριστεί πόσα μόρια DNA χρειάζονται για να μεταμορφωθεί ένα κύτταρο; E. coli;

21. Είναι δυνατόν να προσδιοριστεί η θέση ματίσματος στο mRNA χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης;

22. Πώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την εισαγωγή μιας επιθυμητής θέσης περιορισμού σε μια θέση ενδιαφέροντος σε ένα θραύσμα DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί;

23. Ονομάστε τις μεθόδους κυτταρικής μηχανικής όπως εφαρμόζονται στα ζώα. Ποια είναι η οικονομική αξία των ζώων που παράγονται με αυτές τις μεθόδους;

24. Ορίστε τις έννοιες «διαγονιδιακά φυτά» και «διαγονιδιακά ζώα». Οι διαγονιδιακοί οργανισμοί διατηρούν την ταυτότητα του είδους τους ή μπορούν να θεωρηθούν οργανισμοί νέων ειδών;

25. Τι είναι τα υβριδώματα και τα μονοκλωνικά αντισώματα; Πώς τα αποκτάτε;

26. Η κυτταρική μηχανική ισχύει για τον άνθρωπο;

27. Ας υποθέσουμε ότι η έγχυση ξένου DNA σε ένα ωάριο ποντικιού και η εμφύτευση του ωαρίου που γονιμοποιήθηκε με αυτόν τον τρόπο στο σώμα του ποντικιού είχε ως αποτέλεσμα την εγκυμοσύνη και τη γέννηση ποντικών που περιείχαν αντίγραφα του ενέσιμου DNA στο γονιδίωμα. Ωστόσο τα ποντικάκια αποδείχτηκαν μωσαϊκά, δηλ. Μερικά από τα κύτταρά τους περιέχουν αντίγραφα του ενέσιμου DNA, ενώ άλλα δεν έχουν αυτό το DNA. Μπορείτε να εξηγήσετε τη φύση αυτού του φαινομένου;

28. Θεωρείτε γενετικά επικίνδυνα τα τρόφιμα που παρασκευάζονται από γενετικά τροποποιημένα προϊόντα;

29. Είναι απαραίτητος ο επιστημονικός έλεγχος γενετικά τροποποιημένων τροφίμων;

Η γνώση καθορίζεται από αυτό που βεβαιώνουμε ως Αλήθεια.

P.A. Florensky, 1923

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ, ένα σύνολο μεθόδων βιοχημείας και μοριακής γενετικής, με τη βοήθεια των οποίων πραγματοποιείται ο κατευθυνόμενος συνδυασμός γενετικών πληροφοριών οποιουδήποτε οργανισμού. Η γενετική μηχανική καθιστά δυνατή την υπέρβαση φυσικών φραγμών μεταξύ των ειδών που εμποδίζουν την ανταλλαγή γενετικών πληροφοριών μεταξύ ταξινομικά απομακρυσμένων ειδών οργανισμών και τη δημιουργία κυττάρων και οργανισμών με συνδυασμούς γονιδίων που δεν υπάρχουν στη φύση, με καθορισμένες κληρονομικές ιδιότητες. Το κύριο αντικείμενο της επιρροής της γενετικής μηχανικής είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας - το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA), το μόριο του οποίου αποτελείται συνήθως από δύο αλυσίδες. Η αυστηρή εξειδίκευση του ζευγαρώματος των βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης καθορίζει την ιδιότητα της συμπληρωματικότητας - την αμοιβαία αντιστοιχία των νουκλεοτιδίων σε δύο αλυσίδες. Η δημιουργία νέων συνδυασμών γονιδίων αποδείχθηκε δυνατή λόγω της θεμελιώδους ομοιότητας στη δομή των μορίων DNA σε όλους τους τύπους οργανισμών και η πραγματική καθολικότητα του γενετικού κώδικα εξασφαλίζει την έκφραση ξένων γονιδίων (εκδήλωση της λειτουργικής τους δραστηριότητας) σε οποιοδήποτε τύπο κυττάρου. Αυτό διευκολύνθηκε επίσης από τη συσσώρευση γνώσεων στον τομέα της χημείας νουκλεϊκών οξέων, τον προσδιορισμό των μοριακών χαρακτηριστικών της οργάνωσης και της λειτουργίας των γονιδίων (συμπεριλαμβανομένης της δημιουργίας μηχανισμών για τη ρύθμιση της έκφρασής τους και της δυνατότητας υποταγής των γονιδίων στη δράση του " ξένα» ρυθμιστικά στοιχεία), η ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας DNA, η ανακάλυψη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, η οποία κατέστησε δυνατή τη γρήγορη σύνθεση οποιουδήποτε θραύσματος DNA. Σημαντικές προϋποθέσεις για την εμφάνιση της γενετικής μηχανικής ήταν: η ανακάλυψη πλασμιδίων ικανών για αυτόνομη αντιγραφή και μεταφορά από ένα βακτηριακό κύτταρο σε άλλο, και το φαινόμενο της μεταγωγής - η μεταφορά ορισμένων γονιδίων από βακτηριοφάγους, που κατέστησαν δυνατή τη διατύπωση της ιδέας φορείς: μόρια - φορείς γονιδίων. Τα ένζυμα που εμπλέκονται στον μετασχηματισμό των νουκλεϊκών οξέων έπαιξαν τεράστιο ρόλο στην ανάπτυξη της μεθοδολογίας γενετικής μηχανικής: περιοριστικά ένζυμα (αναγνωρίζουν αυστηρά καθορισμένες αλληλουχίες - θέσεις - σε μόρια DNA και «κόβουν» τη διπλή έλικα σε αυτά τα σημεία), λιγάσες DNA (ομοιοπολικά δεσμεύονται μεμονωμένα θραύσματα DNA), αντίστροφη μεταγραφάση (συνθέτει ένα συμπληρωματικό αντίγραφο DNA, ή cDNA, σε ένα πρότυπο RNA) κ.λπ. Μόνο με τη διαθεσιμότητά τους, η δημιουργία τεχνητών δομών έχει γίνει τεχνικά εφικτό έργο. Τα ένζυμα χρησιμοποιούνται για τη λήψη μεμονωμένων θραυσμάτων DNA (γονιδίων) και τη δημιουργία μοριακών υβριδίων - ανασυνδυασμένου DNA (recDNA) με βάση το DNA πλασμιδίων και ιών. Οι τελευταίοι παραδίδουν το επιθυμητό γονίδιο στο κύτταρο ξενιστή, διασφαλίζοντας την αναπαραγωγή του εκεί (κλωνοποίηση) και τον σχηματισμό του τελικού γονιδιακού προϊόντος (την έκφρασή του).

