1. Genetik mühendisliğinin olanakları. 4

2. Genetik mühendisliğinin tarihi. 6

3. Bir bilim olarak genetik mühendisliği. Genetik mühendisliği yöntemleri. 10

4. Genetik mühendisliğinin uygulama alanları. 12

5. Genetik mühendisliğinin tehlikeleri hakkında bilimsel gerçekler. 18

Çözüm. 22

Referanslar.. 23

giriiş

Genetik mühendisliği konusu son yıllarda giderek daha popüler hale geldi. En çok bu bilim dalının gelişiminin yol açabileceği olumsuz sonuçlara dikkat çekiliyor ve genetik mühendisliğinin çok az da olsa sağlayabileceği faydalara yer veriliyor.

En umut verici uygulama alanı, genetik mühendisliği teknolojileri kullanılarak ilaç üretimidir. Son zamanlarda, transgenik bitkilere dayalı faydalı aşılar elde etmek mümkün hale geldi. Aynı teknolojileri kullanarak gıda ürünlerinin üretimi daha az ilgi çekici değildir.

Genetik mühendisliği geleceğin bilimidir. Şu anda tüm dünyada milyonlarca hektarlık arazi transgenik bitkilerle ekilmekte, benzersiz ilaçlar ve yeni faydalı madde üreticileri yaratılmaktadır. Zamanla, genetik mühendisliği tıpta, tarımda, gıda işlemede ve hayvancılıkta yeni ilerlemeler sağlayacaktır.

Bu çalışmanın amacı, olasılığın özelliklerini, gelişim tarihini ve genetik mühendisliğinin kapsamını incelemektir.

1. Genetik mühendisliğinin olanakları

Biyoteknolojinin önemli bir bileşeni genetik mühendisliğidir. 70'lerin başında doğdu, bugün büyük başarılar elde etti. Genetik mühendisliği teknikleri, bakteri, maya ve memeli hücrelerini, herhangi bir proteinin büyük ölçekli üretimi için "fabrikalara" dönüştürür. Bu, proteinlerin yapı ve işlevlerinin ayrıntılı olarak analiz edilmesini ve ilaç olarak kullanılmasını mümkün kılar. Şu anda Escherichia coli (E. coli), insülin ve somatotropin gibi önemli hormonların tedarikçisi haline geldi. Önceleri insülin hayvan pankreas hücrelerinden elde ediliyordu, dolayısıyla maliyeti çok yüksekti. 100 g kristal insülin elde etmek için 800-1000 kg pankreas gerekir ve bir ineğin bezinin ağırlığı 200-250 gramdır. Bu, insülini pahalı ve geniş bir diyabet hastası yelpazesi için erişimi zor hale getirdi. 1978'de Genentech'teki araştırmacılar, özel olarak tasarlanmış bir Escherichia coli suşunda ilk insülini yaptılar. İnsülin, 20 ve 30 amino asit uzunluğunda iki polipeptit zinciri A ve B'den oluşur. Disülfit bağları ile bağlandıklarında doğal çift zincirli insülin oluşur. E. coli proteinleri, endotoksinler ve diğer safsızlıklar içermediği, hayvan insülini gibi yan etkileri olmadığı ve biyolojik aktivitesi olmadığı gösterilmiştir.

farklı. Daha sonra proinsülin, ters transkriptaz kullanılarak RNA şablonu üzerinde bir DNA kopyasının sentezlendiği E. coli hücrelerinde sentezlendi. Elde edilen proinsülin saflaştırıldıktan sonra parçalanarak doğal insülin elde edilirken, hormonun ekstraksiyon ve izolasyon aşamaları en aza indirilmiştir. 1000 litre kültür sıvısından 200 grama kadar hormon elde edilebilmekte olup bu da bir domuz veya ineğin pankreasından 1600 kg salgılanan insülin miktarına eşdeğerdir.

Somatotropin, hipofiz bezi tarafından salgılanan bir insan büyüme hormonudur. Bu hormonun eksikliği hipofiz cüceliğine yol açar. Somatotropin haftada üç kez vücut ağırlığının kilogramı başına 10 mg'lık dozlarda verilirse, eksikliğinden muzdarip bir çocuk yılda 6 cm büyüyebilir, nihai farmasötik ürün. Dolayısıyla mevcut hormon miktarları sınırlıydı, üstelik bu yöntemle üretilen hormon heterojendi ve yavaş gelişen virüsleri içerebiliyordu. 1980 yılında "Genentec" şirketi, bu eksikliklerden yoksun olan bakterilerin yardımıyla büyüme hormonu üretimi için bir teknoloji geliştirdi. 1982 yılında Fransa'daki Pasteur Enstitüsünde E. coli ve hayvan hücrelerinin kültüründen insan büyüme hormonu elde edilmiş ve 1984 yılından itibaren SSCB'de endüstriyel insülin üretimine başlanmıştır. İnterferon üretiminde hem E. coli, S. cerevisae (maya), hem de bir fibroblast kültürü veya dönüştürülmüş lökositler kullanılır. Güvenli ve ucuz aşılar da benzer yöntemlerle elde ediliyor.

Son derece spesifik DNA problarının üretimi, dokulardaki gen ekspresyonunu, genlerin kromozomlardaki lokalizasyonunu inceledikleri ve ilgili işlevlere sahip genleri tanımladıkları (örneğin, insanlarda ve tavuklarda) rekombinant DNA teknolojisine dayanmaktadır. ). DNA probları çeşitli hastalıkların tanısında da kullanılmaktadır.

Rekombinant DNA teknolojisi, ters genetik adı verilen geleneksel olmayan bir protein-gen yaklaşımını mümkün kılmıştır. Bu yaklaşımla, hücreden bir protein izole edilir, bu proteinin geni klonlanır ve modifiye edilerek, proteinin değiştirilmiş bir formunu kodlayan bir mutant gen yaratılır. Ortaya çıkan gen, hücreye verilir. İfade edilirse, onu taşıyan hücre ve onun soyundan gelenler, değiştirilmiş proteini sentezler. Bu sayede kusurlu genler düzeltilebilir ve kalıtsal hastalıklar tedavi edilebilir.

Hibrit DNA döllenmiş bir yumurtaya eklenirse, mutasyona uğramış geni ifade eden ve onu yavrulara aktaran transgenik organizmalar elde edilebilir. Hayvanların genetik dönüşümü, hem diğer genlerin aktivitesinin düzenlenmesinde hem de çeşitli patolojik süreçlerde bireysel genlerin ve bunların protein ürünlerinin rolünü belirlemeyi mümkün kılar. Genetik mühendisliği sayesinde viral hastalıklara dirençli hayvan soyları ve insanlara faydalı özelliklere sahip hayvan ırkları yaratılmıştır. Örneğin, sığır somatotropin genini içeren rekombinant DNA'nın bir tavşan zigotuna mikroenjeksiyonu, bu hormonun hiper üretimi ile transgenik bir hayvanın elde edilmesini mümkün kıldı. Ortaya çıkan hayvanlar belirgin akromegaliye sahipti.

Genlerin maddi temellerinin taşıyıcıları, DNA ve proteinleri içeren kromozomlardır. Ancak oluşum genleri kimyasal değil, işlevseldir. İşlevsel bir bakış açısından, DNA, belirli miktarda bilgi depolayan birçok bloktan oluşur - genler. Bir genin etkisi, RNA yoluyla protein sentezini belirleme yeteneğine dayanır. DNA molekülünde olduğu gibi, protein moleküllerinin kimyasal yapısını belirleyen bilgiler kaydedilir. Bir gen, tek bir proteinin (bir gen - bir protein) birincil yapısı hakkında bilgi içeren bir DNA molekülünün bir bölümüdür. Organizmalarda onbinlerce protein olduğu gibi onbinlerce gen de vardır. Bir hücrenin tüm genlerinin toplamı onun genomunu oluşturur. Vücudun tüm hücreleri aynı gen setini içerir, ancak her biri depolanan bilginin farklı bir bölümünü uygular. Bu nedenle, örneğin sinir hücreleri, karaciğer hücrelerinden hem yapısal hem de işlevsel ve biyolojik özelliklerde farklılık gösterir.

Şimdi, önümüzdeki birkaç on yılda gerçekleşecek tüm fırsatları tahmin etmek bile zor.

2. Genetik mühendisliğinin tarihi

Yüksek biyomedikal teknolojilerin, genetik araştırma yöntemlerinin ve genetik mühendisliğinin tarihi, evcil hayvanların ve kültür bitkilerinin ırklarını iyileştirmeye yönelik sonsuz insan arzusuyla doğrudan ilişkilidir. Hayvan ve bitki gruplarından belirli bireyleri seçip birbirleriyle melezleyerek, canlıların içinde meydana gelen süreçlerin içsel özü hakkında doğru bir fikre sahip olmayan bir kişi, yine de yüzlerce ve binlerce yıldır insanlar için bazı faydalı ve gerekli özelliklere sahip olan gelişmiş hayvan ırkları ve bitki çeşitleri yarattı.

18. ve 19. yüzyıllarda, işaretlerin nesilden nesile nasıl aktarıldığını bulmak için birçok girişimde bulunuldu. Önemli bir keşif, 1760 yılında, poleni bir tür erkek organdan başka bir tür dişi organa aktararak iki tür tütünü melezleyen botanikçi Kellreuter tarafından yapıldı. Hibrit tohumlardan elde edilen bitkiler, her iki ebeveyninkiler arasında orta özelliklere sahipti. Kellerreiter mantıksal olarak bundan ebeveyn özelliklerinin hem polen (tohum hücreleri) hem de ovüller (ova) yoluyla aktarıldığı sonucuna vardı. Bununla birlikte, bitki ve hayvanların melezleştirilmesiyle uğraşan ne o ne de çağdaşları, kalıtımın aktarım mekanizmasının doğasını ortaya çıkaramadı. Bu kısmen, o zamanlar bu mekanizmanın sitolojik temelinin henüz bilinmemesinden, ancak esas olarak bilim adamlarının tüm bitki özelliklerinin kalıtımını aynı anda incelemeye çalıştıklarından kaynaklanmaktadır.

Belirli özelliklerin ve özelliklerin kalıtımını incelemeye yönelik bilimsel yaklaşım, 1865 yazında manastırının topraklarında bitki hibridizasyonu (farklı bezelye çeşitlerini geçerek) deneylerine başlayan Avusturyalı Katolik keşiş Gregor Mendel tarafından geliştirildi. Genetiğin temel yasalarını ilk kez keşfetti. Gregor Mendel, farklı, farklı (zıt) özelliklerin kalıtımını incelediği, her türün yavru sayısını saydığı ve tüm çaprazlama deneylerinin ayrıntılı kayıtlarını dikkatle tuttuğu için başarılı oldu. Matematiğin temelleriyle tanışması, elde edilen verileri doğru bir şekilde yorumlamasına ve her özelliğin iki kalıtsal faktör tarafından belirlendiği varsayımını ortaya koymasına izin verdi. Yetenekli keşiş-araştırmacı daha sonra kalıtsal özelliklerin karışmadığını, ancak belirli birimler şeklinde yavrulara aktarıldığını açıkça gösterebildi. Bu parlak sonuç daha sonra, kromozomları görmek ve farklı hücre bölünmesi türlerinin özelliklerini bulmak mümkün olduğunda tamamen doğrulandı: mitoz (somatik hücreler - vücut hücreleri), mayoz (cinsiyet, üreme, üreme) ve döllenme.

Mendel, çalışmalarının sonuçlarını Brunn Doğa Bilimleri Derneği'nin bir toplantısında bildirdi ve bu toplumun tutanaklarında yayınladı. Elde ettiği sonuçların önemi çağdaşları tarafından anlaşılmamış ve bu çalışmalar yaklaşık 35 yıl boyunca bitki yetiştiricilerinin ve doğa bilimcilerin ilgisini çekmemiştir.

1900 yılında, mitoz, mayoz ve döllenme türüne göre hücre bölünmesinin ayrıntıları öğrenildikten sonra, üç araştırmacı - Hollanda'da de Vries, Almanya'da Correns ve Avusturya'da Tschermak - bir dizi deney yaptı ve birbirinden bağımsız olarak , daha önce Mendel tarafından açıklanan kalıtım yasalarını yeniden keşfetti. Daha sonra Mendel'in bu yasaların kendilerinden 35 yıl önce açıkça formüle edildiği makalesini keşfettiklerinde, bu bilim adamları oybirliğiyle keşiş bilim adamına saygılarını sunarak kalıtımın iki temel yasasına onun adını verdiler.

20. yüzyılın ilk on yılında, çok çeşitli bitki ve hayvanlarla deneyler yapıldı ve insanlarda özelliklerin kalıtımı ile ilgili çok sayıda gözlem yapıldı, bu da kalıtımın tüm bu organizmalarda aynı temel yasalara uyduğunu açıkça gösterdi. Mendel'in tarif ettiği ve belirli bir özelliği belirleyen faktörlerin, hücre çekirdeğinin kromozomlarında yer aldığı bulundu. Daha sonra, 1909'da, bu birimler Danimarkalı botanikçi Johansen (Yunanca "genos" - cins, köken kelimesinden) tarafından genler olarak adlandırıldı ve Amerikalı bilim adamı William Setton, gamet oluşumu sırasında kromozomların davranışları arasında inanılmaz bir benzerlik fark etti ( cinsiyet hücreleri), döllenmeleri ve Mendel kalıtsal faktörlerinin transferi - genler. Bu parlak keşiflere dayanarak, sözde kromozom kalıtım teorisi yaratıldı.

Kesin olarak konuşursak, canlı organizmaların kalıtımı ve değişkenliği bilimi ve onları yönetme yöntemleri olarak genetiğin kendisi 20. yüzyılın başında ortaya çıktı. Amerikalı genetikçi T. Morgan, meslektaşlarıyla birlikte, cinsiyet belirlemenin genetik temelini ortaya çıkarmayı ve bir özelliğin aktarımının bireyin cinsiyetine bağlı olduğu bir dizi olağandışı kalıtım biçimini açıklamayı mümkün kılan çok sayıda deney yaptı. (sözde cinsiyete bağlı özellikler). İleriye yönelik bir sonraki büyük adım, 1927'de G. Meller, meyve sineği Drosophila ve diğer organizmaları X ışınlarıyla ışınlayarak, bunlarda yapay olarak gen değişikliklerini, yani mutasyonları tetiklemenin mümkün olduğunu bulduğunda atıldı. Bu, kalıtım çalışması için ek materyal olan birçok yeni mutant genin elde edilmesini mümkün kıldı. Mutasyonların doğasına ilişkin veriler, genlerin yapısını ve anlaşılmasını sağlayan anahtarlardan biri olmuştur.

