Dom · Instalacija · Metode termičke sterilizacije. Metode uništavanja (sterilizacije) mikroba Autoklaviranje i sterilizacija pregrijanom parom pod pritiskom

Metode termičke sterilizacije. Metode uništavanja (sterilizacije) mikroba Autoklaviranje i sterilizacija pregrijanom parom pod pritiskom

Kalcinacija na vatri. Ovo je pouzdana metoda sterilizacije, ali ima ograničenu upotrebu zbog propadanja predmeta. Na ovaj način se steriliziraju bakteriološke petlje.

Suva sterilizacija vrućica. Provodi se u Pasteurovoj peći (tetiva ------

pećnica) na temperaturi od 160-170°C 1 sat. Ova metoda se koristi za sterilizaciju laboratorijskog staklenog posuđa, pipeta umotanih u papir i epruveta zatvorenih pamučnim čepovima. Na temperaturama iznad 170°C počinje ugljenisanje papira, vate i gaze.

Sterilizacija parom pod pritiskom (autoklaviranje). Najuniverzalnija metoda sterilizacije. Izvodi se u autoklavu - vodeno-parnom sterilizatoru. Princip rada autoklava zasniva se na zavisnosti tačke ključanja vode o pritisku.

Autoklav je metalni kotao sa dvostrukim zidovima sa hermetički zatvorenim poklopcem. Na dno autoklava se sipa voda, predmeti koji se sterilišu stavljaju u radnu komoru, a poklopac se zatvara bez prethodnog čvrstog zavrtanja. Uključite vatru i dovedite vodu da proključa. Nastala para istiskuje zrak iz radne komore, koji izlazi kroz otvoreni izlazni ventil. Kada je sav zrak istisnut i iz slavine izlazi kontinuirani mlaz pare, slavina se zatvara i poklopac se zatvara. Para se dovodi do željenog pritiska pod kontrolom manometra. Temperatura pare zavisi od pritiska: pri normalnom atmosferskom pritisku, igla manometra je na 0 atm. - temperatura pare 100°C, na 0,5 atm. - 112°C, na 1 atm. -121°C, na 1,5 atm. - 127°C, na 2 atm. - 134°C. Na kraju sterilizacije isključite autoklav, pričekajte dok tlak ne padne, postupno otpustite paru i otvorite poklopac. Obično pri pritisku od 1 atm. u roku od 20-40 minuta steriliziraju se jednostavni hranljivi mediji i otopine koje ne sadrže proteine ​​i ugljikohidrate, oblačenje, posteljina. Materijali koji se sterilišu moraju biti propusni za paru. Prilikom sterilizacije materijala u velikim količinama ( hirurški materijali) vrijeme se povećava na 2 sata. Pri pritisku od 2 atm. dezinficirati patološki materijal i istrošene mikrobne kulture.

Hranjive podloge koje sadrže šećere ne mogu se sterilisati na 1 atm, jer se karameliziraju, pa se podvrgavaju frakcijskoj sterilizaciji tekućom parom ili autoklavu na 0,5 atm.

Za kontrolu režima sterilizacije koriste se biološke i fizičke metode. Biološka metoda se zasniva na činjenici da se istovremeno sa materijalom koji se steriliše stavljaju spore Bacillus stearothermophilus, koje umiru na 121°C za 15 minuta. Nakon sterilizacije, spore ne bi trebale rasti na hranljivom mediju. Fizička metoda se zasniva na upotrebi supstanci koje imaju određenu tačku topljenja, na primer, sumpor (119°C), benzojeva kiselina (120°C). Zapečaćene epruvete koje sadrže supstancu pomešanu sa suvom bojom (fuksinom) stavljaju se u autoklav zajedno sa materijalom koji se steriliše. Ako je temperatura u autoklavu dovoljna, tvar će se otopiti i promijeniti boju boje.