Αρχές δημιουργίας μορίων ανασυνδυασμένου DNA.Ο όρος «γενετική μηχανική» έγινε ευρέως διαδεδομένος όταν ο P. Berg και οι συνεργάτες του απέκτησαν για πρώτη φορά ανασυνδυασμένο DNA το 1972, το οποίο ήταν ένα υβρίδιο στο οποίο υπήρχαν θραύσματα DNA του βακτηρίου Escherichia coli, ο ιός του (βακτηριοφάγος λ) και το DNA του ιού πιθήκου SV40. συνδυασμένα (Εικ. 1). Το 1973, ο S. Cohen και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν το πλασμίδιο pSC101 και ένα περιοριστικό ένζυμο (EcoRI), το οποίο το σπάει σε ένα σημείο με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζονται κοντές συμπληρωματικές μονόκλωνες «ουρές» (συνήθως 4-6 νουκλεοτίδια). στα άκρα του μορίου του δίκλωνου DNA. Ονομάζονται «κολλώδη» γιατί μπορούν να ζευγαρώσουν (να κολλήσουν μεταξύ τους, λες) μεταξύ τους. Όταν ένα τέτοιο DNA αναμίχθηκε με θραύσματα ξένου DNA που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ίδιο ένζυμο περιορισμού και είχαν τα ίδια κολλώδη άκρα, λήφθηκαν νέα υβριδικά πλασμίδια, καθένα από τα οποία περιείχε τουλάχιστον ένα θραύσμα ξένου DNA που εισήχθη στη θέση EcoRI του πλασμιδίου (Εικ. . 2) . Έγινε προφανές ότι θραύσματα διαφόρων ξένων DNA που λαμβάνονται τόσο από μικροοργανισμούς όσο και από ανώτερους ευκαρυώτες μπορούν να εισαχθούν σε τέτοια πλασμίδια.

Η κύρια σύγχρονη στρατηγική για τη λήψη recDNA είναι η εξής:

1) Θραύσματα DNA που ανήκουν σε άλλο οργανισμό που περιέχουν συγκεκριμένα γονίδια ή τεχνητά ληφθείσες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που ενδιαφέρουν τον ερευνητή εισάγονται στο DNA ενός πλασμιδίου ή ιού που μπορεί να αναπαραχθεί ανεξάρτητα από το χρωμόσωμα.

2) τα προκύπτοντα υβριδικά μόρια εισάγονται σε ευαίσθητα προκαρυωτικά ή ευκαρυωτικά κύτταρα, όπου αντιγράφονται (πολλαπλασιάζονται, ενισχύονται) μαζί με θραύσματα DNA ενσωματωμένα σε αυτά.