Yüzyılımızın 20'li yıllarında, A.S. Serebrovsky, genin ne kadar karmaşık olduğunu gösteren ilk deneyleri gerçekleştirdi. Bu fikirler, 1953'te İngiltere'de bir DNA modeli oluşturmayı ve genetik kodu deşifre etmeyi başaran J. Watson ve F. Crick tarafından kullanıldı. Daha sonra, genetik materyalin yeni kombinasyonlarının amaçlı olarak oluşturulmasıyla ilgili araştırma çalışmaları genişletildi ve genetik mühendisliğinin kendisinin ortaya çıkmasına yol açtı.

Aynı zamanda, 1940'larda, genler ve enzimler arasındaki ilişkinin deneysel bir çalışması başladı. Bu amaçla, başka bir nesne yaygın olarak kullanıldı - bir veya başka bir özel enzimin (protein) kaybıyla ilişkili bir dizi biyokimyasal mutasyonu yapay olarak elde etmenin ve incelemenin mümkün olduğu küf mantarı Neurospora. Son yirmi yılda, Escherichia coli ve bu bakteriyi enfekte eden bazı bakteriyofajlar, genetik araştırmaların en yaygın nesneleri olmuştur.

20. yüzyılın başından beri, insanlarda belirli (spesifik) özelliklerin kalıtımını ve evcil hayvanlarda ve ekili bitkilerde istenen ve istenmeyen özelliklerin kalıtsal aktarımını incelemeye bitmez tükenmez bir ilgi olmuştur. Genetik kalıplarla ilgili sürekli artan bilgiye dayanarak, genetik bilimcileri ve yetiştiriciler, sıcak iklimlerde hayatta kalabilen çiftlik hayvanları, yüksek yağ içeriğine sahip çok süt veren inekler, büyük yumurtlayan tavuklar yetiştirmeyi neredeyse sipariş verecek şekilde öğrendiler. ince kabuklu, bazı hastalıklara karşı oldukça dirençli olan mısır ve buğday çeşitleri.

1972'de ABD'de P. Berg'in laboratuvarında ilk hibrit (rekombinant) DNA elde edildi. İnsan genetiği alanındaki heyecan verici fikirler ve genetik araştırma yöntemleri geniş çapta geliştirilmeye ve tıpta uygulanmaya başlandı. 1970'lerde insan genomunun şifresi çözülmeye başlandı. On yıldan fazla bir süredir İnsan Genomu adlı bir proje var. Kesintisiz geçişler halinde düzenlenmiş 3 milyar nükleotit çiftinden şimdiye kadar sadece yaklaşık 10 milyon karakter okunmuştur. Aynı zamanda, DNA okuma hızını artıran yeni genetik teknikler yaratılıyor. Rusya Tıp Bilimleri Akademisi Tıbbi Genetik Merkezi Direktörü V.I. Ivanov kesinlikle "tüm genomun yaklaşık 2020'de okunacağına" inanıyor.

3. Bir bilim olarak genetik mühendisliği. Genetik mühendisliği yöntemleri

Genetik mühendisliği, işlevsel olarak aktif genetik yapıların (rekombinant DNA) in vitro inşası veya başka bir deyişle yapay genetik programların (Baev A.A.) oluşturulmasıdır. E.S.'ye göre. Piruzyan'ın genetik mühendisliği, laboratuvarda (in vitro) sözde rekombinant veya hibrit DNA molekülleri şeklinde yapay genetik yapılar inşa etmeyi mümkün kılan bir deneysel yöntemler sistemidir.

Önceden belirlenmiş bir programa göre, moleküler genetik sistemlerin vücut dışında inşa edilmesi ve ardından canlı bir organizmaya sokulmasından bahsediyoruz. Bu durumda, rekombinant DNA, alıcı organizmanın genetik aparatının ayrılmaz bir parçası haline gelir ve ona yeni benzersiz genetik, biyokimyasal ve ardından fizyolojik özellikler kazandırır.

Uygulamalı genetik mühendisliğinin amacı, genetik aygıta eklendiğinde vücuda insanlar için yararlı olan özellikler kazandıracak rekombinant DNA molekülleri tasarlamaktır.

Rekombinant DNA teknolojisi aşağıdaki yöntemleri kullanır:

Tek tek genlerin izolasyonunu ve manipülasyonunu hızlandıran, kısıtlama nükleazları tarafından DNA'nın spesifik bölünmesi;

Genin sınırlarını ve onun tarafından kodlanan amino asit dizisini belirlemenizi sağlayan, saflaştırılmış bir DNA parçasının tüm nükleotidlerinin hızlı dizilimi;

Rekombinant DNA'nın inşası;

Tamamlayıcı nükleik asit dizilerini bağlama yeteneklerine bağlı olarak spesifik RNA veya DNA dizilerinin daha yüksek doğruluk ve hassasiyetle saptanmasına olanak sağlayan nükleik asit hibridizasyonu;

DNA klonlama: polimeraz zincir reaksiyonu ile in vitro amplifikasyon veya bir DNA fragmanının, böyle bir dönüşümden sonra bu fragmanı milyonlarca kopya halinde yeniden üreten bir bakteri hücresine sokulması;

Rekombinant DNA'nın hücrelere veya organizmalara sokulması.

4. Genetik mühendisliğinin uygulama alanları

Şu anda insan genetiği alanında yapılan bilimsel keşifler aslında devrim niteliğindedir, çünkü bir "insan genomu haritası" veya "insan genomunun patolojik anatomisi" oluşturma olasılığından bahsediyoruz. Bu genetik harita, uzun bir DNA sarmalında belirli kalıtsal hastalıklardan sorumlu genlerin yerini belirlemeye olanak sağlayacaktır. Genetik bilim adamlarına göre, bu sınırsız olasılıklar, yüksek biyomedikal teknolojiler kullanılarak etkilenen genlerin değiştirilmesiyle ilişkili hastaların tedavisinde bir yön olan sözde gen terapisini klinik uygulamada uygulama fikrinin temelini oluşturdu. ve genetik mühendisliği. İnsan gen sistemlerinin bileşimine müdahale ve hayati aktivitelerinin sağlanması, hem vücudun somatik (belirli yapısal ve işlevsel farklılıklara sahip herhangi bir bedensel) hücre düzeyinde hem de cinsiyet, üreme (germinal) ve germinal düzeyde mümkündür. (embriyonik) hücreler.

Bir terapi türü olarak genetik mühendisliği - genetik olarak belirlenmiş belirli bir hastalığın tedavisi - yardımıyla bu geni - kromozomun bir kusur içeren bir bölümünü - değiştirmek için uygun, kusurlu olmayan bir DNA molekülünün sağlanmasıyla ilişkilidir. veya insan vücudunun genetik bir kusuru olan sözde somatik hücreleriyle birleşerek insan genetik materyaline entegre etmek. Genetik mühendisliğinin bir kişiyle ilgili görevi, belirli bir gen üzerinde uygun bir hedef etki sağlamak ve onu düzgün işleyiş yönünde düzeltmek ve kalıtsal bir hastalıktan muzdarip bir kişiye genin normal, değişmemiş bir versiyonunu sağlamaktır. . İlaç tedavisinden farklı olarak, genetik mühendisliği adı verilen bu terapinin hastaya büyük bir rahatlama ve fayda sağlayan uzun, uzun süreli, oldukça etkili bir tedavi sağlaması muhtemeldir.

Bununla birlikte, DNA'yı canlı organizmalara sokmaya yönelik tüm modern yöntemler, onu değiştirilmiş ve dolayısıyla arızalı bir gen içeren belirli bir hücre popülasyonuna yönlendiremez ve iletemez. Başka bir deyişle, sözde yönlendirilmiş aktarım, genlerin vücut koşulları altında ("in vivo" modelde) taşınması şu anda imkansızdır.

Etkilenen geni içeren belirli bir hücre popülasyonunun hastanın vücudundan çıkarılmasına ve genetik mühendisliği kullanılarak ("in vitro" modelde) hücrelerdeki kusurlu genlerin değiştirilmesi ve bunların aynı yere geri döndürülmesi yoluyla genetik materyalin manipüle edilmesine dayanan başka bir metodolojik yaklaşım. hastadan alındıkları vücut, şu anda tıbbi genetik merkezlerinin koşullarında mümkün. Genetik mühendisliği yoluyla yapılan bu gen terapisi yöntemi, beta talasemi olarak adlandırılan ve orak hücreli anemi gibi bir hastalığın varlığından kaynaklanan nadir bir genetik olarak belirlenmiş hastalıktan muzdarip iki hastayı iyileştirmek için deneysel bir girişimde zaten kullanılmıştır. kırmızı kan hücrelerinde anormal şekilde düzenlenmiş ve bu nedenle arızalı protein. Manipülasyonun özü, sözde kök hücrelerin, normal hemoglobulin proteininin üretiminden sorumlu DNA bölümünün - genin sokulduğu kromozomlara bu hastaların kemik iliğinden izole edilmesiydi. Hastanın kemik iliğinde kalan arızalı kök hücreler neredeyse tamamen yok edildikten sonra genetiğiyle oynanmış kök hücreler hastalara tanıtıldı. Ne yazık ki, hastalar öldüğü için bu iki girişim klinik olarak başarısız oldu. Bir hastane ortamındaki bu ilk genetik mühendisliği vakası, ilgili kontrol komiteleri tarafından yetkilendirilmedi veya onaylanmadı ve katılımcıları, insan genetiği alanında araştırma yürütme kurallarının ağır ihlali nedeniyle şiddetle kınandı.

Üreme (cinsiyet) hücrelerinin genetik mühendisliği, tamamen farklı sonuçlara yol açabilir, çünkü bu hücrelere DNA'nın dahil edilmesi, somatik (bedensel, cinsiyet dışı) hücrelerdeki genetik bir kusurun düzeltilmesinden farklıdır. Germ hücrelerinin kromozomlarına başka genlerin dahil edilmesinin sonraki nesillere aktarılmasına yol açtığı bilinmektedir. Prensip olarak, genetik olarak önceden belirlenmiş şu veya bu hastalığa yakalanmış belirli bir kişinin her üreyen hücresinin genetik materyaline kusurlu bölümlerin yerine DNA'nın belirli bölümlerinin eklenmesi tasavvur edilebilir.

Gerçekten de, bu farelerde başarılmıştır. Böylece, bir dişinin yumurtalığından bir yumurta elde edildi ve daha sonra bir test tüpünde (in vitro) döllendi ve ardından döllenmiş yumurtanın kromozomuna yabancı bir DNA segmenti sokuldu. Değiştirilmiş bir genoma sahip aynı döllenmiş yumurta, bir dişi farenin anne rahmine implante edildi (verildi). Bir deneyde yabancı DNA'nın kaynağı, bir tavşanın genetik materyaliydi ve diğerinde - bir insandı.

Fetüsün intrauterin gelişim döneminde, bir çocuğun Down sendromu veya Tay-Sachs hastalığı gibi belirli genetik anormalliklerle doğma olasılığını tespit etmek için, amniyosentez adı verilen bir araştırma tekniği kullanılır - doğum öncesi analiz Gebeliğin ikinci üç aylık döneminin başlarında amniyotik keseden alınan eşey hücreleri içeren biyolojik bir sıvı örneğinin alındığı esnada. Ek olarak, bir annenin plasenta kan örneğinden çeşitli fetal hücrelerin çıkarılması yöntemi daha da geliştirildi. Bu şekilde elde edilen rahim hücreleri, şu anda yalnızca, DNA yapısında belirgin, büyük ihlallerin ve biyokimyasal analizlerle belirlenen değişikliklerin olduğu, genetik olarak belirlenmiş sınırlı sayıda hastalığın tespitinde kullanılabilecektir. Fetal araştırmalarda rekombinant DNA kullanan genetik mühendisliği, çeşitli ve çok sayıda kalıtsal hastalığı doğru şekilde teşhis etme olasılığını açar.

Bu durumda, kromozomda normal, değişmemiş bir genin mi yoksa anormal, kusurlu bir genin mi bulunduğunu belirlemenin mümkün olduğu sözde gen "probları" oluşturmak için yöntemler geliştirilmektedir. Ek olarak, oluşum aşamalarından biri olan rekombinant DNA'nın kullanımıyla ilişkili genetik mühendisliği, gelecekte insan genlerinin sözde "planlanmasına" izin verecek, böylece taşıyan belirli bir gen bozuk, patolojik bilgi ve bu nedenle genetikçilerin ilgi alanına giren bilgiler, başka bir "etiketli" genin kullanılması yöntemine benzetilerek zamanında ve yeterince hızlı bir şekilde tespit edilebilir. Bu sofistike biyomedikal teknik, yalnızca amniyosentez tekniği kullanılarak çeşitli bozuklukları tespit etme olasılığının mümkün olduğu durumlarda değil, rahim hücrelerinde herhangi bir genin bulunmasına yardımcı olmalıdır.

Bu bağlamda son yıllarda örneğin yüksek DNA teknolojileri, embriyonik tedavi ve hücre tedavisi (sitoterapi), yani genetik olarak belirlenmiş bir hastalığın rahim içi tanı ve tedavisi gibi biyomedikal bilimlerin yeni bölümleri ortaya çıkmıştır. embriyonun (embriyo) oluşum ve gelişme aşaması ve fetal olgunlaşma aşamasında. Embriyonik materyale yapılan müdahaleler ve manipülasyonlar, nesilden nesile aktarılma yeteneğine sahip olduklarından, genetik değişikliklerin kalıtımı üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir. Dahası, genetik teşhisin kendisi genetik tahmine, yani bir kişinin gelecekteki kaderini belirlemeye, karmaşık tıbbi genetik deneyler ve tekniklerin bir sonucu olarak çok önce mümkün olan tıptaki ana devrimci değişiklikleri pekiştirmeye başlar. "hastalığın klinik tablosunun" ortaya çıkışı , hatta bazen bir kişinin doğumundan önce, hangi kalıtsal rahatsızlıkların onu tehdit ettiğini belirlemek için. Böylece genetikçilerin ve genetik mühendisliği alanındaki uzmanların çabaları sayesinde biyomedikal bilimlerin derinliklerinde sözde "kestirimci tıp", yani "gelecek için tahminlerde bulunan" tıp doğdu.