Protočna sterilizacija Para se izvodi u Koch aparatu ili u autoklavu sa odvrnutim poklopcem i otvorenim izlaznim ventilom. Voda u aparatu se zagreva na 100°C. Nastala para prolazi kroz ugrađeni materijal i sterilizira ga. Jedan tretman na 100°C ne ubija spore. Stoga se koristi metoda frakcijske sterilizacije - 3 dana za redom po 30 minuta, između ostavljanja na dan u sobnoj temperaturi. Zagrijavanjem na 100°C dolazi do termičke aktivacije spora, uslijed čega one klijaju u vegetativne forme do sljedećeg dana i umiru pri drugom i trećem zagrijavanju. Kao rezultat, samo hranljivi mediji mogu se sterilisati tekućom parom, jer Da bi spore klijale neophodno je prisustvo hranljivih materija.

Termostat– uređaj za održavanje stalne temperature – koristi se za uzgoj kultura mikroorganizama. To je ormar (slika 1) u kojem se dugo održava određene temperature. Optimalna temperatura za reprodukciju mnogih mikroorganizama 37 ºS. Termostati su dostupni u tipovima suvog zraka i vode.

Ormar za sušenje (Pasterova pećnica) koristi se za sterilizaciju suvom toplotom posuđa, opreme i suvih materijala, kao što su skrob, kreda (slika 2). Materijal koji se steriliše prethodno se umota u papir i stavi u ormarić tako da ne dodiruje zidove. Sterilizacija se vrši na temperaturi od 160 ºS dva sata. Ne preporučuje se podizanje temperature iznad 180 ºS: pamučni čepovi i papir počinju da se kvare (posmeđaju, postaju lomljivi). Sterilizovani materijal se uklanja nakon što se kabinet isključi i ohladi, po mogućnosti kada je temperatura u kabinetu jednaka sobnoj temperaturi.

Aparat za brojanje kolonija(Slika 3) - poluautomatski brojač opremljen električnom olovkom sa opružni uređaj, dizajniran za brojanje kolonija bakterija u Petrijevim zdjelicama. Kup
Petri sa kolonijama bakterija stavlja se naopako na staklo za skeniranje. Lagani pritisak električne olovke na područje dna Petrijeve posude koji odgovara položaju kolonije ostavlja trag na staklu. U tom slučaju, držač se podiže, krug se zatvara, a očitanja brojila se povećavaju za jedan. Broj kolonija bakterija se računa izračunavanjem razlike u očitanjima brojača impulsa prije početka brojanja i nakon njegovog završetka.

Autoklav(Slika 4) je aparat sa debelim zidovima dizajniran za sterilizaciju posuđa i medija za uzgoj parom pod pritiskom. Ovo je zatvoreni kotao sa dvostrukim metalnim stijenkama i poklopcem. Prostor između zidova (komora vodene pare) je ispunjen vodom. Enterijer(komora za sterilizaciju) opremljena je manometrom, sigurnosnim ventilima i slavinom za odvod vode i pare. Da bi se stvorilo čvrsto zaptivanje, autoklav je čvrsto zatvoren poklopcem s gumenom brtvom. Koristi se za sterilizaciju medija za kulturu pod pritiskom od 0,5 do 1,0 MPa u trajanju od 20...30 minuta.

1 – tijelo; 2 – termometar; 1 – poklopac; 2 – tijelo;

3 – vrata; 4 – potenciometar; 3 – menjač; 4 – upravljačka jedinica;

5 – prekidač; 6 – lampa; 5 – oznaka; 6 – termometar

7 – otvori za ventilaciju

Slika 1 – Termostat Slika 2 – Ormar za sušenje

1 – sto za Petrijevu posudu; 2 – olovka sa opružnim uređajem;

3 – pokazivač brojača; 4 – prekidač za uključivanje brojača impulsa; 5 – prekidač za uključivanje lampe za osvetljenje merača