3) οι κυτταρικοί κλώνοι επιλέγονται με τη μορφή αποικιών σε ειδικά θρεπτικά μέσα (ή ιοί με τη μορφή ζωνών καθαρισμού - πλάκες σε στρώμα συνεχούς ανάπτυξης βακτηριακών κυττάρων ή καλλιέργειες ζωικού ιστού), που περιέχουν τους απαιτούμενους τύπους μορίων recDNA και υποκείμενα σε ολοκληρωμένες δομικές και λειτουργικές μελέτες. Για να διευκολυνθεί η επιλογή των κυττάρων στα οποία υπάρχει recDNA, χρησιμοποιούνται φορείς που περιέχουν έναν ή περισσότερους δείκτες. Στα πλασμίδια, για παράδειγμα, γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά μπορούν να χρησιμεύσουν ως τέτοιοι δείκτες (τα κύτταρα που περιέχουν recDNA επιλέγονται με βάση την ικανότητά τους να αναπτύσσονται παρουσία ενός συγκεκριμένου αντιβιοτικού). Το RecDNA που φέρει τα επιθυμητά γονίδια επιλέγεται και εισάγεται στα κύτταρα-δέκτες. Από αυτή τη στιγμή, ξεκινά η μοριακή κλωνοποίηση - λήψη αντιγράφων του recDNA και, κατά συνέπεια, αντιγράφων των γονιδίων-στόχων στη σύνθεσή του. Μόνο εάν είναι δυνατός ο διαχωρισμός όλων των επιμολυσμένων ή μολυσμένων κυττάρων, κάθε κλώνος θα αντιπροσωπεύεται από μια ξεχωριστή αποικία κυττάρων και θα περιέχει ένα συγκεκριμένο recDNA. Στο τελικό στάδιο πραγματοποιείται η ταυτοποίηση (αναζήτηση) των κλώνων που περιέχουν το επιθυμητό γονίδιο. Βασίζεται στο γεγονός ότι μια εισαγωγή στο recDNA καθορίζει κάποια μοναδική ιδιότητα του κυττάρου που το περιέχει (για παράδειγμα, το προϊόν έκφρασης του εισαγόμενου γονιδίου). Σε πειράματα μοριακής κλωνοποίησης, τηρούνται 2 βασικές αρχές: κανένα από τα κύτταρα στα οποία λαμβάνει χώρα η κλωνοποίηση recDNA δεν πρέπει να λαμβάνει περισσότερα από ένα μόριο πλασμιδίου ή σωματίδιο ιού. το τελευταίο πρέπει να είναι ικανό να αναπαραχθεί.

Ένα ευρύ φάσμα πλασμιδικών και ιικών DNA χρησιμοποιούνται ως μόρια φορέα στη γενετική μηχανική. Οι πιο δημοφιλείς φορείς κλωνοποίησης περιέχουν πολλούς γενετικούς δείκτες και έχουν μία θέση δράσης για διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Τέτοιες απαιτήσεις, για παράδειγμα, ικανοποιούνται καλύτερα από το πλασμίδιο pBR322, το οποίο κατασκευάστηκε από ένα αρχικά φυσικά απαντώμενο πλασμίδιο χρησιμοποιώντας μεθόδους που χρησιμοποιούνται κατά την εργασία με recDNA. Περιέχει γονίδια για αντοχή στην αμπικιλλίνη και την τετρακυκλίνη, καθώς και μία θέση αναγνώρισης για 19 διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Μια ειδική περίπτωση φορέων κλωνοποίησης είναι οι φορείς έκφρασης, οι οποίοι, μαζί με την ενίσχυση, εξασφαλίζουν σωστή και αποτελεσματική έκφραση ξένων γονιδίων στα κύτταρα δέκτες. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι μοριακοί φορείς μπορούν να εξασφαλίσουν την ενσωμάτωση ξένου DNA στο γονιδίωμα ενός κυττάρου ή ιού (ονομάζονται ενσωματωτικοί φορείς).

Ένα από τα πιο σημαντικά καθήκοντα της γενετικής μηχανικής είναι η δημιουργία στελεχών βακτηρίων ή ζυμομυκήτων, κυτταρικών γραμμών ζωικών ή φυτικών ιστών, καθώς και διαγονιδιακών φυτών και ζώων (βλ. τους. Ένα υψηλό επίπεδο παραγωγής πρωτεΐνης επιτυγχάνεται όταν τα γονίδια κλωνοποιούνται σε φορείς πολλαπλών αντιγράφων, επειδή Σε αυτή την περίπτωση, το γονίδιο στόχος θα υπάρχει σε μεγάλες ποσότητες στο κύτταρο. Είναι σημαντικό η κωδικεύουσα αλληλουχία DNA να βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός προαγωγέα που αναγνωρίζεται αποτελεσματικά από την RNA πολυμεράση του κυττάρου και ότι το mRNA που προκύπτει είναι σχετικά σταθερό και αποτελεσματικά μεταφρασμένο. Επιπλέον, μια ξένη πρωτεΐνη που συντίθεται στα κύτταρα λήπτες δεν πρέπει να υπόκειται σε ταχεία αποικοδόμηση από ενδοκυτταρικές πρωτεάσες. Κατά τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων και φυτών, συχνά επιτυγχάνεται έκφραση ειδική για τον ιστό των εισαγόμενων γονιδίων-στόχων.