Aynı zamanda, çeşitli genetik mühendisliği teknolojileri ve teknikleri, bir çocuğun gelişiminin doğum öncesi döneminde bile, doğumundan önce, onda yalnızca belirli bir kalıtsal hastalığın varlığını tahmin etmeyi değil, aynı zamanda ayrıntılı olarak tanımlamayı da mümkün kılar. Büyüyen bir embriyo ve fetüsün tıbbi genetik özellikleri.

İnsan genomunun genetik haritalaması ve DNA'sının tanımı (dizilemesi) hakkında yeni verilerin birikmesi ve ayrıca DNA polimorfizmlerini incelemek için geliştirilen modern yöntemlerin, belirli yapısal ve işlevsel (dahil olmak üzere) hakkında mevcut genetik bilgiyi mümkün kıldığı için. insan vücudunun, görünüşe göre gelecekte kendini gösterecek olan, ancak henüz fark edilmeyen patolojik) özellikleri, tıbbi genetik teşhis yardımıyla, çocukla ilgili tüm genetik bilgileri, yalnızca preklinik olarak değil, elde etmek mümkün hale gelir. , yani, belirli bir kalıtsal hastalığın tezahüründen önce ve doğum öncesi, yani doğumundan önce , ama aynı zamanda öngörüsel olarak, yani gebe kalmadan önce.

Öngörülebilir gelecekte, tıbbi genetik teşhis alanındaki başarı ve ilerleme sayesinde, DNA teşhisine göre, örneğin bir kişinin boyunun ne olacağını, zihinsel yeteneklerini oldukça güvenle yargılamak mümkün olacaktır. herhangi bir kalıtsal hastalığın tezahürüne ve gelişmesine mahkum olan belirli hastalıklara (özellikle onkolojik veya zihinsel) yatkınlık.

Modern biyomedikal teknolojiler, yalnızca klinik olarak belirgin bir hastalık aşamasında değil, aynı zamanda henüz hiçbir patoloji belirtisi olmadığında ve hastalığın kendisi kendini göstermediğinde de, kendilerini gösterebilen ve belirli rahatsızlıklara neden olabilen genlerdeki çeşitli bozuklukları tespit etmeyi mümkün kılar. çok yakında. Bunun örnekleri, 40 yaşın üzerindeki bir kişiyi ve hatta 70 yaşındaki bir kişiyi etkilemek, Alzheimer hastalığı ve Huntington koresi olabilir. Ancak bu durumlarda bile, insanlarda benzer hastalıklara neden olabilecek genleri, hastanın gebe kalmasından önce bile tespit etmek mümkündür. Diabetes mellitusun da bu tür hastalıklar arasında sınıflandırılabileceği bilinmektedir. Bu hastalığa yatkınlık ve genetik olarak belirlenmiş patolojinin kendisi kalıtsaldır ve yetişkinlikte veya yaşlılıkta belirli bir yaşam tarzına uyulmaması durumunda kendini gösterebilir. Makul bir kesinlikle söylenebilir ki, ebeveynlerden biri veya her iki ebeveyn de diyabet hastasıysa, o zaman "diyabet" genini veya bu tür genlerin bir kombinasyonunu miras alma olasılığı çocuklara aktarılır.

Aynı zamanda mikroskobik olarak küçük miktarlarda biyolojik materyal varlığında uygun biyomedikal çalışmalar yapmak ve doğru tanı koymak mümkündür. Bazen bunun için birkaç bireysel hücre yeterlidir, bu da in vitro kültürde çoğaltılır ve test edilen kişinin "genetik portresi" onlardan elde edilir, elbette genomunun tüm genleri için değil (vardır). on binlerce!), ancak belirli kusurlardan şüphelenmek için iyi nedenleri olanlar için. Hücresel ve genetik mühendisliği yöntemlerinin eşzamanlı gelişimi, genomun sonraki biliş aşamalarında, keyfi olarak ve öncelikle terapötik amaçlar için, genlerin dizisini ve sırasını, bileşimlerini ve yapılarını değiştirmenin pratik olasılığını keşfetmeyi mümkün kılacaktır.

Genetik mühendisliğinin tek uygulama alanı tıp değildir. Bitkilerin genetik mühendisliğini, bakteriyolojik hücrelerin genetik mühendisliğini ayırt eder.

Son zamanlarda, transgenik bitkilere dayalı "yenilebilir" aşıların elde edilmesinde yeni fırsatlar ortaya çıkmıştır.

Dünyada transgenik bitkilerde büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Bunlar büyük ölçüde bitkilerde bir hücreden, bir hücre grubundan veya olgunlaşmamış bir embriyodan bir organizma elde etme probleminin artık çok da önemli olmamasıyla ilgilidir. Hücre teknolojileri, doku kültürü ve rejenere ajanların yaratılması modern bilimde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Rusya Bilimler Akademisi Sibirya Şubesi Sibirya Bitki Fizyolojisi ve Biyokimya Enstitüsü'nde elde edilen bitki yetiştirme alanındaki başarıları düşünün.

Böylece son yıllarda çeşitli bitki nesnelerinden izole edilen ugt, acp, acb, accc ve diğer genlerin genomlarına aktarılmasıyla çok sayıda transgenik bitki elde edilmiştir.

Bu genlerin tanıtılmasının bir sonucu olarak, buğday, patates, domates, salatalık, soya fasulyesi, bezelye, kolza tohumu, çilek, titrek kavak ve diğerlerinin transgenik bitkileri ortaya çıktı.

Genlerin tanıtılması, dokuları bir "gen tabancası" (tasarısı enstitümüzde geliştirilen) ile "bombalayarak" veya yerleşik hedef genler ve karşılık gelen promotörler içeren bir agrobakteriyel plazmide dayalı bir genetik vektör tarafından gerçekleştirildi. .

Sonuç olarak, bir dizi yeni transgenik form oluşturulmuştur. Bunlardan bazıları.

Çok daha yoğun büyüme ve kardeşlenme gösteren transgenik buğday (2 çeşit), muhtemelen kuraklığa ve diğer olumsuz çevresel faktörlere karşı daha dirençlidir. Verimliliği ve edinilen özelliklerin kalıtımı incelenmektedir.

Üç yıldır gözlemlenen transgenik patatesler. Kontrolden sürekli olarak yüzde 50-90 daha yüksek verim sağlar, oksin herbisitlere karşı neredeyse tam bir direnç kazanmıştır ve ek olarak, polifenol oksidaz aktivitesinde bir azalma nedeniyle yumruları kesiklerde çok daha az "kararır".

Daha fazla kardeşlenme ve verim ile karakterize edilen transgenik domates (birkaç çeşit). Bir serada verimi metrekare başına 46 kg'a kadar çıkar (kontrolden iki kat daha fazla).

Transgenik salatalık (çeşitli çeşitler), kontroldeki 13,7'ye kıyasla metrekare başına 21 kg'a varan verimle daha verimli çiçekler ve sonuç olarak meyveler üretir.

Birçoğu aynı zamanda bir takım faydalı ekonomik özelliklere sahip olan başka bitkilerin transgenik formları da vardır.

Genetik mühendisliği bugünün ve yarının bilimidir. Şimdiden dünyada transgenik bitkilerle on milyonlarca hektar ekiliyor, yeni ilaçlar, yeni faydalı madde üreticileri yaratılıyor. Zamanla, genetik mühendisliği tıpta, veterinerlikte, farmakolojide, gıda endüstrisinde ve tarımda yeni gelişmeler için giderek daha güçlü bir araç haline gelecek.

5. Genetik mühendisliğinin tehlikeleri hakkında bilimsel gerçekler

Genetik mühendisliğinin gelişiminin getirdiği ilerlemeyle birlikte, genetik mühendisliğinin tehlikelerine ilişkin bazı gerçeklerin ayırt edildiğine dikkat edilmelidir, bunların başlıcaları aşağıda sunulmuştur.

1. Genetik mühendisliği, yeni çeşitler ve ırklar yetiştirmekten temel olarak farklıdır. Yabancı genlerin yapay olarak eklenmesi, normal bir hücrenin ince ayarlı genetik kontrolünü büyük ölçüde bozar. Gen manipülasyonu, doğal geçişte meydana gelen anne ve baba kromozomlarının kombinasyonundan temel olarak farklıdır.

2. Şu anda, genetik mühendisliği teknik olarak kusurludur, çünkü yeni bir gen yerleştirme sürecini kontrol edemez. Bu nedenle ekleme bölgesini ve eklenen genin etkilerini tahmin etmek mümkün değildir. Genom içine yerleştirildikten sonra genin yeri belirlenebilse bile, mevcut DNA bilgisi sonuçları tahmin etmek için çok eksiktir.

3. Yabancı bir genin suni eklenmesi sonucunda beklenmedik şekilde tehlikeli maddeler oluşabilir. En kötü durumda bunlar toksik maddeler, alerjenler veya diğer sağlıksız maddeler olabilir. Bu tür olasılıklarla ilgili bilgiler hala çok eksik.

4. Zararsızlık için kesinlikle güvenilir test yöntemleri yoktur. Dikkatle yürütülen güvenlik çalışmalarına rağmen, yeni ilaçların ciddi yan etkilerinin %10'dan fazlası tespit edilememektedir. Yeni, genetiğiyle oynanmış gıdaların tehlikeli özelliklerinin fark edilmeme riski muhtemelen ilaçlardan çok daha fazladır.

5. Zararsızlık testi için mevcut gereklilikler son derece yetersizdir. Onay sürecini basitleştirecek şekilde açık bir şekilde kaleme alınmıştır. Zararsızlık için son derece duyarsız test yöntemlerinin kullanılmasına izin verirler. Bu nedenle, sağlıksız gıda maddelerinin tespit edilmeden muayeneden geçme riski vardır.

6. Genetiğiyle oynanmış gıdaların şu ana kadar insanlık için önemli bir değeri yok. Bu ürünler, yalnızca ticari çıkarlara hizmet eder.

7. Genetik mühendisliği ile değiştirilen ve oraya getirilen organizmaların çevre üzerindeki etkisi konusundaki bilgiler tamamen yetersizdir. Genetiği değiştirilmiş organizmaların çevre üzerinde zararlı bir etkisinin olmayacağı henüz kanıtlanmamıştır. Ekolojistler, çeşitli potansiyel çevresel komplikasyonlar hakkında spekülasyon yaptılar. Örneğin, genetik mühendisliği tarafından kullanılan potansiyel olarak zararlı genlerin kontrolsüz yayılması için bakteri ve virüsler tarafından gen transferi dahil birçok fırsat vardır. Salınan genler geri alınamayacağından, çevrede oluşan komplikasyonların onarılamaz olması muhtemeldir.

8. Yeni ve tehlikeli virüsler ortaya çıkabilir. Genomda yerleşik virüslerin genlerinin bulaşıcı virüslerin genleriyle birleşebileceği (sözde rekombinasyon) deneysel olarak gösterilmiştir. Bu yeni virüsler orijinal olanlardan daha agresif olabilir. Virüsler ayrıca daha az türe özgü hale gelebilir. Örneğin, bitki virüsleri insanlara olduğu kadar faydalı böceklere, hayvanlara da zararlı olabilir.

9. Kalıtsal madde olan DNA hakkındaki bilgiler çok eksiktir. DNA'nın sadece %3'ünün çalıştığı bilinmektedir. Hakkında bilgisi eksik olan karmaşık sistemleri manipüle etmek risklidir. Biyoloji, ekoloji ve tıp alanındaki kapsamlı deneyim, bunun öngörülemeyen ciddi sorunlara ve bozukluklara neden olabileceğini göstermektedir.

10. Genetik mühendisliği dünyadaki açlık sorununu çözmeyecek. Genetik mühendisliğinin dünyadaki açlık sorununun çözümüne önemli katkı sağlayabileceği iddiası, bilimsel olarak temelsiz bir efsanedir.

Çözüm

Genetik mühendisliği, genotiplerin yeniden düzenlenmesi ile ilgili araştırmalarla ilgilenen bir biyoteknoloji yöntemidir. Genotip, yalnızca genlerin mekanik bir toplamı değil, organizmaların evrim sürecinde gelişen karmaşık bir sistemdir. Genetik mühendisliği, bir test tüpündeki işlemler yoluyla genetik bilginin bir organizmadan diğerine aktarılmasına izin verir. Gen transferi, türler arası engellerin üstesinden gelmeyi ve bir organizmanın bireysel kalıtsal özelliklerini diğerine aktarmayı mümkün kılar.

Genetik mühendisliği görevlerini yerine getirirken genotiplerin yeniden düzenlenmesi, mikroskopta görülebilen kromozomların yapısındaki değişikliklerle ilişkili olmayan genlerdeki niteliksel bir değişikliktir. Genlerdeki değişiklikler öncelikle DNA'nın kimyasal yapısının dönüşümü ile ilişkilidir. Bir proteinin yapısı hakkında bir dizi nükleotid şeklinde yazılan bilgi, sentezlenen protein molekülündeki bir dizi amino asit şeklinde gerçekleşir. Kromozomal DNA'daki nükleotid dizisindeki bir değişiklik, bazı nükleotidlerin kaybı ve bazılarının dahil olması, DNA üzerinde oluşan RNA moleküllerinin bileşimini değiştirmekte ve bu da sentez sırasında yeni bir amino asit dizisinin oluşmasına neden olmaktadır. Sonuç olarak, hücrede yeni bir protein sentezlenmeye başlar ve bu da vücutta yeni özelliklerin ortaya çıkmasına neden olur. Genetik mühendisliği yöntemlerinin özü, tek tek genlerin veya gen gruplarının bir organizmanın genotipine dahil edilmesi veya bu genotipten dışlanması gerçeğinde yatmaktadır. Daha önce bulunmayan bir genin genotipe eklenmesi sonucunda, hücreyi daha önce sentezlemediği proteinleri sentezlemeye zorlamak mümkündür.

Kaynakça

2. Li A., Tinland B. t-DNA'nın bitki genomuna entegrasyonu: prototip ve gerçeklik // Bitki Fizyolojisi. 2000. - Cilt 47. - No.3.

3. L. A. Lutova, N. A. Provorov, O. N. Tikhodeev ve diğ., Genetics of Plant Development. - St.Petersburg: Nauka, 2000. - 539 s.

4. Lyadskaya M. Genetik mühendisliği her şeyi yapabilir - hatta bahçede aşı bile yetiştirebilir // İlaç Bülteni. - 2000. - 7 numara.