Slika 3 - Uređaj za brojanje kolonija mikroorganizama


Sterilizacija suvom toplotom se vrši u peći na suvo grijanje(Pasterova pećnica). Suva toplota se koristi za sterilizaciju laboratorijskog staklenog posuđa. Labavo se stavlja u rernu tako da se materijal ravnomerno zagreva. Dobro zatvorite vrata ormarića, uključite električni uređaj za grijanje i zagrijte temperaturu na 160-165 0 C i sterilizirajte 1 sat. Na kraju sterilizacije isključite grijanje, ali ne otvarajte vrata ormarića dok se pećnica ne ohladi (u suprotnom hladan vazduhće uzrokovati pukotine na posuđu). Način sterilizacije: 160°C - 60 min, 180°C - 15 min, 200°C - 5 min. Tečnosti, podloge za kulturu, guma i sintetički materijali ne mogu se sterilisati suvom toplotom.

Sterilizacija parom pod pritiskom materijal za zavoje, hirurško rublje, hirurški instrumenti, hranljive podloge, laboratorijsko stakleno posuđe, inficirani materijal, rastvori za injekcije. Materijal se stavlja u kontejnere (kutije). Jastučići od tkanine se postavljaju na dno biksa kako bi apsorbirali vlagu nakon sterilizacije. Sterilnost materijala se održava 3 dana. Zaraženi materijal u posudama i epruvetama steriliše se u metalnim rezervoarima sa poklopcem.

Sterilizacija parom pod pritiskom se vrši u autoklavu. Sa jednim tretmanom, i vegetativni i sporni oblici bakterija umiru. Para pod pritiskom steriliše hranljive podloge, osim medija koji sadrže prirodne proteine, tečnosti i uređaje sa gumenim delovima. Jednostavni mediji (MPA, MPB) se sterilišu 20 minuta na 120°C (1 atm). Mediji koji sadrže prirodne proteine ​​i ugljikohidrate ne mogu se sterilizirati na ovoj temperaturi, jer su to tvari koje se lako mijenjaju zagrijavanjem. Mediji sa ugljenim hidratima se sterilišu frakciono na 100 0 C ili u autoklavu na 112 0 C (5 atm.) 10-15 minuta. Razne tečnosti, uređaji sa gumenim crevima, utikači, bakterijske sveće i filteri se sterilišu na 120 0 C (1 atm.) 20 minuta.

Inficirani materijal (u epruvetama, čašama) stavlja se u posebne metalne kante ili rezervoare sa otvorima za prodor pare i steriliše na 126 0 C (1,5 atm.) 1 sat. Instrumenti se takođe sterilišu nakon rada sa spornim bakterijama.

Postoje 2 načina sterilizacije:

  1. Protočna para u autoklavu ili u Koch aparatu sa odvrnutim poklopcem i otvorenim izlaznim ventilom, kada se antibakterijski efekat pare manifestuje na vegetativne oblike. Tako se sterilišu podloge koje sadrže vitamine i ugljene hidrate, ureu, mleko, krompir i želatin. Za potpunu desterilizaciju koristi se frakciona sterilizacija (na 100 0 C) u trajanju od 20-30 minuta 3 dana za redom. Takođe ubija spore.
  2. Najviše je sterilizacija parom pod pritiskom efikasan metod deprivacija. Zavoji i posteljina se sterilišu na 1 atm. 15-20 minuta, inficirani materijal na 1,5-2 atm 20-25 minuta.

Sterilizacija suvom toplotom ili vrelim vazduhom vrši se u Pasteur pećnicama (sušare). Pasteur pećnica je dvoslojni ormarić od materijala otpornih na toplinu - metala i azbesta. Zagrijte ormar sa plinski gorionici ili električnim grijačima. Električno grijani ormari opremljeni su regulatorima koji osiguravaju potrebna temperatura. Za kontrolu temperature, termometar je umetnut u otvor na gornjem zidu ormarića.