Δεδομένου ότι ο γενετικός κώδικας είναι καθολικός, η δυνατότητα έκφρασης γονιδίου καθορίζεται μόνο από την παρουσία στη σύνθεσή του σημάτων για την έναρξη και τον τερματισμό της μεταγραφής και της μετάφρασης, που αναγνωρίζονται σωστά από το κύτταρο ξενιστή. Δεδομένου ότι τα περισσότερα γονίδια ανώτερων ευκαρυωτών έχουν μια ασυνεχή δομή εξωνίου-ιντρονίου, ως αποτέλεσμα της μεταγραφής τέτοιων γονιδίων, σχηματίζεται ένα πρόδρομο αγγελιοφόρο RNA (προ-mRNA), από το οποίο, κατά τη διάρκεια του επακόλουθου ματίσματος, μη κωδικοποιητικές αλληλουχίες - εσώνια - διασπώνται και σχηματίζεται ώριμο mRNA. Τέτοια γονίδια δεν μπορούν να εκφραστούν σε βακτηριακά κύτταρα όπου δεν υπάρχει σύστημα ματίσματος. Προκειμένου να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, ένα αντίγραφο DNA (cDNA) συντίθεται σε ώριμα μόρια mRNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση, στην οποία προστίθεται ένας δεύτερος κλώνος χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA. Τέτοια θραύσματα DNA που αντιστοιχούν στην κωδικεύουσα αλληλουχία γονιδίου (δεν διαχωρίζονται πλέον από νιτρόνια) μπορούν να εισαχθούν σε έναν κατάλληλο μοριακό φορέα.

Γνωρίζοντας την αλληλουχία αμινοξέων του πολυπεπτιδίου στόχου, είναι δυνατό να συντεθεί η νουκλεοτιδική αλληλουχία που το κωδικοποιεί, λαμβάνοντας το λεγόμενο ισοδύναμο γονίδιο και να το ενσωματώσουμε στον αντίστοιχο φορέα έκφρασης. Όταν δημιουργούν ένα ισοδύναμο γονίδιο, συνήθως λαμβάνουν υπόψη τον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα (20 αμινοξέα κωδικοποιούνται από 61 κωδικόνια) και τη συχνότητα εμφάνισης κωδικονίων για κάθε αμινοξύ στα κύτταρα στα οποία σχεδιάζεται να εισαχθεί αυτό το γονίδιο , καθώς η σύνθεση των κωδικονίων μπορεί να διαφέρει σημαντικά σε διαφορετικούς οργανισμούς. Τα σωστά επιλεγμένα κωδικόνια μπορούν να αυξήσουν σημαντικά την παραγωγή της πρωτεΐνης στόχου στο κύτταρο δέκτη.

Η σημασία της γενετικής μηχανικής.Η γενετική μηχανική έχει επεκτείνει σημαντικά τα πειραματικά όρια της μοριακής βιολογίας, αφού κατέστη δυνατή η εισαγωγή ξένου DNA σε διάφορους τύπους κυττάρων και η μελέτη των λειτουργιών του. Αυτό κατέστησε δυνατό τον εντοπισμό γενικών βιολογικών προτύπων οργάνωσης και έκφρασης γενετικών πληροφοριών σε διάφορους οργανισμούς. Αυτή η προσέγγιση έχει ανοίξει προοπτικές για τη δημιουργία θεμελιωδώς νέων μικροβιολογικών παραγωγών βιολογικά δραστικών ουσιών, καθώς και ζώων και φυτών που φέρουν λειτουργικά ενεργά ξένα γονίδια. Πολλές προηγουμένως απρόσιτες βιολογικά ενεργές ανθρώπινες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων ιντερφερονών, ιντερλευκινών, πεπτιδικών ορμονών, παραγόντων αίματος, άρχισαν να παράγονται σε μεγάλες ποσότητες στα κύτταρα βακτηρίων, ζυμομυκήτων ή θηλαστικών και χρησιμοποιούνται ευρέως στην ιατρική. Επιπλέον, κατέστη δυνατή η τεχνητή δημιουργία γονιδίων που κωδικοποιούν χιμαιρικά πολυπεπτίδια που έχουν τις ιδιότητες δύο ή περισσότερων φυσικών πρωτεϊνών. Όλα αυτά έδωσαν ισχυρή ώθηση στην ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας.