5. Romanov G. A. Bitki genetik mühendisliği ve biyogüvenlik sorununu çözmenin yolları // Bitki Fizyolojisi, 2000. - Cilt 47. - No. 3.

6. Salyaev R. Genetik mühendisliğinin mitleri ve gerçekleri // Sibirya'da bilim. - 2002. - 7 numara.

7. Favorova O. O. Genlerle tedavi - fantezi mi gerçek mi? // İlaç Bülteni. - 2002. - 5 numara.

Kuzmina N.A. Biyoteknolojinin temelleri: ders kitabı. - Omsk: OGPU, 2001. - 256s.

Lutova L.A., Provorov N.A., Tikhodeev O.N. ve diğerleri, Bitki gelişiminin genetiği. - St.Petersburg: Nauka, 2000. - 539 s.

Lyadskaya M. Genetik mühendisliği her şeyi yapabilir - hatta bahçede bir aşı bile yetiştirebilir // İlaç Bülteni. - 2000. - 7 numara.

Kuzmina N.A. Biyoteknolojinin temelleri: ders kitabı. - Omsk: OGPU, 2001. - 256s.

Favorova O. O. Genlerle tedavi - fantezi mi gerçek mi? // İlaç Bülteni. - 2002. - 5 numara.

Salyaev R. Genetik mühendisliğinin mitleri ve gerçekleri // Sibirya'da bilim. - 2002. - 7 numara.

Kuzmina N.A. Biyoteknolojinin temelleri: ders kitabı. - Omsk: OGPU, 2001. - 256s.

Genetik (genetik) mühendisliği

Genetik (genetik) mühendisliği- genetik yapıları ve kalıtsal olarak değiştirilmiş organizmaları yapay olarak inşa etmek. Genetik mühendisliği, konakçı hücrede çoğalabilen yeni DNA moleküllerinin hedeflenen yaratılmasıyla ilişkili moleküler genetiğin bir bölümüdür (uygulamalı dalıdır). Bu durumda organizmanın (mikroorganizma) genotipinde yapay, amaçlı bir değişiklik ve yeni işaret ve özelliklerin oluşumu gerçekleşir. Genetik mühendisliği, genlerin yapısının deşifre edilmesi, sentezlenmesi ve klonlanması, canlı organizmaların hücrelerinden izole edilen genlerin, genetik özelliklerini değiştirmek için bitki ve hayvan hücrelerine sokulması ile uğraşır.

İyi gelişmiş genetik mühendisliği yöntemleri transgenez, mikrobiyolojik sentez vb.

transgenez bir canlı türünden diğerine gen aktarımı. Transgenez, enzimlerin - kısıtlama enzimlerinin ve ligazların katılımıyla DNA bölümlerinin kesilmesi ve dikilmesiyle gerçekleştirilir.

transgenezin aşamaları:

a) bir enzim kullanarak bakteri, bitki veya hayvan hücrelerinden genlerin (DNA fragmanları) izolasyonu kısıtlamalar;

b) genlerin (DNA fragmanları) bir enzim kullanılarak bir plazmit ile bağlanması (çapraz bağlanması) ligazlar;

c) istenen geni içeren bir hibrit plazmit DNA'nın konakçı hücreye sokulması;

d) bu genin konak hücrede kopyalanması (klonlanması) ve "DNA kodu - transkripsiyon - translasyon - protein" şemasına göre çalışmasının sağlanması

Genetik mühendisliği araçları 1974'te keşfedilen enzimler - kısıtlamalar (sınırlama endonükleazları). Kısıtlama enzimleri, DNA'nın bölümlerini (bölgelerini) tanır, DNA zincirlerinde kesimler yapar. Her parçanın uçlarında, "olarak adlandırılan tek zincirli kuyruklar oluşur. yapışkanlı sonlar,çünkü tamamlayıcılık nedeniyle adeta birbirine yapışabilirler.

Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA'da spesifik, yalnızca kendi DNA nükleotid dizilerini tanır. Kısıtlama enzimi daha sonra tanınabilir nükleotid bölgesine bağlanır ve onu bağlanma bölgesinde keser. Daha sıklıkla, kısıtlama enzimleri, DNA molekülündeki 4-6 baz çiftli bölgeleri tanır ve bu bölgelerin ortasında veya genellikle bir ofset ile DNA'nın her iki sarmalını da keser. Kısıtlama örnekleri: Kısıtlama enzimi EcoRI altı nükleotid GAATTC'nin bir DNA fragmanını tanıyan (her iki DNA zincirinin G ve A nükleotitleri arasındaki kesim); kısıtlayıcı Arka III AAGTSTT bölgesini (her iki DNA zincirinin A ve A nükleotitleri arasındaki kesik yeri) tanır; kısıtlayıcı bam ben GGATCC bölgesini (her iki DNA sarmalının G ve G nükleotitleri arasındaki kesik yeri) tanır; kısıtlayıcı Hae III GGCC bölgesini (her iki DNA sarmalının G ve C nükleotitleri arasındaki kesik yeri) tanır; kısıtlayıcı Hpa II CGG bölgesini (her iki DNA zincirinin C ve C nükleotitleri arasındaki kesik yeri) tanır.

Ayrıca, genetiği değiştirilmiş bir organizma oluşturmak için, istenen geni bu organizmanın hücresine sokmak gerekir. Yabancı genlerin vücuda girmesi, kullanılarak gerçekleştirilir. plazmit vektörü. vektör plazmit – küçük dairesel DNA molekülü bir bakteri hücresinin sitoplazmasından ekstrakte edilir. plazmitler- kromozomların dışında bulunan kalıtsal faktörler; kromozom dışı DNA.

Pirinç. 37.

A– Enzimler (kısıtlama endonükleaz ve ligaz) kullanılarak yabancı DNA'yı bakteriyel bir plazmide sokma şeması.

B- İnsülin hormonunun sentezinden ve vektör DNA'sının oluşumundan sorumlu insan geninin transfer şeması.

Plazmitin özellikleri: 1) otonom replikasyon yeteneğine sahiptir; 2) antibiyotikleri kodlayan genleri içerir; 3) alıcı hücrenin kromozomuna entegre olabilir; 4) DNA'nın enzimleri - kısıtlama enzimlerini - kesebilen kısımlarını tanır; 5) kısıtlama enzimi plazmidi kesebilir ve onu doğrusal bir duruma çevirebilir. Araştırmacılar plazmitin bu özelliklerini elde etmek için kullanırlar. rekombinant (hibrit) DNA.

Bir restriksiyon enzimi kullanarak DNA'yı bir plazmide (plazmit vektörü) sokma dizisi(Şek. 37 A):

1) kısıtlama- DNA molekülünün bir restriksiyon enzimi ile kesilmesi, DNA fragmanlarının oluşturulması ve gerekli genin izolasyonu;

2) izole edilmiş genin plazmide dahil edilmesi yani plazmide bir yabancı DNA fragmanı sokularak rekombinant (melez) DNA elde edilmesi;

3) bağlama- enzim çapraz bağlama ligaz plazmid (vektör) ve yabancı DNA fragmanları; aynı zamanda, vektörün uçları ve yabancı DNA ("yapışkan uçlar" olarak adlandırılanlar) birbirini tamamlayıcı niteliktedir;

4) dönüşüm- rekombinant bir plazmitin başka bir hücrenin (alıcı hücre), özellikle bir bakteri hücresinin genomuna dahil edilmesi.

Plazmitlerin, tedavi edilen bakterilerin yalnızca bir kısmına nüfuz ettiğine dikkat edilmelidir. Dönüştürülmüş bakteriler, plazmitlerle birlikte, belirli bir antibiyotiğe karşı direnç kazanırlar; bu, onların, bir antibiyotik içeren bir ortamda ölen, dönüştürülmemiş bakterilerden ayrılmalarına izin verir. Bir besin ortamına yerleştirilen dönüştürülmüş bakterilerin her biri çoğalır ve binlerce soyundan oluşan bir koloni oluşturur - bir klon.

5) tarama- istenen gene sahip plazmitleri içerenlerin dönüştürülmüş bakterileri arasından seçim.

Transgenik hayvanlar ve bitkiler

Klonlanmış genler, bir memeli yumurtasına veya bitki protoplastlarına (hücre duvarı olmayan izole edilmiş bir hücre) mikroenjekte edilir ve daha sonra, yabancı genlerin hareket ettiği genomda bunlardan hayvanlar veya bitkiler yetiştirilir. Genetik mühendisliği işlemleriyle genomu değiştirilmiş bitki ve hayvanlara ne ad verilir? transgenik organizmalar (transgenik bitkiler ve hayvanlar)çünkü yabancı genler içerir. Alınan transgenik fareler, tavşanlar, domuzlar, koyunlar. Bakterilerin, memelilerin ve insanların genleri genomlarında çalışır. Akraba olmayan türlerin genlerini içeren transgenik bitkiler (mısır, biber, domates, buğday, çavdar, baklagiller, patates vb.) elde edilmiştir. Transgenik bitkiler, herbisitlere, böceklere, olumsuz hava koşullarına vb. karşı dirençlidir. Birçok tarım bitkisinin kalıtımını değiştirme sorunu yavaş yavaş çözülmektedir.

Kromozomların genetik haritası. Gen tedavisi

Genetik bir kromozom haritası, aynı bağlantı grubunda bulunan genlerin karşılıklı düzenlemesinin bir diyagramıdır. Bu tür haritalar, her homolog kromozom çifti için derlenir. Genetik harita, kromozomdaki genlerin sırasını ve aralarındaki mesafeyi (belirli genler arasındaki geçiş yüzdesini) gösterir. Dolayısıyla hormonları, proteinleri, ilaçları sentezleyebilen yeni mikroorganizma türlerinin yaratılması, mikroorganizmaların genetik haritalarının bilgisine dayanmaktadır. İnsan genetik haritaları tıbbi genetik için çok önemlidir. Bir genin belirli bir kromozom üzerindeki lokalizasyonu hakkındaki bilgi, bir dizi kalıtsal hastalığın teşhisinde ve ayrıca genlerin yapısını ve işlevini düzeltmek için gen terapisinde kullanılır.

Gen tedavisi - kusurlu genlerin hasarsız olanlarla değiştirilmesi veya yapılarının düzeltilmesi.

Kalıtsal, onkolojik ve yaşa bağlı hastalıklarla mücadele etmek için insan hücreleri için güvenli olan gen tedavisi yöntemleri geliştirilmektedir. Gen terapi yöntemlerinin kullanılması ile nokta mutasyonların meydana geldiği kusurlu genler, vücutta hasar görmemiş genler ile değiştirilebilmektedir. Günümüzde bilim adamları yöntemler geliştiriyorlar. insan biyogüvenliği: istenen genlerin insan vücudunun hücrelerine sokulması. Bu birçok kalıtsal hastalıktan kurtulacaktır.

Mikrobiyolojik sentez

Genetik mühendisliği yöntemleri, gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır. mikrobiyolojik sentez(Şek. 37 B). Genetik mühendisliği yöntemlerinin yardımıyla mikrobiyologlar, mikrobiyolojik sentezin başarıyla gerçekleştirildiği bakteri suşlarını elde edebildiler. Bunun için plazmit içermeyen gerekli bakteri hücreleri seçilir. DNA molekülleri, istenen özelliğin gelişimini belirleyen belirli bir nükleotit dizisi ile izole edilir. Entegre bir DNA bölgesine (genom) sahip bir plazmit, eklenen DNA bölgesinin çalışmaya başladığı (replikasyon, transkripsiyon, translasyon süreçleri devam etmektedir) ve istenen proteinin bakteri hücresinde sentezlendiği bir bakteri hücresine sokulur. interferon, geneferon, immünoglobulin, insülin, somatotropin vb.). ). Hormonlar (insülin, somatotropin), birçok amino asit, antibiyotik, aşı vb. endüstriyel miktarlarda elde edilmiştir.Bu tür bakteriler endüstriyel ölçekte çoğalarak gerekli proteini üretirler.

Genetik yöntemler kullanılarak, orijinal formdan on kat daha fazla C vitamini, B vitamini üreten Pseudomonas denitrificans mikroorganizmasının bir suşu elde edildi; Micrococcus glutamicus bakterisinin yeni bir türü, lizin oluşturan bakterinin orijinal (vahşi) kültüründen yüzlerce kat daha fazla amino asit lizin salgılar.

Hücre mühendisliği

Hücre mühendisliği- özel yapay ortamlarda tek tek hücrelerin veya dokuların yetiştirilmesi, hibridizasyon yoluyla yeni hücre türleri oluşturmak için yöntemlerin geliştirilmesi, kromozomların değiştirilmesi ve bunlardan hibritlerin yetiştirilmesi.

1. Doku kültürü yöntemi

Yöntem, izole edilmiş hücrelerin veya doku parçalarının uygun mikro iklim koşulları altında yapay bir besin ortamı üzerinde yetiştirilmesinden oluşur. Kültivasyonun bir sonucu olarak, bitki hücreleri veya doku parçaları bütün bir bitki olarak yeniden üretilir. Bireysel hücrelerin veya doku parçalarının (genellikle bir kök veya kökün apikal meristemi) mikro çoğaltımı yoluyla birçok yararlı bitki elde edilebilir. Süs, ekili, tıbbi bitkilerin rejenerasyonu için mikro iklim koşulları ve besin ortamları deneysel olarak seçilir. Doku kültürü, orijinal haploid formların kolşisin ile işlenmesinden sonra diploid bitkiler üretmek için de kullanılır.

2. somatik hibridizasyon

Somatik hibridizasyon, hibrit hücrelerin elde edilmesini ve onlardan yeni formların elde edilmesini içerir; yumurtaların suni tohumlanması.

Çeşitli hücrelerin protoplastlarının (çekirdek ve sitoplazma) doku kültüründe füzyonu ile yeni hibrit bitkiler elde edilmesi. Enzimler yardımıyla protoplastları kaynaştırmak için bitki hücre duvarı yıkılır ve izole bir protoplast elde edilir. Farklı bitki türlerinin bu tür protoplastlarını yetiştirirken, bunlar birleşir ve yeni faydalı özelliklere sahip formlar oluşturur. Yumurtaların suni tohumlanması, bir test tüpünde yumurtaların döllenmesine ve ardından gelişimin erken bir aşamasında bir embriyonun implantasyonuna izin veren ve insanlarda bazı kısırlık biçimlerinin üstesinden gelen in vitro fertilizasyon (IVF) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.