Suva toplota se koristi za sterilizaciju laboratorijskog staklenog posuđa. Posuđe pripremljeno za sterilizaciju se lagano stavlja u pećnicu kako bi se osiguralo jednolično i pouzdano zagrijavanje materijala koji se sterilizira. Čvrsto zatvorite vrata ormarića, uključite uređaj za grijanje, zagrijte temperaturu na 160-165 °C i sterilizirajte na ovoj temperaturi 1 sat. Na kraju sterilizacije isključite grijanje, ali ne otvarajte vrata ormarića do pećnica se ohladila; U suprotnom, hladni zrak koji ulazi u ormar može uzrokovati pukotine na vrućem posuđu.

Sterilizacija u Pasteur pećnici može se vršiti na različite načine temperaturni uslovi i izlaganje (vreme sterilizacije) (tabela 1).


Tabela 1. Režim sterilizacije

Tečnosti (hranjivi mediji, izotonični rastvor natrijum hlorida itd.), predmeti od gume i sintetičkih materijala ne mogu se sterilisati suvom toplotom, jer tečnosti ključaju i izlivaju se, a guma i sintetički materijali tope.

Za kontrolu sterilizacije u Pasteur pećnici, svilene niti se navlaže u kulturi bakterija koje stvaraju spore, osuše se, stave u sterilnu Petrijevu posudu i stave u Pasteurovu peć. Sterilizacija se vrši na temperaturi od 165°C u trajanju od 1 sata (za kontrolu, dio niti se ostavi na sobnoj temperaturi). Zatim se sterilizirane i kontrolne niti stavljaju na površinu agara u Petrijevoj posudi ili stavljaju u epruvete sa bujonom i inkubiraju u termostatu na 37°C 2 dana. At pravilan rad Pasterova pećnica u epruvetama ili posudama sa hranljivim podlogama u koje su postavljene sterilisane niti, neće biti rasta, jer će bakterijske spore umrijeti, dok će bakterijske spore na nitima koje nisu sterilizirane (kontrola) proklijati i rast će se zabilježiti na hranljivim podlogama. .

Da biste odredili temperaturu unutar Pasteurove pećnice, možete koristiti saharozu ili granulirani šećer, koji se karamelizira na temperaturi od 165-170 ° C.

Priprema laboratorijskog staklenog posuđa za sterilizaciju u Pasteur pećnici. Laboratorijsko stakleno posuđe(Petrijeve zdjelice, graduirane i Pasteurove pipete, boce, tikvice, epruvete) prije sterilizacije moraju se dobro oprati, osušiti i umotati u papir, inače nakon sterilizacije može ponovo doći do kontaminacije vazdušnim bakterijama.



Petrijeve zdjelice se umotaju u papir jedan ili više komada odjednom ili se stavljaju u posebne metalne kutije.

Pamučni štapići se ubacuju u gornje krajeve pipete kako bi se spriječilo da ispitni materijal uđe u usta. Graduirane pipete se umotaju u dugačke trake papira širine 4-5 cm.Zapremina umotane pipete je označena na papiru. U kutijama za olovke, graduirane pipete se sterilišu bez dodatnog umotavanja u papir.

Bilješka. Ako je gradacija na pipetama slabo vidljiva, ona se vraća prije sterilizacije. Nanesite na pipetu uljane boje i, ne dopuštajući da se boja osuši, u nju se krpom utrlja prah barijum sulfata. Nakon toga krpom uklonite višak boje, koja ostaje samo u zarezima za diplomiranje. Ovako tretirane pipete treba isprati.

Oštri krajevi Pasteurovih pipeta zapečaćeni su u plamenu plamenika i umotani u papir, po 3-5 komada. Pasteurove pipete moraju se pažljivo umotati kako se ne bi odlomili zapečaćeni krajevi kapilara.

Bočice, tikvice, epruvete se zatvaraju čepovima od pamučne gaze. Pluto treba da stane u grlo posude 2/3 dužine, ne previše čvrsto, ali ni labavo. Preko čepova svake posude (osim epruveta) stavlja se papirna kapica. Epruvete su povezane u grupe od 5-50 i omotane papirom.