Τα κύρια αντικείμενα της γενετικής μηχανικής είναι τα βακτήρια Escherichia coli (Escherichia coli) και Bacilltis subtilis (σανός βάκιλλου), η μαγιά αρτοποιίας Saccharomices cerevisiae και διάφορες κυτταρικές σειρές θηλαστικών. Το φάσμα των αντικειμένων επιρροής της γενετικής μηχανικής διευρύνεται συνεχώς. Οι ερευνητικοί τομείς για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών και ζώων αναπτύσσονται εντατικά. Οι τελευταίες γενιές εμβολίων κατά διαφόρων μολυσματικών παραγόντων δημιουργούνται με μεθόδους γενετικής μηχανικής (η πρώτη από αυτές δημιουργήθηκε με βάση τη ζύμη που παράγει την επιφανειακή πρωτεΐνη του ιού της ανθρώπινης ηπατίτιδας Β). Δίνεται μεγάλη προσοχή στην ανάπτυξη φορέων κλωνοποίησης που βασίζονται σε ιούς θηλαστικών και στη χρήση τους για τη δημιουργία ζωντανών πολυδύναμων εμβολίων για κτηνιατρικές και ιατρικές ανάγκες, καθώς και μοριακών φορέων για γονιδιακή θεραπεία καρκινικών όγκων και κληρονομικών ασθενειών. Έχει αναπτυχθεί μια μέθοδος για την άμεση εισαγωγή του recDNA στο σώμα ανθρώπων και ζώων, κατευθύνοντας την παραγωγή αντιγόνων διαφόρων μολυσματικών παραγόντων στα κύτταρά τους (εμβολιασμός DNA). Η νεότερη κατεύθυνση της γενετικής μηχανικής είναι η δημιουργία βρώσιμων εμβολίων με βάση διαγονιδιακά φυτά, όπως ντομάτες, καρότα, πατάτες, καλαμπόκι, μαρούλι κ.λπ., παράγοντας ανοσογόνες πρωτεΐνες μολυσματικών παραγόντων.

Ανησυχίες που σχετίζονται με πειράματα γενετικής μηχανικής.Λίγο μετά τα πρώτα επιτυχημένα πειράματα για την απόκτηση recDNA, μια ομάδα επιστημόνων με επικεφαλής τον P. Berg πρότεινε τον περιορισμό της διεξαγωγής ενός αριθμού πειραμάτων γενετικής μηχανικής. Αυτές οι ανησυχίες βασίστηκαν στο γεγονός ότι οι ιδιότητες των οργανισμών που περιέχουν ξένες γενετικές πληροφορίες είναι δύσκολο να προβλεφθούν. Μπορούν να αποκτήσουν ανεπιθύμητα χαρακτηριστικά, να διαταράξουν την οικολογική ισορροπία και να οδηγήσουν στην εμφάνιση και εξάπλωση ασυνήθιστων ασθενειών σε ανθρώπους, ζώα και φυτά. Επιπλέον, σημειώθηκε ότι η ανθρώπινη παρέμβαση στον γενετικό μηχανισμό των ζωντανών οργανισμών είναι ανήθικη και μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητες κοινωνικές και ηθικές συνέπειες. Το 1975, τα προβλήματα αυτά συζητήθηκαν σε διεθνές συνέδριο στο Asilomar (ΗΠΑ). Οι συμμετέχοντες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ήταν απαραίτητο να συνεχιστεί η χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής, αλλά με την υποχρεωτική τήρηση ορισμένων κανόνων και συστάσεων. Στη συνέχεια, αυτοί οι κανόνες, που θεσπίστηκαν σε πολλές χώρες, μειώθηκαν σημαντικά και περιορίστηκαν σε τεχνικές κοινές στη μικροβιολογική έρευνα, τη δημιουργία ειδικών προστατευτικών συσκευών που εμποδίζουν την εξάπλωση βιολογικών παραγόντων στο περιβάλλον, τη χρήση ασφαλών φορέων και κυττάρων λήπτη που δεν αναπαράγονται σε φυσικές συνθήκες.

Συχνά, η γενετική μηχανική νοείται μόνο ως εργασία με recDNA και οι όροι «μοριακή κλωνοποίηση», «κλωνοποίηση DNA» και «κλωνοποίηση γονιδίων» χρησιμοποιούνται ως συνώνυμα της γενετικής μηχανικής. Ωστόσο, όλες αυτές οι έννοιες αντικατοπτρίζουν το περιεχόμενο μόνο μεμονωμένων εργασιών γενετικής μηχανικής και επομένως δεν είναι ισοδύναμες με τον όρο «γενετική μηχανική». Στη Ρωσία, ο όρος «γενετική μηχανική» χρησιμοποιείται ευρέως ως συνώνυμο της γενετικής μηχανικής. Ωστόσο, το σημασιολογικό περιεχόμενο αυτών των όρων είναι διαφορετικό: η γενετική μηχανική στοχεύει στη δημιουργία οργανισμών με ένα νέο γενετικό πρόγραμμα, ενώ ο όρος «γενετική μηχανική» εξηγεί πώς γίνεται αυτό - με το χειρισμό των γονιδίων.