3. kromozom mühendisliği- bitki hücrelerinde bireysel kromozomların değiştirilmesi veya yenilerinin eklenmesi. Diploidler, homolog kromozom çiftlerine sahiptir ve bu tür organizmalara disomik denir. Herhangi bir çiftte bir kromozom bırakılırsa, bir monozomik oluşur. Herhangi bir çifte üçüncü bir homolog kromozom eklenirse, o zaman bir trizomik oluşur vb. Bir türün tek tek kromozomlarını başka bir türün kromozomlarıyla değiştirmek mümkündür. Kabul edilmiş formlara ikame denir.

genetik mühendisliği

Modern biyoloji, geleneksel biyolojiden temel olarak yalnızca bilişsel fikirlerin gelişiminin daha büyük derinliğinde değil, aynı zamanda toplum yaşamıyla, uygulamayla daha yakın bir bağlantıda da farklılık gösterir. Zamanımızda biyolojinin, toplumun maddi ihtiyaçlarını karşılamak için yaşayan dünyayı dönüştürmenin bir aracı haline geldiğini söyleyebiliriz. Bu sonuç, öncelikle, tıbbın yanı sıra insan yapımı mekanik ve kimyasal teknolojilerin eşit ortağı olan, malzeme üretiminin en önemli alanı haline gelen biyoloji ve biyoteknoloji arasındaki yakın ilişki ile gösterilmektedir.

Başlangıcından bu yana biyoloji ve biyoteknoloji hep birlikte gelişmiş ve en başından beri biyoloji, biyoteknolojinin bilimsel temeli olmuştur. Bununla birlikte, uzun bir süre, kendi verilerinin olmaması, biyolojinin biyoteknoloji üzerinde çok büyük bir etkiye sahip olmasına izin vermedi. 20. yüzyılın ikinci yarısındaki yaratılışla durum dramatik bir şekilde değişti. genetik mühendisliği metodolojisi, yeni genotipler oluşturmak ve mevcut genotipleri yeniden yapılandırmak amacıyla genetik manipülasyon olarak anlaşılmaktadır. Doğası gereği metodolojik bir başarı olan genetik mühendisliği, biyolojik fenomenler hakkında hakim olan fikirlerin çökmesine yol açmadı, biyolojinin temel hükümlerini etkilemedi, tıpkı radyo astronomisinin astrofiziğin temel hükümlerini sarsmaması gibi. "Isının mekanik eşdeğeri", ısı iletimi yasalarında bir değişikliğe yol açmadı ve maddenin atomistik teorisinin termodinamik, hidrodinamik ve esneklik teorisi (A.A. Baev) ilişkilerini değiştirmediğinin kanıtı.

Bununla birlikte, genetik mühendisliği, canlı maddenin varoluş biçimlerini daha iyi karakterize etmek, genlerin yapısını ve işlevini daha etkin bir şekilde incelemek için biyolojik fenomenlerin derinliklerine nüfuz etmek için yeni fırsatların ortaya çıkması nedeniyle biyolojide yeni bir çağ açmıştır. moleküler düzeyde ve işin ince mekanizmalarını anlamak, genetik aparat. Genetik mühendisliğindeki gelişmeler, modern bilimde bir devrim anlamına geliyor.

doğal bilim. Canlı maddenin moleküler ve hücresel düzeylerinin yapısal ve işlevsel özellikleri hakkındaki modern fikirlerin değeri için kriterleri belirlerler. Canlılar hakkındaki modern veriler, devasa bilişsel öneme sahiptir, çünkü organik dünyanın en önemli yönlerinden birinin anlaşılmasını sağlarlar ve böylece dünyanın bilimsel bir resminin oluşturulmasına paha biçilmez bir katkı sağlarlar. Böylece, bilişsel tabanını keskin bir şekilde genişleten biyoloji, genetik mühendisliği aracılığıyla biyoteknolojinin yükselişinde de öncü bir etkiye sahipti.

Genetik mühendisliği, yeni organizmaları "tasarlamanın" veya mevcut organizmaları iyileştirmenin yollarını ve araçlarını anlama yolunda temel oluşturur, onlara büyük ekonomik değer ve biyoteknolojik süreçlerin üretkenliğini önemli ölçüde artırma yeteneği verir. Bununla birlikte, genetik mühendisliği, hem kalıtsal hem de kalıtsal olmayan birçok hastalığın tanı ve tedavisi alanında tıp için yeni ufuklar açmıştır. Tıpta kullanılan yeni ilaç ve malzeme arayışında yeni yollar açtı. Genetik mühendisliği ve biyoteknoloji, biyonanoteknoloji yöntemlerinin gelişimini teşvik etmiştir.

Genetik mühendisliği çerçevesinde, genetik Ve hücresel mühendislik. Genetik mühendisliği, rekombinant DNA molekülleri oluşturmak için manipülasyondur. Bu metodoloji genellikle moleküler klonlama, gen klonlama, rekombinant DNA teknolojisi veya basitçe genetik manipülasyon olarak adlandırılır. Genetik mühendisliğinin amacının DNA molekülleri, bireysel genler olduğunu vurgulamak önemlidir. Aksine, hücre mühendisliği, izole edilmiş tek tek hücreler veya bitki ve hayvan hücresi grupları ile yapılan genetik manipülasyonlar olarak anlaşılır.

GEN MÜHENDİSLİĞİ VE ARAÇLARI

Genetik mühendisliği, DNA moleküllerinin ve genlerin belirli amaçlarla inşa edilmesini (yeniden inşa edilmesini), klonlanmasını sağlayan çeşitli deneysel teknikler (yöntemler) kümesidir.

Genetik mühendisliği yöntemleri belirli bir sırayla kullanılır (Şekil 127) ve uygulamada birkaç aşama ayırt edilir

bir geni klonlamayı amaçlayan tipik bir genetik mühendisliği deneyi, yani:

1. İlgili organizmanın hücrelerinden plazmid DNA izolasyonu (başlangıç) ve DNA vektörünün izolasyonu.

2. Orijinal organizmanın DNA'sının, kısıtlama enzimlerinden biri kullanılarak ilgili genleri içeren parçalara kesilmesi (sınırlanması) ve bu genlerin kısıtlama karışımından izolasyonu. Aynı zamanda, vektör DNA'sı kesilir (sınırlanır), onu dairesel bir yapıdan doğrusal bir yapıya dönüştürür.

3. Hibrit DNA molekülleri elde etmek için ilgilenilen DNA segmentinin (gen) vektör DNA'ya bağlanması.

4. Rekombinant DNA moleküllerinin başka bir organizmaya, örneğin E. coli veya somatik hücreler.

5. Hibrit DNA moleküllerinin eklendiği bakterilerin, yalnızca hibrit DNA molekülleri içeren hücrelerin büyümesine izin veren besleyici ortam üzerinde aşılanması.

6. Hibrit DNA molekülleri içeren bakterilerden oluşan kolonilerin tanımlanması.

7. Klonlanmış DNA'nın (klonlanmış genler) izolasyonu ve klonlanmış DNA fragmanındaki azotlu bazların sekanslanması da dahil olmak üzere karakterizasyonu.

Pirinç. 127.Genetik mühendisliği deneyinin ardışık aşamaları

Evrim sürecinde bakteriler, hücresel (bakteriyel) kısıtlama modifikasyon sisteminin bir parçası haline gelen kısıtlama enzimlerini (endonükleazlar) sentezleme yeteneğini geliştirdiler. Bakterilerde kısıtlama-modifikasyon sistemleri, yabancı DNA'ya karşı hücre içi bağışıklık savunma sistemidir. Virüslerin, bakterilerin ve diğer patojenlerin tanınmasının ve yok edilmesinin hücre dışı olarak gerçekleştiği daha yüksek organizmalardan farklı olarak, bakterilerde yabancı DNA'ya (içinde yaşadıkları bitki ve hayvanların DNA'sı) karşı koruma hücre içinde gerçekleşir; yabancı DNA bakteri sitoplazmasına girdiğinde. Bakteriler kendilerini korumak için ayrıca kendi DNA'larını belirli dizilerdeki metilleyici bazlarla "etiketleme" yeteneğini de geliştirdiler. Aynı nedenle, yabancı DNA, aynı diziler üzerinde metil gruplarının bulunmaması nedeniyle, çeşitli bakteriyel restritazlar tarafından eritilir (kesilir) ve daha sonra bakteriyel ekzonükleazlar tarafından nükleotidlere parçalanır. Bakterilerin organizmalarında geçici olarak (patojen olarak) veya kalıcı olarak (saprofit olarak) yaşadıkları bitki ve hayvanların DNA'sından bu şekilde korunduklarını söyleyebiliriz.

Restriksiyon enzimleri ilk olarak izole edilmiştir. E. coli 1968'de. Farklı kısıtlama bölgelerinde (yerlerinde) DNA moleküllerini kesebildikleri (eritebildikleri) ortaya çıktı. Bu enzimlere sınıf I endonükleazlar adı verildi ve daha sonra bakterilerde, özellikle yabancı DNA'daki kısıtlama bölgelerini tanıyan ve bu bölgelerde kısıtlama gerçekleştiren sınıf II endonükleazlar bulundu. Genetik mühendisliğinde kullanılmaya başlayan bu sınıfın enzimleridir. Aynı zamanda, tanıma bölgelerinin yakınında DNA'yı eriten sınıf III enzimler keşfedildi, ancak bu enzimlerin genetik mühendisliğinde hiçbir önemi yok.

Kısıtlama-modifikasyon sisteminin etkisi, DNA kısıtlama bölgeleri olan nitrojenli bazların sözde palindromik (tanıma) dizileri tarafından "rasyonelleştirilir". Palindromik diziler, harflerin dizisi gibi aynı şeyi ileri ve geri okuyan baz dizileridir. radar. DNA iplikçikleri antiparalel bir yöne sahip olduğundan, üstteki 5" uçtan 3" uça ve alt iplikçikteki 3"ten 5"e doğru okunduğunda aynı olan bir dizi palindromik olarak kabul edilir. son, yani:

Palindromlar herhangi bir boyutta olabilir, ancak restriksiyon enzimi tanıma bölgeleri olarak kullanılan palindromların çoğu 4, 5, 6 ve nadiren 8 baz uzunluğundadır.

Kısıtlama enzimleri, büyük DNA moleküllerinden ilgili fragmanları (genleri) kesmek için genetik mühendisliğinde kesinlikle gerekli bir araçtır. 100'den fazla restriksiyon enzimi bilindiğinden, bu, restriksiyon enzimlerinin seçilmesine ve orijinal DNA'dan fragmanların seçici olarak çıkarılmasına izin verir.

Kısıtlayıcıların dikkate değer bir özelliği, moleküllerin çıkıntılarda birkaç DNA parçasına (kısıtlamalarına) bölünmesini sağlamalarıdır, bunun sonucunda bir iplikçik, ortaya çıkan uçlarda diğerinden daha uzun olur ve bir tür kuyruk oluşturur. Bu tür uçlar (kuyruklar), kendi kendini tamamlayabildikleri için "yapışkan" uçlar olarak adlandırılır.

En ünlü kısıtlamalardan birinin örneğinde kısıtlamanın sonuçlarını düşünün. EcoRI kısıtlama değiştirme sisteminden E. coi. Bu enzim, palindromik tanıma dizisinin merkezindeki DNA'yı eritmek yerine, DNA'yı merkezin dışında eritir ve farklı sayıda nükleotitten oluşan 4 kendi kendini tamamlayan ("yapışkan") uç üretir, yani:

Bu "yapışkan" uçlar, genetik mühendisliğinde kullanışlıdır çünkü bunlar, düşük sıcaklıklarda tamamlayıcı olarak yeniden bağlanarak DNA fragmanlarının etkili bir şekilde kapanmasına olanak tanır.

Tanıma siteleri ve diğer kısıtlamalar söz konusu olduğunda eritme siteleri farklı bir içeriğe sahiptir, yani:

DNA kısıtlamasının ardından kısıtlama karışımından kısıtlama DNA fragmanları (DNA-kısıtlamaları) izole edilir ve bunlar daha sonra vektörle birleşmek için gereklidir. Kısıtlı DNA, elektroforez kullanılarak izole edilir, çünkü kısıtlı fragmanların boyutu ve sabit elektrik yükü-kütle oranları nedeniyle kısıtlı DNA'yı bu yöntemle fraksiyonlara ayırmak çok kolaydır. Bir elektrik alanındaki parçalar, elektroforez sırasında boyutlarına (kütlelerine) bağlı bir frekansta hareket eder. Parça ne kadar büyükse (uzunsa), elektrik alanında o kadar yavaş hareket eder. Elektroforezin gerçekleştirildiği malzeme, yüksüz agaroz veya poliakrilamiddir. Ethidium bromür, parçaları tespit etmek için kullanılır, bu da parçaları lekeleyerek daha kolay tespit edilmelerine yol açar.

Elektroforezin etkinliği çok yüksektir, çünkü boyutları 2 ila 50.000 baz arasında değişen parçaları ayırmak için kullanılabilir.

Elektroforezden sonra çeşitli yöntemlerle agarozdan fragmanlar izole edilir. Boyut karşılaştırma sonuçlarına göre

Farklı kısıtlama enzimleri kullanılarak elde edilen aynı DNA'nın kısıtlamaları, kullanılan kısıtlama enzimlerinin her birinin kısıtlama bölgelerini gösteren kısıtlama haritaları oluşturur. Pratik anlamda, kısıtlama haritaları sadece kısıtlamaların boyutunu belirlemeyi değil, aynı zamanda belirli genlerin DNA moleküllerindeki lokuslarının yerini bulmayı da mümkün kılar.

Daha yüksek organizmalarda, transkripsiyon sırasında heterojen DNA sentezlendiğinden, genetik mühendisliğinde işlenerek düzeltildiğinden, genellikle mRNA'yı bir şablon olarak kullanarak elde edilen ve üzerinde ters transkriptazın tek sarmallı DNA'yı sentezlediği tamamlayıcı DNA (cDNA) kullanılır. mRNA'nın bir kopyası olan cDNA). Daha sonra, bu tek sarmallı DNA'lar çift sarmallı DNA'lara dönüştürülür. cDNA'nın sürekli nükleotit dizileri (kopyalanmış ve çevrilmiş) içerdiğini düşünün. Kısıtlama için kullanılan cDNA'dır.