Bilješka. Na visokim temperaturama papir u koji su umotane čaše i pipete i vata požute i mogu čak i da se ugljene, tako da svaki nova sorta papir primljen u laboratoriju treba testirati na prihvaćenim temperaturnim uslovima.

Kontrolna pitanja

1. Šta se podrazumijeva pod pojmom sterilizacija?

2. Kako se vrši sterilizacija?

3. Šta se steriliše kalcinacijom na vatri?

4. Opišite strukturu i način rada Pasteurove peći.

5. Šta se steriliše u Pasteur pećnici?

6. Kako se stakleno posuđe priprema za sterilizaciju?

7. Zašto se hranljivi mediji i gumeni predmeti ne mogu sterilisati u Pasteur pećnici?

Vježbajte

Pripremite Petrijeve zdjelice, graduirane pipete, Pasteurove pipete, epruvete, tikvice i bočice za sterilizaciju.

1. Flambing(od lat. flamma - plamen i fr. flamb é - burn) - sterilizacija kalcinacijom malih metalnih ili staklenih predmeta u plamenu. Na ovaj način se sterilišu bakteriološke petlje, metalne pincete, staklene lopatice i epruvete, staklene pločice itd. Temperatura plamena je oko 1000ºC. Kada se kalciniraju, svi mikroorganizmi (vegetativni i sporni oblici) sagorevaju. Ovo je brza i pouzdana metoda sterilizacije.

2. Kipuće. Jedan je od najvecih jednostavne načine sterilizacija. Izvodi se u sterilizatoru - metalnom pravougaona kutija sa poklopcem i mrežicom na dnu za postavljanje sterilisanih predmeta. U to ulijte vodu i zagrijte do ključanja (na struju ili na vatri). Kuvanje može trajati od 15-30 minuta do 2 sata na temperaturi od oko 100 ºS. Sterilizirajte male metalne ili staklene predmete - špriceve, igle, staklene cijevi itd. U tom slučaju umiru vegetativni oblici mikroorganizama i neke spore. Takođe se praktikuje da se materijal koji se steriliše opeče kipućom vodom.

3. Sterilizacija suvom toplotom. Proizvedeno toplim zrakom u Pasteurovoj peći ili orman za sušenje. Pasteur pećnica je dvoslojni ormarić sa vanjske strane obložen azbestom radi toplinske izolacije. Unutar ormarića postoje metalne police sa rupama na koje se stavlja materijal koji se steriliše. Električno grijanje. Sterilizacija se vrši na temperaturi od 160-180 ºS u trajanju od 1-2 sata od postizanja ovih temperatura (kontrolisano termometrom). Suva toplota se koristi za sterilizaciju uglavnom staklenog posuđa - Petrijevih zdjela, pipeta, lopatica (umotanih u papir), kao i epruveta i tikvica. Ova tehnika je pouzdana - nesporni i sporni oblici mikroorganizama umiru. Umotan u papir i steriliziran, materijal se može čuvati.

4. Sterilizacija protočnom parom. Provedeno vruće vlažan vazduh u Koch aparatu. Koch aparat (bojler) je metalni cilindar, koji može biti na nogama i obložen linoleumom. U aparat se ulije toliko vode da ne dođe do ivice, na koju se postavlja metalni krug sa rupama i na njega se stavlja materijal koji se steriliše. Aparat je dobro zatvoren konusnim poklopcem sa rupom u sredini za izlazak pare i zagreva se na vatri. Kada voda proključa, vrela vodena para temperature oko 100 ºS će u jakom mlazu „strujati“ iz otvora na poklopcu. Od ovog trenutka se bilježi vrijeme početka sterilizacije. Sterilizacija protočnom parom traje od 45 minuta do 1,5 sat, u zavisnosti od količine materijala koji se steriliše. Sterilizirajte hranjive podloge koje se ne mogu zagrijati iznad 100 ºS, na primjer, MPG (na temperaturama iznad 100 ºS se ukapljuje i ne skrućuje). Ova metoda sterilizacije nije sasvim pouzdana - potpuno se ubijaju samo vegetativni oblici mikroorganizama, ali se spore čuvaju. Da bi se postigla potpuna sterilizacija medija u Koch aparatu, koristi se frakciona sterilizacija.