Λιτ.: Shchelkunov S. N. Gene cloning. Novosibirsk, 1986; aka. Γενετική μηχανική. 2η έκδ., Novosibirsk, 2004; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Ανασυνδυασμένο DNA. Μ., 1986; Κλωνοποίηση DNA. Μέθοδοι. Μ., 1988; Νέο στην κλωνοποίηση DNA: Μέθοδοι. Μ., 1989.

Οικονομική σημασία

Η γενετική μηχανική χρησιμεύει για την απόκτηση των επιθυμητών ποιοτήτων ενός μεταβλητού ή γενετικά τροποποιημένου οργανισμού. Σε αντίθεση με την παραδοσιακή επιλογή, κατά την οποία ο γονότυπος υπόκειται σε αλλαγές μόνο έμμεσα, η γενετική μηχανική επιτρέπει την άμεση επέμβαση στη γενετική συσκευή χρησιμοποιώντας την τεχνική της μοριακής κλωνοποίησης. Παραδείγματα εφαρμογής της γενετικής μηχανικής είναι η παραγωγή νέων γενετικά τροποποιημένων ποικιλιών σιτηρών, η παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης με χρήση γενετικά τροποποιημένων βακτηρίων, η παραγωγή ερυθροποιητίνης σε κυτταρική καλλιέργεια ή νέες φυλές πειραματικών ποντικών για επιστημονική έρευνα.

Η βάση της μικροβιολογικής, βιοσυνθετικής βιομηχανίας είναι το βακτηριακό κύτταρο. Τα κύτταρα που είναι απαραίτητα για τη βιομηχανική παραγωγή επιλέγονται σύμφωνα με ορισμένα χαρακτηριστικά, το πιο σημαντικό από τα οποία είναι η ικανότητα παραγωγής, σύνθεσης, στις μέγιστες δυνατές ποσότητες, μιας συγκεκριμένης ένωσης - ενός αμινοξέος ή ενός αντιβιοτικού, μιας στεροειδούς ορμόνης ή ενός οργανικού οξέος. . Μερικές φορές χρειάζεται να έχετε έναν μικροοργανισμό που μπορεί, για παράδειγμα, να χρησιμοποιήσει λάδι ή λύματα ως «τροφή» και να τα επεξεργαστεί σε βιομάζα ή ακόμα και σε πρωτεΐνη αρκετά κατάλληλη για πρόσθετα ζωοτροφών. Μερικές φορές χρειαζόμαστε οργανισμούς που μπορούν να αναπτυχθούν σε υψηλές θερμοκρασίες ή παρουσία ουσιών που είναι σίγουρα θανατηφόρες για άλλους τύπους μικροοργανισμών.

Το έργο της απόκτησης τέτοιων βιομηχανικών στελεχών είναι πολύ σημαντικό· για την τροποποίηση και την επιλογή τους, έχουν αναπτυχθεί πολυάριθμες μέθοδοι ενεργού επιρροής στο κύτταρο - από τη θεραπεία με ισχυρά δηλητήρια έως τη ραδιενεργή ακτινοβολία. Ο στόχος αυτών των τεχνικών είναι ένας - να επιτευχθούν αλλαγές στον κληρονομικό, γενετικό μηχανισμό του κυττάρου. Το αποτέλεσμά τους είναι η παραγωγή πολυάριθμων μεταλλαγμένων μικροβίων, από εκατοντάδες και χιλιάδες από τα οποία οι επιστήμονες προσπαθούν στη συνέχεια να επιλέξουν το καταλληλότερο για έναν συγκεκριμένο σκοπό. Η δημιουργία μεθόδων χημικής μεταλλαξιογένεσης ή ακτινοβολίας ήταν ένα εξαιρετικό επίτευγμα της βιολογίας και χρησιμοποιείται ευρέως στη σύγχρονη βιοτεχνολογία.

Αλλά οι δυνατότητές τους περιορίζονται από τη φύση των ίδιων των μικροοργανισμών. Δεν είναι σε θέση να συνθέσουν μια σειρά από πολύτιμες ουσίες που συσσωρεύονται στα φυτά, κυρίως σε φαρμακευτικά και αιθέρια ελαιώδη φυτά. Δεν μπορούν να συνθέσουν ουσίες που είναι πολύ σημαντικές για τη ζωή των ζώων και των ανθρώπων, μια σειρά από ένζυμα, πεπτιδικές ορμόνες, πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού συστήματος, ιντερφερόνες και πολλές απλούστερες ενώσεις που συντίθενται στο σώμα των ζώων και των ανθρώπων. Φυσικά, οι δυνατότητες των μικροοργανισμών κάθε άλλο παρά έχουν εξαντληθεί. Από ολόκληρη την αφθονία των μικροοργανισμών, μόνο ένα μικρό κλάσμα έχει χρησιμοποιηθεί από την επιστήμη, και ιδιαίτερα από τη βιομηχανία. Για τους σκοπούς της επιλογής μικροοργανισμών, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν, για παράδειγμα, αναερόβια βακτήρια ικανά να ζουν απουσία οξυγόνου, φωτότροφα που χρησιμοποιούν φωτεινή ενέργεια όπως φυτά, χημειοαυτοτροφικά, θερμόφιλα βακτήρια ικανά να ζουν σε θερμοκρασίες, όπως ανακαλύφθηκε πρόσφατα, περίπου 110 ° C, κ.λπ.