Agaroz jellerden elektroforezden sonra izole edilen DNA fragmanları (kısıtlamalar) ön dizilemeye tabi tutulabilir; nükleotid dizilerini belirler. Bunun için kimyasal ve enzimatik dizileme yöntemleri kullanılır. Kimyasal yöntem, radyoaktif fosfor (32P) ile işaretlenmiş fragmanların elde edilmesi ve bu fragmanlardan bazlardan birinin çıkarılması ve ardından bu fragmanları içeren jellerin otoradyografi sonuçlarının dikkate alınması esasına dayanır. Enzimatik yöntem, analiz edilen fragmanın sonuna bir nükleotidin sokulması ve bunun daha sonra farklı fragmanların sentezinde kullanılması gerçeğine dayanır. laboratuvar ortamında, nükleotit sekansı için elektroforetik olarak analiz edildi. Bir DNA molekülündeki spesifik nükleotit dizilerini incelemek için şunu kullanın:

ayrıca DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Kuzey-

ve Southern lekeleme.

Genetik vektörler. Moleküler klonlama için amaçlanan DNA segmenti (gen), bir bakteri hücresine aktarıldığında, yani bir bakteri hücresine aktarıldığında kendini kopyalayabilmelidir. replika olsun Ancak bu yeteneğe sahip değildir. Bu nedenle hücrelerde klonlanan genlerin transferini ve saptanmasını sağlamak için bunlar sözde genetik vektörler ile birleştirilir. İkincisi en az iki özelliğe sahip olmalıdır. İlk olarak, vektörler çoğalabilmelidir

hücrelerde ve birkaç uçta. İkinci olarak, vektörü içeren hücrelerin seçimine izin vermelidirler, örn. vektörü klonlanmış gen (rekombinant DNA molekülleri) ile birlikte içeren hücreleri karşı seçmenin mümkün olduğu bir işaretleyiciye sahiptir. Plazmitler ve fajlar bu gereksinimleri karşılar. Plazmitler iyi vektörlerdir, çünkü replikonlardır ve herhangi bir antibiyotiğe direnç genleri içerebilirler, bu da bu antibiyotiğe dirençli bakterilerin seçilmesine ve dolayısıyla rekombinant DNA moleküllerinin kolayca saptanmasına olanak tanır.

(Şek. 128).

Pirinç. 128. vektör pBRl

Doğal plazmid vektörleri olmadığı için şimdiye kadar bilinen tüm plazmit vektörleri yapay olarak oluşturulmuştur. R-plazmitleri, birden fazla kısıtlama bölgesine sahip olanlar da dahil olmak üzere aşırı DNA dizilerinin restritazlar yardımıyla çıkarıldığı bir dizi genetik vektörün yaratılması için başlangıç ​​malzemesi olarak görev yaptı. Bu delesyon, plazmid vektörünün bir kısıtlama enzimi için yalnızca bir tanıma bölgesine sahip olması ve bu bölgenin plazmid genomunun işlevsel olarak önemsiz bir bölgesinde yer alması gerektiği gerçeğiyle belirlendi. Örneğin, ampisilin ve tetrasiklin direnç genlerine sahip olan pBR 322 plazmid vektörü, onu çok uygun hale getirir.

klonlanmış DNA segmentini içeren bakterilerin seçimi için Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II ve Sal I gibi iyi bilinen restriksiyon enzimleri dahil 20'den fazla restriksiyon enzimi için tek restriksiyon bölgelerine sahiptir.

Faj vektörlerinin ayrıca bir dizi avantajı vardır. Plazma vektörlerine kıyasla daha büyük (uzun) klonlanmış DNA parçaları içerebilirler. Ayrıca, klonlanmış fragmanın fajlar tarafından hücrelerin içine enfeksiyonun bir sonucu olarak transferi, DNA transformasyonundan daha verimlidir. Son olarak, faj vektörleri, klonlanmış geni taşıyan hücreleri içeren kolonilerin agar yüzeyinde daha verimli taramaya (tanıma) izin verir. Birçok faj vektörü, lambda fajını temel alır.

Fajın yanı sıra, herpes virüsü temelinde oluşturulan diğer viral vektörler ve maya DNA'sı temelinde oluşturulan vektörler de kullanılır.

Gen klonlaması, memeli veya bitki hücreleri kullanılarak gerçekleştirilirse, vektörler için gereksinimler, bakteri hücrelerinde klonlama durumundaki ile aynıdır.

Rekombinant DNA moleküllerinin yapımı. Rekombinant DNA moleküllerinin doğrudan yapısı, incelenen DNA'nın kısıtlanmasından ve vektör DNA'nın elde edilmesinden sonra gelir. İncelenen DNA'nın kısıtlama bölümlerinin, kısıtlama sonucunda dairesel DNA'dan doğrusal DNA'ya dönüşen vektör DNA kısıtlaması ile kapatılmasından oluşur.

İncelenen DNA fragmanlarını vektörün DNA'sı ile kapatmak için DNA ligaz kullanılır (Şekil 129). Birleştirilecek yapılar 3'-hidroksil ve 5'-fosfat gruplarına sahipse ve bu gruplar birbiriyle uygun bir ilişki içindeyse ligasyon başarılı olacaktır. Parçalar, kendi kendini tamamlamanın bir sonucu olarak "yapışkan" uçları aracılığıyla birleştirilir. Yüksek fragman konsantrasyonlarında, ikincisi zaman zaman doğru pozisyonda (birbirinin karşısında) olur. Eco RI gibi birçok kısıtlama, dört tabanlı "yapışkan" uçlar üretir. Dört bazdan oluşan "yapışkan" uçların ligasyonu işlemi, düşük bir sıcaklıkta (12°C'ye kadar) gerçekleşir.

Pirinç. 129. DNA ligasyonu

Kısıtlama sırasında "yapışkan" uçları olmayan fragmanlar oluşursa, transferaz enzimi kullanılarak "zorla" "yapışkan" uçlu moleküllere dönüştürülürler. Bu enzim, DNA'nın 3" ucuna nükleotidler ekler. Bir fragmana bir poly-A kuyruğu, diğerine bir poly-T kuyruğu eklenebilir. İstenen herhangi bir DNA ucunu oluşturmak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) da kullanılır. PCR prensibi, hücrelerden izole edilen DNA'nın denatürasyonuna ve her biri 15-20 nükleotidden oluşan DNA oligonükleotitlerinin renatüre edici zincirlere eklenmesiyle "tavlanmasına" dayanır. Bu oligonükleotidler, mesafelerle ayrılmış zincirlerdeki dizileri tamamlayıcı olmalıdır. 50–2000 nükleotit DNA sentezi laboratuvar ortamında, DNA polimerazın "tohumlar" arasındaki bölgeleri kopyalamasına izin verirler. Bu kopyalama, çalışılan DNA parçasının çok sayıda kopyasını verir.

Rekombinant DNA moleküllerinin hücrelere sokulması. İlgili DNA fragmanı (gen), DNA ligaz kullanılarak bir genetik vektör ile kaynaştırıldıktan sonra, ortaya çıkan rekombinant moleküller, replikasyonlarını sağlamak (genetik vektör nedeniyle) ve kopya sayısını artırmak için hücrelere sokulur. Rekombinant DNA moleküllerini, vektörün bir plazmit olduğu hücrelere sokmanın en popüler yolu transformasyondur. E. coli. Bu amaçla bakteri hücreleri, kalsiyum veya rubidyum (iyonlar) ile ön işleme tabi tutulur.

böylece rekombinant DNA algısında "yetkin" hale gelirler. DNA'nın hücrelere girme sıklığını artırmak için, hücrelerin kısa bir süre yoğun bir elektrik alanına maruz bırakılmasından oluşan elektroporasyon yöntemi kullanılır. Bu tedavi, hücre zarlarında boşluklar oluşturarak hücrelerin DNA'yı almasını kolaylaştırır. Rekombinant DNA moleküllerinin bakterilere dahil edilmesinden sonra, ikincisi, istenen hücreleri seçmek için antibiyotiklerle zenginleştirilmiş MPA'ya (et-pepton agar) ekilir, örn. rekombinant DNA molekülleri içeren hücreler. Dönüşüm sıklığı düşüktür. Tipik olarak, her 105 tohumlanmış hücrede bir transformant meydana gelir. Vektör faj ise hücreler (bakteri veya maya) faj ile transfekte edilir. Hayvan somatik hücrelerine gelince, DNA'nın plazma zarlarından geçişini kolaylaştıran kimyasalların varlığında DNA ile transfekte edilirler. DNA'nın oositlere, kültürlenmiş somatik hücrelere ve memeli embriyolarına doğrudan mikroenjeksiyonu da mümkündür.

Moleküler klonlama ile ilgili en önemli nokta, klonlanan fragmanın gerçekten vektöre dahil olup olmadığını ve vektörle birlikte rekombinant bir DNA molekülü oluşturan hücrelere girip girmediğini tespit etmek için bir yöntem arayışıdır. Bakteri hücrelerinden bahsediyorsak, yöntemlerden biri plazmit (vektör) direnç geninin insersiyonel inaktivasyonunu dikkate almaya dayanır. Örneğin, ampisilin ve tetrasikline direnci belirleyen plazmit vektörü pBR 322'de, Pst I kısıtlama enzimi için tek bölge, ampisilin direnç geni tarafından işgal edilen lokusta bulunur. Bu bölgede eriyen Pst I, klonlanan fragmanın vektör DNA'ya bağlanmasına izin veren yapışkan uçlar üretir. Ancak bu durumda plazmid (vektör) ampisilin direnç geni inaktive edilirken vektör üzerindeki tetrasiklin direnç geni bozulmadan kalır. Rekombinant DNA molekülleri tarafından transforme edilen hücreleri seçmek için kullanılan tetrasiklin direnç genidir. Bu, tetrasiklin içeren ortam üzerinde büyütülen kolonilerin hücrelerinin gerçekten de rekombinant DNA molekülleri içerdiğini doğrulamayı mümkün kılar; bunlar, biri katı ortam içeren bir çift tabak üzerinde sözde "nokta testi" kullanılarak kontrol edilir; ampisilin içerirken diğeri bu antibiyotikten yoksundur. Klonlanacak DNA,

sadece tetrasikline dirençli transformantlarda. Hem ampisiline hem de tetrasikline (ArTc) dirençli transformantlar ise, içlerine yabancı (klonlanmış) DNA katılmadan kendiliğinden dairesel bir form kazanan plazmit (vektör) molekülleri içerirler.

Yabancı (klonlanmış) fragmanların bir plazmit vektöre eklenmesini saptamak için başka bir yöntem, p-galaktosidaz genini içeren bir vektörün kullanımına dayanır. Yabancı DNA'nın bu gene eklenmesi, kaçınılmaz olarak, β-galaktosidaz substratları içeren bir ortam üzerinde transforme hücrelerin tohumlanmasıyla tespit edilebilen β-galaktosidaz sentezini etkisiz hale getirir. Bu besiyeri, lekeli hücre kolonilerinin seçilmesine izin verir. Başka yöntemler de var.

Daha önce belirtildiği gibi, vektör DNA'nın lineer kısıtlama fragmanları, içlerine klonlanmış segmentler dahil etmeden dairesel yapıyı eski haline getirme yeteneğine sahiptir. Bu tür dairesel vektör DNA moleküllerinin kendiliğinden oluşum sıklığını azaltmak için, vektör DNA kısıtlaması fosfataz ile işlenir. Sonuç olarak, ligazın hareketi için gerekli olan 5'-P04'ün uçları olmayacağından dairesel DNA moleküllerinin oluşumu imkansız hale gelir.

Seçici bir ortam üzerinde büyütülen transformant koloniler seti, klonlanmış genomik veya cDNA'nın farklı fragmanlarının (genlerinin) klonlarını içeren bir hücre setidir. Bu klonların koleksiyonları, genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan sözde DNA kitaplıklarını oluşturur.

Gen klonlamanın son aşaması, dizileme dahil olmak üzere klonlanmış DNA'nın izolasyonu ve incelenmesidir. Ticari değere sahip ilgi konusu proteinlerin sentezini kontrol eden rekombinant DNA molekülleri içeren ümit verici bakteri türleri veya somatik hücreler endüstriye aktarılır.

HÜCRE MÜHENDİSLİĞİ

Bölümün başında belirtildiği gibi, hücre mühendisliği, izole edilmiş hayvan ve bitki hücrelerinin genetik manipülasyonunu ifade eder. Bu manipülasyonlar genellikle laboratuvar ortamında, ve asıl amacı, bu organizmaların istenen özelliklere sahip, öncelikle ekonomik açıdan faydalı genotiplerini elde etmektir. Nazaran-

Xia man, o zaman hücre mühendisliği onun germ hücrelerine uygulanabilirdi.

İnsanlarda ve hayvanlarda hücre mühendisliğinin gelişmesi için bir ön koşul, somatik hücrelerini yapay besin ortamlarında yetiştirmek için yöntemlerin geliştirilmesi ve ayrıca türler arası melezler de dahil olmak üzere somatik hücrelerin melezlerinin elde edilmesiydi. Buna karşılık, somatik hücrelerin yetiştirilmesindeki ilerlemeler, insanlarda ve hayvanlarda germ hücreleri ve döllenme çalışmalarını etkilemiştir. 60'lardan beri. 20. yüzyıl Somatik hücre çekirdeklerinin yapay olarak çekirdekten yoksun yumurtalara nakli konusunda dünya çapında çeşitli laboratuvarlarda çok sayıda deney yapılmıştır. Bu deneylerin sonuçları genellikle çelişkiliydi, ancak genel olarak, hücre çekirdeklerinin yumurtanın normal gelişimini sağlama yeteneğinin keşfedilmesine yol açtılar (bkz. Bölüm IV).

60'lı yıllarda döllenmiş yumurtaların gelişimini incelemenin sonuçlarına dayanmaktadır. 20. yüzyıl yumurtaların anne vücudu dışında döllenme olasılığının tespiti için de araştırmalar başlatıldı. Çok hızlı bir şekilde, bu çalışmalar, yumurtaların spermatozoa ile in vitro döllenme olasılığının keşfedilmesine ve bu şekilde oluşan embriyoların bir kadının rahmine implante edildiğinde daha da geliştirilmesine yol açtı. Bu alanda geliştirilen yöntemlerin daha da geliştirilmesi, “tüp” çocukların doğumunun bir gerçeklik haline gelmesine yol açmıştır. Daha 1981 yılına gelindiğinde, hayatı laboratuvarda, tüp bebekte verilen dünyada 12 çocuk dünyaya geldi. Şu anda, hücre mühendisliğinin bu bölümü yaygınlaştı ve "tüp" çocukların sayısı şimdiden on binlerce (Şekil 130). Rusya'da, "tüp" çocukları elde etme çalışmaları yalnızca 1986'da başladı.