5. Sterilizacija parom pod pritiskom (autoklaviranje). Izvodi se sa zasićenom vodenom parom u autoklavu. Postoje autoklavi različiti dizajni. Vertikalni autoklav je masivni kotao sa dvostrukim zidovima, sa vanjske strane okružen metalnim kućištem, sa teškim poklopcem na šarkama koji je čvrsto pričvršćen za kotao. Na dnu kotla nalazi se lijevak i slavina kroz koju se ulijeva voda slobodan prostor između unutrašnjeg kotla i kućišta. Materijal koji se steriliše stavlja se na dno kotla, poklopac se čvrsto zašrafi i uključuje električno grijanje. Kada voda proključa, para prolazi u unutrašnji kotao. Pritisak u autoklavu raste, a istovremeno raste i temperatura. Kada manometar pokaže da je pritisak u kotlu dostigao zadatu vrednost, označite vreme početka sterilizacije. Pritisak se održava na određenom nivou pomoću sigurnosnog ventila.

Obično se u laboratorijskoj praksi sterilizacija pod pritiskom izvodi na 1,5-2 atm i temperaturi od oko 115-120 ºS za

20-30 min. Nakon isteka vremena sterilizacije, zagrijavanje se zaustavlja, ventil za paru se otvara i para se ispušta. Parom pod pritiskom steriliše hranljive podloge MPB, MPA, stakleno posuđe, zavoje, hirurške instrumente itd. Autoklaviranje je brza i pouzdana metoda sterilizacije, koja ubija sve oblike mikroorganizama, čak i najotpornije spore.

6. Pasterizacija. Ova metoda parcijalne sterilizacije nazvana je po francuskom naučniku L. Pasteuru koji ju je predložio. Metoda je da se tečnost koja se sipa u sterilnu posudu zagreva u vodenom kupatilu na temperaturi od 60-90 ºS za

10-30 min. Pogodno za tečne medije koji mijenjaju svoje fizičko-hemijske karakteristike na visokim temperaturama. Pasteriziraju se mlijeko, vrhnje, vino, pivo, sokovi i dr. Istovremeno, vitamini i kvaliteti ukusa proizvodi. Pasterizirani proizvodi dugotrajno skladištenje ne podliježu, jer ovom metodom sterilizacije samo vegetativni oblici mikroorganizama umiru, a spore ostaju. U laboratorijskoj praksi ova metoda se uglavnom koristi za odvajanje vrsta koje stvaraju spore od onih koje ne stvaraju spore.

7. Frakciona sterilizacija. Zasniva se na obradi materijala koji se steriliše u nekoliko faza. Frakcijski može biti kuhanje ili sterilizacija tekućom parom u Koch aparatu. Obično se sterilizacija provodi 3 dana, 30 minuta dnevno, na jedan od navedenih metoda, a u pauzama se medij ostavlja na sobnoj temperaturi. To se radi kako bi se izazvalo rast spora u vegetativne oblike i njihovo uništavanje tokom naknadnih tretmana, što povećava pouzdanost ovih tehnika.

8. Tindalizacija. Ovo je vrsta frakcione sterilizacije (frakciona pasterizacija). Tehnika je dobila ime po engleskom naučniku D. Tyndallu koji ju je predložio. Izvodi se u vodenom kupatilu na temperaturi od 56-58 ºS u trajanju od 1 sata, ponavlja se 5-7 puta nakon 24 sata.U intervalima između zagrijavanja materijal se drži na sobnoj temperaturi. Tindalizacija se vrši na hranljivim podlogama siromašnim mikroorganizmima, a sadrže i supstance koje se lako uništavaju i denaturiraju na temperaturama iznad 60 ºS (proteini, vitamini). To su krvni serum, jaja, itd. Kao rezultat tindalizacije postiže se potpuno uništenje mikroorganizama.