Και όμως οι περιορισμοί του «φυσικού υλικού» είναι προφανείς. Προσπάθησαν και προσπαθούν να παρακάμψουν τους περιορισμούς με τη βοήθεια καλλιεργειών κυττάρων και ιστών φυτών και ζώων. Πρόκειται για ένα πολύ σημαντικό και πολλά υποσχόμενο μονοπάτι, το οποίο επίσης υλοποιείται βιοτεχνολογία. Τις τελευταίες δεκαετίες, οι επιστήμονες έχουν αναπτύξει μεθόδους με τις οποίες μεμονωμένα κύτταρα ιστών ενός φυτού ή ζώου μπορούν να αναπτυχθούν και να αναπαραχθούν χωριστά από το σώμα, όπως τα βακτηριακά κύτταρα. Αυτό ήταν ένα σημαντικό επίτευγμα - οι προκύπτουσες κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιούνται για πειράματα και για τη βιομηχανική παραγωγή ορισμένων ουσιών που δεν μπορούν να ληφθούν με καλλιέργειες βακτηρίων.

Ιστορία ανάπτυξης και επιτυγχανόμενο επίπεδο τεχνολογίας

Στο δεύτερο μισό του 20ου αιώνα, έγιναν αρκετές σημαντικές ανακαλύψεις και εφευρέσεις στις οποίες βασίζονται γενετική μηχανική. Πολλά χρόνια προσπαθειών να «διαβαστούν» οι βιολογικές πληροφορίες που «γράφονται» στα γονίδια έχουν ολοκληρωθεί με επιτυχία. Η εργασία αυτή ξεκίνησε από τον Άγγλο επιστήμονα F. Sanger και τον Αμερικανό επιστήμονα W. Gilbert (Βραβείο Νόμπελ Χημείας). Όπως είναι γνωστό, τα γονίδια περιέχουν πληροφορίες-οδηγίες για τη σύνθεση μορίων RNA και πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των ενζύμων, στο σώμα. Για να αναγκαστεί ένα κύτταρο να συνθέσει νέες ουσίες που είναι ασυνήθιστες γι 'αυτό, είναι απαραίτητο να συντεθούν σε αυτό τα αντίστοιχα σύνολα ενζύμων. Και γι 'αυτό είναι απαραίτητο είτε να αλλάξουμε σκόπιμα τα γονίδια που βρίσκονται σε αυτό είτε να εισαγάγουμε νέα, προηγουμένως απόντα γονίδια σε αυτό. Οι αλλαγές στα γονίδια στα ζωντανά κύτταρα είναι μεταλλάξεις. Εμφανίζονται υπό την επίδραση, για παράδειγμα, μεταλλαξιγόνων - χημικών δηλητηρίων ή ακτινοβολίας. Αλλά τέτοιες αλλαγές δεν μπορούν να ελεγχθούν ή να κατευθυνθούν. Ως εκ τούτου, οι επιστήμονες έχουν επικεντρώσει τις προσπάθειές τους στην προσπάθεια ανάπτυξης μεθόδων για την εισαγωγή νέων, πολύ συγκεκριμένων γονιδίων που χρειάζονται οι άνθρωποι στα κύτταρα.

Τα κύρια στάδια επίλυσης ενός προβλήματος γενετικής μηχανικής είναι τα ακόλουθα:

1. Λήψη απομονωμένου γονιδίου. 2. Εισαγωγή του γονιδίου σε φορέα για μεταφορά στο σώμα. 3. Μεταφορά του φορέα με το γονίδιο στον τροποποιημένο οργανισμό. 4. Μεταμόρφωση των κυττάρων του σώματος. 5. Επιλογή γενετικά τροποποιημένων οργανισμών ( ΓΤΟ) και την εξάλειψη εκείνων που δεν τροποποιήθηκαν επιτυχώς.