1993 yılında, monozigotik insan ikizleri elde etmek için bir teknik geliştirildi. laboratuvar ortamında embriyoları blastomerlere bölerek ve ikincisini 32 hücreye kadar büyüterek, ardından bir kadının rahmine implante edilebilirler.

Hayvanlar, tüp bebeklerin sonuçlarından etkilenerek aynı zamanda bir teknoloji geliştirdiler. nakiller embriyolar. Çocuk felcini tetiklemek için bir yöntemin geliştirilmesi, yumurtaların yapay döllenmesi için yöntemler ve hayvanların vücuduna embriyoların implantasyonu - koruyucu anneler ile ilişkilidir. Bu teknolojinin özü aşağıdaki gibidir:

şımarık. Son derece üretken bir ineğe hormon enjekte edilir ve bu, aynı anda 10-20 hücrenin olgunlaşmasından oluşan poliovülasyonla sonuçlanır. Yumurtalar daha sonra yumurta kanalındaki erkek üreme hücreleri ile yapay olarak döllenir. 7-8. Günde, embriyolar yıkanarak rahimden çıkarılır ve daha sonra ikiz buzağılar doğuran diğer ineklerin (süvey anneler) rahmine nakledilir. Buzağılar, orijinal ebeveynlerinin genetik durumunu miras alır.

Pirinç. 130."Tüp" çocuklar

Hayvanlarda hücre mühendisliğinin bir başka alanı da transgenik hayvanların yaratılmasıdır. Bu tür hayvanları elde etmenin en basit yolu, orijinal hayvanların yumurtalarına doğrusal DNA molekülleri yerleştirmektir. Bu şekilde döllenmiş yumurtalardan gelişen hayvanlar, kromozomlarından birinde tanıtılan genin bir kopyasını taşıyacak ve ayrıca bu geni kalıtım yoluyla aktaracaktır. Tüy renginde farklılık gösteren fareler üzerinde transgenik hayvanları elde etmek için daha karmaşık bir yöntem geliştirilmiştir ve aşağıdaki gibidir. İlk olarak, dört günlük embriyolar hamile bir gri farenin vücudundan çıkarılır ve tek tek hücrelere bölünür. Daha sonra çekirdekler embriyonik hücrelerden çıkarılır, daha önce çekirdeklerden yoksun bırakılmış siyah farelerin yumurtalarına aktarılır. Yabancı çekirdekler içeren siyah fare yumurtaları test tüplerine yerleştirilir.

daha fazla gelişme için besin solüsyonu ile. Siyah farelerin yumurtalarından geliştirilen embriyolar, beyaz farelerin rahmine implante edilir. Böylece, bu deneylerde, gri kaplama rengine sahip bir fare klonu elde etmek mümkün olmuştur, yani; istenen özelliklere sahip embriyonik hücreleri klonlayın. Bölüm IV'te, aynı türden hayvanların somatik hücrelerinin nükleer materyali ile yapay olarak çekirdeksiz koyun yumurtalarının döllenmesinin sonuçlarını inceledik. Özellikle koyun yumurtalarından çekirdek çıkarılarak somatik hücrelerin (embriyonik, meyve veya yetişkin hayvan hücreleri) çekirdekleri bu tür yumurtalara verilir ve ardından bu şekilde döllenen yumurtalar koyunların rahmine verilir. yetişkin koyun Doğan kuzuların koyun donörüyle aynı olduğu ortaya çıktı. Bir örnek koyun Dolly'dir. Klon buzağılar, fareler, tavşanlar, kediler, katırlar ve diğer hayvanlar da elde edilmiştir. Transgenik hayvanların bu şekilde inşası, belirli bir cinsiyetten bireyler de dahil olmak üzere, ekonomik olarak faydalı özelliklere sahip hayvanları klonlamanın doğrudan bir yoludur.

Farklı türlere ait kaynak materyal kullanılarak transgenik hayvanlar da elde edilmiştir. Özellikle, farelerden alınan büyüme hormonunu kontrol eden bir genin fare yumurtalarına aktarılmasına yönelik bir yöntemin yanı sıra koyun blastomerlerini keçi blastomerleriyle birleştirerek hibrit hayvanların (inekler) ortaya çıkmasına neden olan bir yöntem bilinmektedir. Bu deneyler, gelişimin en erken aşamalarında tür uyumsuzluğunun üstesinden gelme olasılığını göstermektedir. Bir türün yumurtalarının başka bir türün somatik hücrelerinin çekirdekleri tarafından döllenmesi yolunda özellikle cazip beklentiler açılır (tür uyumsuzluğu tamamen aşılırsa). Geçilerek elde edilemeyen, ekonomik açıdan değerli hayvan melezleri yaratmanın gerçek olasılığından bahsediyoruz.

Unutulmamalıdır ki nükleer nakil çalışmaları henüz çok etkili değildir. Amfibiler ve memeliler üzerinde yapılan deneyler genel olarak etkinliklerinin düşük olduğunu ve bunun donör çekirdekler ile alıcı oositler arasındaki uyumsuzluğa bağlı olduğunu göstermiştir. Ek olarak, transgenik hayvanların ölümüyle birlikte daha fazla gelişme sırasında nakledilen çekirdeklerde ortaya çıkan kromozomal sapmalar da başarının önünde bir engeldir.

Hücre hibridizasyonu ve immünolojik çalışmalar üzerine çalışmanın kesiştiği noktada, sözde monoklonal antikorların üretimi ve incelenmesi ile ilgili bir sorun ortaya çıktı. Yukarıda belirtildiği gibi, bir antijenin (bakteriler, virüsler, kırmızı kan hücreleri vb.) sokulmasına yanıt olarak vücut tarafından üretilen antikorlar, immünoglobulinler adı verilen proteinlerdir ve vücudun patojenlere karşı savunma sisteminin temel bir parçasını oluştururlar. Ancak vücuda giren herhangi bir yabancı cisim, farklı antikorların üretimini uyaracak farklı antijenlerin bir karışımıdır. Örneğin, insan eritrositleri, yalnızca A (II) ve B (III) kan grupları için değil, aynı zamanda Rh faktörü de dahil olmak üzere birçok başka antijene de sahiptir. Ayrıca, bakteri hücre duvarı proteinleri veya virüslerin kapsidi de farklı antijenler gibi davranarak farklı antikorların oluşumuna neden olabilir. Aynı zamanda, vücudun bağışıklık sisteminin lenfoid hücreleri genellikle klonlarla temsil edilir. Bu, tek başına bu nedenle bile, aşılanmış hayvanların kan serumunda, antikorların her zaman farklı klonların hücreleri tarafından üretilen antikorlardan oluşan bir karışım olduğu anlamına gelir. Bu arada, pratik amaçlar için, yalnızca bir tür antikora ihtiyaç vardır; sadece bir tip antikor içeren veya monoklonal antikorlar olarak adlandırılan monospesifik serumlar.

İsviçreli araştırmacılar, 1975'te monoklonal antikorlar elde etmek için yöntemler ararken, bir veya başka bir antijenle aşılanmış fare lenfositleri ile kültürlenmiş kemik iliği tümör hücreleri arasında bir hibridizasyon yöntemi keşfettiler. Bu tür melezlere "hibridoma" denir. Bir klonun lenfositi ile temsil edilen “lenfositik” kısımdan, tek bir hibridoma, gerekli ve aynı tipte antikorların oluşumuna neden olma yeteneğini miras alır ve “tümör (miyelom)” kısmı sayesinde olur. tüm tümör hücreleri gibi, yapay besleyici ortamlarda süresiz olarak çoğalarak büyük bir melez popülasyonu verir. Şek. Şekil 131, monoklonal antikorları sentezleyen hücre hatlarının izolasyonu için bir şemayı göstermektedir. Monoklonal antikor üreten fare hücre çizgileri, miyelom hücrelerinin beş gün önce aşılanmış farelerin dalağından alınan lenfositlerle kaynaştırılmasıyla izole edilir.

istenen antijen Hücre füzyonu, hücre zarlarının füzyonunu indükleyen polietilen glikol varlığında karıştırılarak ve daha sonra sadece hibrit hücrelerin (hibridoma) büyümesine ve çoğalmasına izin veren bir besin ortamına aşılanmasıyla sağlanır. Hibridomların çoğaltılması, sıvı bir ortamda gerçekleştirilir, burada daha fazla büyürler ve kültür sıvısına antikorlar salgılarlar ve ayrıca sınırsız miktarlarda yalnızca bir tip. Bu antikorlara monoklonal denir. Antikor oluşum sıklığını artırmak için hibridoma klonlamasına başvurulur, yani. istenen tipte en yüksek miktarda antikor üretebilen hibridomaların bireysel kolonilerinin seçimine kadar. Monoklonal antikorlar, bir dizi hastalığın teşhis ve tedavisi için tıpta geniş uygulama alanı bulmuştur. Aynı zamanda monoklonal teknolojinin en önemli avantajı saflaştırılamayan materyallere karşı antikor üretmek için kullanılabilmesidir. Aksine hayvan nöronlarının hücre (plazma) zarlarına karşı monoklonal antikorlar elde etmek mümkündür. Bunu yapmak için, fareler izole edilmiş nöronal zarlarla aşılanır, ardından dalak lenfositleri miyelom hücreleri ile birleştirilir ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi devam edilir.

Pirinç. 131. Monoklonal antikorların elde edilmesi

GEN MÜHENDİSLİĞİ VE TIP

Genetik mühendisliğinin, ilaç olarak kullanılan fizyolojik olarak aktif proteinleri (insülin, somatostatin, interferonlar, somatotropin, vb.) Elde etmek için yeni teknolojilerin yaratılmasında, tıp için çok umut verici olduğu ortaya çıktı.

İnsülin, kalp hastalığı ve kanserden sonra üçüncü en yaygın ölüm nedeni olan diyabet hastalarının tedavisinde kullanılır. Dünyanın insülin talebi birkaç on kilogramdır. Geleneksel olarak domuz ve ineklerin pankreas bezlerinden elde edilir, ancak bu hayvanların hormonları insan insülininden biraz farklıdır. Domuz insülini bir amino asitte farklılık gösterirken, sığır insülini üç amino asitte farklılık gösterir. Hayvan insülininin sıklıkla yan etkilere neden olduğuna inanılmaktadır. İnsülinin kimyasal sentezi uzun süredir gerçekleştirilmesine rağmen, şimdiye kadar hormonların endüstriyel üretimi çok pahalı kalmıştır. Şimdi ucuz insülin, insülin geninin kimyasal-enzimatik sentezi ve ardından bu genin hormonu sentezleyen E. coli'ye dahil edilmesiyle bir genetik mühendisliği yöntemi kullanılarak elde ediliyor. Bu tür insülin, insan pankreasının hücreleri tarafından üretilen insülinle kimyasal olarak aynı olduğu için daha "biyolojik"tir.

İnterferonlar, esas olarak vücudun virüsler tarafından enfeksiyonuna yanıt olarak hücreler tarafından sentezlenen proteinlerdir. İnterferonlar türe özgüdür. Örneğin insanlarda, karşılık gelen genlerin kontrolü altında çeşitli hücreler tarafından üretilen üç grup interferon vardır. İnterferonlara olan ilgi, bunların klinik pratikte başta viral olanlar olmak üzere birçok insan hastalığının tedavisinde yaygın olarak kullanılması gerçeğiyle belirlenir.

Büyük boyutlara sahip olan interferon molekülleri, sentez için neredeyse hiç mevcut değildir. Bu nedenle, interferonların çoğu artık insan kanından elde edilmektedir, ancak bu elde etme yöntemiyle elde edilen verim azdır. Bu arada interferon ihtiyacı son derece fazladır. Bu, endüstriyel miktarlarda interferon üretimi için verimli bir yöntem bulma zorluğunu ortaya çıkardı. Genetik mühendisliği, modern "bakteriyel" interferon üretiminin temelini oluşturur.

Genetik mühendisliğinin, biyolojik teknoloji kullanılarak uzun süredir yaratılan tıbbi maddelerin teknolojisi üzerindeki etkisi artmıştır. 40'lı ve 50'li yıllarda. 20. yüzyıl yaratıldı

modern tıbbın ilaç cephaneliğinin en etkili parçası olan antibiyotiklerin üretimi için biyolojik endüstri. Ancak son yıllarda bakterilerin özellikle antibiyotiklere karşı ilaç direncinde önemli bir artış olmuştur. Bunun nedeni, bakterilerin ilaç direncini belirleyen plazmitlerin mikrobiyal dünyadaki geniş dağılımında yatmaktadır. Bu nedenle, daha önce ünlü olan birçok antibiyotik eski etkinliğini kaybetmiştir. Şimdiye kadar, antibiyotiklere karşı bakteriyel direncin üstesinden gelmenin tek yolu yeni antibiyotikler aramaktır. Uzmanlara göre dünyada her yıl yaklaşık 300 yeni antibiyotik üretiliyor. Bununla birlikte, çoğu etkisiz veya toksiktir. Her yıl sadece birkaç antibiyotik uygulamaya giriyor, bu da antibiyotik endüstrisinin kapasitesinin genetik mühendisliğindeki gelişmeler temelinde sadece sürdürülmesini değil, aynı zamanda arttırılmasını da gerekli kılıyor.

Mikroorganizmaların ilaç üreticileri olduğu tıbbi madde teknolojilerindeki genetik mühendisliğinin ana görevleri, aktivitelerini arttırmak için ikincisinin genetik mühendisliği ile yeniden yapılandırılması ihtiyacı ile belirlenir. Aynı

Aynı zamanda, daha büyük etkinliklerine katkıda bulunan küçük moleküller şeklinde ilaç yaratma fikri de uygulanmaya başlandı.

İmmün biyoteknoloji, öncelikle insan ve hayvanlarda bulaşıcı hastalıkların önlenmesi için yeni nesil aşıların üretilmesi ile ilişkilidir. Genetik mühendisliğinin yardımıyla oluşturulan ilk ticari ürünler, insan hepatitine, hayvan şap hastalığına ve diğerlerine karşı aşılardı. Bu alandaki son derece önemli bir yön, monoklonal antikorların, patojenlerin teşhisi için gerekli reaktiflerin yanı sıra hormonların, vitaminlerin, çeşitli yapıdaki proteinlerin (enzimler, toksinler, vb.) Saflaştırılması ile ilişkilidir.