Η διαδικασία της γονιδιακής σύνθεσης είναι πλέον πολύ καλά ανεπτυγμένη και μάλιστα σε μεγάλο βαθμό αυτοματοποιημένη. Υπάρχουν ειδικές συσκευές εξοπλισμένες με υπολογιστές, στη μνήμη των οποίων αποθηκεύονται προγράμματα για τη σύνθεση διαφόρων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων. Αυτή η συσκευή συνθέτει τμήματα DNA μέχρι 100-120 αζωτούχες βάσεις σε μήκος (ολιγονουκλεοτίδια). Έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη μια τεχνική που καθιστά δυνατή τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για τη σύνθεση DNA, συμπεριλαμβανομένου του μεταλλαγμένου DNA. Ένα θερμοσταθερό ένζυμο, η πολυμεράση DNA, χρησιμοποιείται σε αυτό για τη σύνθεση DNA εκμαγείου, για το οποίο χρησιμοποιούνται τεχνητά συντιθέμενα κομμάτια νουκλεϊκού οξέος - ολιγονουκλεοτίδια - ως σπόροι. Το ένζυμο ανάστροφη τρανσκριπτάση επιτρέπει, χρησιμοποιώντας τέτοιους εκκινητές, τη σύνθεση DNA σε ένα εκμαγείο RNA που απομονώνεται από κύτταρα. Το DNA που συντίθεται με αυτόν τον τρόπο ονομάζεται συμπληρωματικό DNA (RNA) ή cDNA. Ένα απομονωμένο, «χημικά καθαρό» γονίδιο μπορεί επίσης να ληφθεί από μια βιβλιοθήκη φάγων. Αυτό είναι το όνομα ενός παρασκευάσματος βακτηριοφάγου, στο γονιδίωμα του οποίου ενσωματώνονται τυχαία θραύσματα από το γονιδίωμα ή το cDNA, που αναπαράγονται από τον φάγο μαζί με όλο το DNA του.

Η τεχνική της εισαγωγής γονιδίων στα βακτήρια αναπτύχθηκε αφότου ο Frederick Griffith ανακάλυψε το φαινόμενο του βακτηριακού μετασχηματισμού. Αυτό το φαινόμενο βασίζεται σε μια πρωτόγονη σεξουαλική διαδικασία, η οποία στα βακτήρια συνοδεύεται από την ανταλλαγή μικρών θραυσμάτων μη χρωμοσωμικού DNA, πλασμιδίων. Οι τεχνολογίες πλασμιδίου αποτέλεσαν τη βάση για την εισαγωγή τεχνητών γονιδίων σε βακτηριακά κύτταρα.

Σημαντικές δυσκολίες συνδέθηκαν με την εισαγωγή ενός έτοιμου γονιδίου στην κληρονομική συσκευή των φυτικών και ζωικών κυττάρων. Ωστόσο, στη φύση υπάρχουν περιπτώσεις που ξένο DNA (ιού ή βακτηριοφάγου) περιλαμβάνεται στη γενετική συσκευή ενός κυττάρου και, με τη βοήθεια των μεταβολικών μηχανισμών του, αρχίζει να συνθέτει την πρωτεΐνη «του». Οι επιστήμονες μελέτησαν τα χαρακτηριστικά της εισαγωγής ξένου DNA και το χρησιμοποίησαν ως αρχή για την εισαγωγή γενετικού υλικού σε ένα κύτταρο. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται διαμόλυνση.

Εάν οι μονοκύτταροι οργανισμοί ή οι πολυκύτταρες κυτταρικές καλλιέργειες υπόκεινται σε τροποποίηση, τότε σε αυτό το στάδιο ξεκινά η κλωνοποίηση, δηλαδή η επιλογή των οργανισμών και των απογόνων τους (κλώνων) που έχουν υποστεί τροποποίηση. Όταν ο στόχος είναι να αποκτηθούν πολυκύτταροι οργανισμοί, κύτταρα με αλλοιωμένο γονότυπο χρησιμοποιούνται για βλαστικό πολλαπλασιασμό φυτών ή εισάγονται στις βλαστοκύστες μιας παρένθετης μητέρας όταν πρόκειται για ζώα. Ως αποτέλεσμα, τα μικρά γεννιούνται με έναν αλλαγμένο ή αμετάβλητο γονότυπο, μεταξύ των οποίων επιλέγονται μόνο εκείνα που παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αλλαγές και διασταυρώνονται μεταξύ τους.

Εφαρμογή στην επιστημονική έρευνα

Αν και σε μικρή κλίμακα, η γενετική μηχανική χρησιμοποιείται ήδη για να δώσει στις γυναίκες με ορισμένους τύπους υπογονιμότητας την ευκαιρία να μείνουν έγκυες. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται αυγά από μια υγιή γυναίκα. Ως αποτέλεσμα, το παιδί κληρονομεί τον γονότυπο από έναν πατέρα και δύο μητέρες.

Ωστόσο, η πιθανότητα να γίνουν πιο σημαντικές αλλαγές στο ανθρώπινο γονιδίωμα αντιμετωπίζει μια σειρά σοβαρών ηθικών προβλημάτων.