Pratik açıdan oldukça ilgi çekici olan, hemoglobin genlerini tütün bitkilerine sokarak yapay hemoglobin elde etme yöntemidir; burada a- ve β-globin zincirleri, hemoglobine birleştirilen bu genlerin kontrolü altında üretilir. Tütün bitkilerinin hücrelerinde sentezlenen hemoglobin tamamen işlevseldir (oksijeni bağlar). İnsanlara uygulanan hücre mühendisliği, yalnızca insan biyolojisinin temel sorunlarının çözümüyle değil, aynı zamanda her şeyden önce kadın kısırlığının üstesinden gelmekle de ilişkilidir. Elde edilen embriyoların kadınların rahmine implantasyon pozitif vakalarının sıklığı nedeniyle laboratuvar ortamında, küçüktür, o zaman monozigotik ikiz embriyolar elde edilir laboratuvar ortamında"rezerv" embriyolar nedeniyle yeniden implantasyon olasılığı arttığı için de önemlidir. Diyabet, omurilik yaralanması, kalp ağrısı, osteoartrit ve Parkinson hastalığı gibi hastalıkların tedavisinde hücre ve doku değişimi kaynağı olarak kök hücrelerin kullanılmasına yönelik beklentiler özellikle ilgi çekicidir. Ancak bu umutları gerçekleştirmek için kök hücrelerin biyolojisinin derinlemesine incelenmesi gerekiyor.

Genetik mühendisliğinin tıp problemleriyle ilgili olarak kullanılmasında, ne yazık ki mevcut yöntemlerle henüz tedavi edilemeyen kalıtsal hastalıkların radikal tedavisi için genetik mühendisliği yöntemlerinin geliştirilmesi görevi özel bir önem kazanmıştır. Bu görevin içeriği, kalıtsal hastalıklara neden olan mutasyonları düzeltme (normalleştirme) yolları geliştirmek ve kalıtım yoluyla "düzeltmelerin" aktarılmasını sağlamaktır. Kalıtsal hastalıkların tedavisi için genetiği değiştirilmiş yöntemlerin başarılı bir şekilde geliştirilmesinin,

uluslararası bilimsel program "İnsan Genomu"nun uygulanması sonucunda elde edilen insan genomu hakkındaki verilere katkıda bulunmak.

GEN MÜHENDİSLİĞİNİN ÇEVRE SORUNLARI

Biyoteknolojiyi yeni bir düzeye çıkaran genetik mühendisliği, çevre kirliliğinin belirlenmesi ve ortadan kaldırılması için yöntemlerin geliştirilmesinde de uygulama alanı bulmuştur. Özellikle, kimyasal kirleticilerin mutajenik aktivitesinin bir tür göstergesi olan bakteri türleri oluşturulmuştur. Öte yandan, plazmit içeren bakteri suşları, çevreyi kirleten birçok kimyasal bileşiği yok edebilen enzimlerin sentezini kontrol etmek için genetik olarak tasarlanmıştır. Özellikle plazmit içeren bazı bakteriler, çeşitli kazalar veya diğer olumsuz sebepler sonucu çevreye girmiş olan petrol ve petrol ürünlerini zararsız bileşiklere ayrıştırma yeteneğine sahiptir.

Oysa genetik mühendisliği, doğada bulunmayan genetik materyalin dönüştürülmesidir. Sonuç olarak, genetik mühendisliği ürünleri doğada var olmayan kesinlikle yeni ürünlerdir. Bu nedenle, ürünlerinin bilinmeyen doğası nedeniyle hem kendisi hem doğa ve çevre için hem de genetik mühendisliği yöntemlerini kullanan veya genetik mühendisliği çalışmaları sırasında oluşturulan yapılarla çalışan laboratuvarlarda çalışan personel için tehlike oluşturmaktadır.

Gen klonlama olasılıkları sonsuz olduğundan, bu çalışmaların en başında bile bilim adamları arasında yaratılan organizmaların doğası hakkında sorular ortaya çıktı. Aynı zamanda, bu metodolojinin bir takım istenmeyen sonuçları hakkında önerilerde bulunuldu ve bu öneriler kamuoyunda da destek buldu. Özellikle genetik mühendisliği deneylerinde hayvan genlerini alan bakterilerin özellikleri konusunda fikir ayrılıkları ortaya çıktı. Örneğin, bakteriler tutar mı? E. coliİçlerine sokulan hayvan genlerinin (örneğin insülin geni) içeriğine bağlı olarak türlerine bağlılıkları mı yoksa yeni bir tür olarak mı kabul edilmeleri gerekiyor? Ayrıca, bu tür bakterilerin ne kadar dayanıklı olduğu, hangi ekolojik nişlerde yaşayabilecekleri

var olmak? Ancak en önemlisi, rekombinant DNA moleküllerinin üretimi ve manipülasyonu sırasında, tarihsel olarak kurulmuş ekolojik denge için insan sağlığı için öngörülemeyen ve tehlikeli özelliklere sahip genetik yapıların yaratılabileceğine dair korkuların ortaya çıkmasıydı. Aynı zamanda, genetik mühendisliği konusunda bir moratoryum için çağrılar başladı. Bu çağrılar uluslararası bir tepkiye neden oldu ve 1975'te ABD'de düzenlenen ve bu alandaki araştırmaların olası sonuçlarının geniş çapta tartışıldığı uluslararası bir konferansa yol açtı. Daha sonra genetik mühendisliğinin gelişmeye başladığı ülkelerde rekombinant DNA molekülleri ile çalışmak için kurallar geliştirildi. Bu kurallar, genetik mühendisliği laboratuvarlarının faaliyetlerinden elde edilen ürünlerin habitata girmesini önlemeyi amaçlamaktadır.

Genetik mühendisliği çalışmalarının istenmeyen sonuçlarının bir diğer yönü de genetik mühendisliği yöntemlerinin kullanıldığı laboratuvarlarda sağlık açısından zararlı faktörler olan fenol, etidyum bromür, UV radyasyonu kullanıldığı için çalışan personelin sağlık tehlikesi ile ilgilidir. Ayrıca bu laboratuvarlarda bakterilerin ilaç direnci gibi istenmeyen özelliklerini kontrol eden rekombinant DNA molekülleri içeren bakterilerle kontaminasyon olasılığı da bulunmaktadır. Bu ve diğer noktalar, genetik mühendisliği çalışmalarında güvenlik seviyesinin iyileştirilmesi ihtiyacını belirler.

Son olarak, genetiği değiştirilmiş ürünlerin (genetiği değiştirilmiş domates, patates, mısır, soya fasulyesi) yanı sıra ekmek, makarnalar, tatlılar, dondurma, peynir, bitkisel yağ, et ürünleri gibi ürünlerin tehlike sorunları geniş çapta tartışılmaktadır. toplum ülkeleri başta Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere yaygınlaşmıştır. 12.000 yıldır tarımda insanlar doğal ürünler kullanıyor. Dolayısıyla genetiği değiştirilmiş gıdalar ile yeni toksinlerin, alerjenlerin, bakterilerin, kanserojenlerin insan vücuduna gireceği ve bunun da gelecek nesillerin tamamen yeni hastalıklarına yol açacağı varsayılmaktadır. Bu, genetiği değiştirilmiş gıdanın gerçekten bilimsel bir değerlendirmesi sorununu gündeme getiriyor.

TARTIŞMA KONULARI

1. Genetik, hücresel ve genetik mühendisliği ile kastedilen nedir? Bu kavramlar ile moleküler klonlama arasında bir fark var mı?

2. Biyolojide kullanılan diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında genetik mühendisliğinin ilerici doğası nedir?

3. Genetik mühendisliğinin ana "araçlarını" listeleyin.

4. Kısıtlama enzimleri nedir, özellikleri ve genetik mühendisliğindeki rolleri nelerdir?

5. Tüm restritazlar çalışılan DNA'nın "yapışkan" uçlarını oluşturuyor mu ve "yapışkan" uçların yapısı restritazın tipine bağlı mı?

6. Genetik vektörleri tanımlar. Doğal vektörler var mı?

7. Laboratuarda genetik vektörler nasıl elde edilir? Vektörleri elde etmek için kaynak materyal hangi biyolojik nesnelerdir?

8. Bir genetik vektöre dahil edilebilecek maksimum DNA azotlu baz dizileri uzunluğu nedir? Vektörler "güç" bakımından farklılık gösterir mi?

9. DNA ligazın özelliklerini tanımlar ve genetik mühendisliğindeki rolünü belirler.

10. Klonlanmış bir DNA parçası (gen) bir genetik vektöre nasıl bağlanır?

11. Rekombinant DNA moleküllerinin bakteri hücrelerine verilme sıklığı nedir?

12. Rekombinant DNA molekülleri içeren bakteri hücrelerinin seçimi hangi prensibe dayanmaktadır? Böyle bir seçime bir örnek veriniz.

14. Birçok bakteri türü, neredeyse aynı metabolizmayı sağlayan aynı enzimlere sahiptir. Bu arada, bakteriyel kısıtlama-modifikasyon sistemlerinin nükleotid özgüllüğü farklıdır. Bu fenomeni açıklayabilir misiniz?

15. Kısıtlama enzimi tanıma alanlarını temsil eden DNA dizileri neden sekizden fazla baz çifti içeremez?

16. Hae III restriksiyon enzimi tarafından tanınan HHCC dizisi, yüzde 30, 50 ve 70 HC içeriğine sahip 50.000 bp'lik bir DNA segmentinde kaç kez ortaya çıkacak?

17. Kısıtlama enzimleri Bam HI ve Bgl I sırasıyla G GATCC ve T GATCA dizilerini eritir. Bgl I kısıtlaması ile üretilen DNA fragmanları Bam HI sitesine dahil edilebilir mi? Evet ise, neden? Kullanılan plazmid (vektör) bir Bgl I kısıtlama bölgesi içeriyorsa, bu durumda hangi besi ortamında bakteri seçilebilir, bu plazmit?

18. 5000 plazmid baz çifti başına 5-10 5 transformant oluşuyorsa, DNA molekülü başına bakteriyel transformasyon sıklığını hesaplayın?

19. DNA replikasyonunun 0 noktasını klonlamak mümkün mü? E. coli ve eğer öyleyse, nasıl?

20. Bir hücreyi dönüştürmek için kaç DNA molekülüne ihtiyaç duyulduğunu belirlemek mümkün müdür? E. coli?

21. Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak mRNA'daki ekleme bölgesini belirlemek mümkün müdür?

22. Polimeraz zincir reaksiyonu, klonlanacak DNA fragmanındaki ilgili bölgeye istenen kısıtlama bölgesini sokmak için nasıl kullanılabilir?

23. Hayvanlara uygulanan hücre mühendisliği yöntemlerini adlandırır. Bu yöntemlerle üretilen hayvanların ekonomik değeri nedir?

24. "Transgenik bitkiler" ve "transgenik hayvanlar" terimlerini tanımlayın. Transgenik organizmalar türlerini koruyorlar mı yoksa yeni türlerin organizmaları olarak kabul edilebilirler mi?

25. Hibridomalar ve monoklonal antikorlar nelerdir? Nasıl karşılanırlar?

26. Hücre mühendisliği insanlara uygulanabilir mi?

27. Bir fare yumurtasına yabancı DNA enjekte edildiğini ve bu şekilde döllenen yumurtanın bir farenin vücuduna implante edildiğini ve farenin hamileliği ile sonuçlandığını ve genomunda enjekte edilen DNA'nın kopyalarını içeren farelerin doğduğunu varsayalım. Ancak farelerin mozaik olduğu ortaya çıktı; hücrelerinden bazıları enjekte edilen DNA'nın kopyalarını içerirken, diğerleri bu DNA'dan yoksundur. Bu fenomenin doğasını açıklayabilir misiniz?

28. Genetiği değiştirilmiş gıdalardan hazırlanan gıdaların genetiği açısından tehlikeli olduğunu düşünüyor musunuz?

29. Genetiği değiştirilmiş gıdaların bilimsel incelemesi gerekli midir?

Biliş, Hakikat olarak onayladığımız şey tarafından belirlenir.

PA Florensky, 1923

GENEL MÜHENDİSLİK, herhangi bir organizmanın genetik bilgisinin yönlendirilmiş kombinasyonunun gerçekleştirildiği bir dizi biyokimya ve moleküler genetik yöntemidir. Genetik mühendisliği, taksonomik olarak uzak organizma türleri arasında genetik bilgi alışverişini önleyen doğal türler arası engellerin üstesinden gelmeyi ve belirli kalıtsal özelliklerle doğada var olmayan gen kombinasyonları ile hücreler ve organizmalar yaratmayı mümkün kılar. Genetik mühendisliği etkisinin ana amacı, genetik bilginin taşıyıcısıdır - molekülü genellikle iki zincirden oluşan deoksiribonükleik asit (DNA). Pürin ve pirimidin bazlarının eşleşmesinin katı özgüllüğü, tamamlayıcılık özelliğini belirler - iki zincirdeki nükleotidlerin karşılıklı yazışması. Her tür organizmada DNA moleküllerinin yapısının temel benzerliği nedeniyle yeni gen kombinasyonlarının oluşturulması mümkün oldu ve genetik kodun gerçek evrenselliği, yabancı genlerin ifadesini (fonksiyonel aktivitelerinin tezahürü) sağlar. ) herhangi bir hücre türünde. Bu aynı zamanda nükleik asit kimyası alanındaki bilgi birikimi, genlerin organizasyonunun ve işleyişinin moleküler özelliklerinin tanımlanması (ekspresyonlarını düzenleyen mekanizmaların oluşturulması ve genlerin eylemine tabi kılınması olasılığı dahil) ile kolaylaştırılmıştır. yabancı” düzenleyici elementler), DNA dizileme yöntemlerinin geliştirilmesi, herhangi bir DNA parçasının hızla sentezlenmesine izin veren polimeraz zincir reaksiyonunun keşfi. Genetik mühendisliğinin ortaya çıkması için önemli önkoşullar şunlardı: otonom replikasyon yapabilen ve bir bakteri hücresinden diğerine geçiş yapabilen plazmitlerin keşfi ve transdüksiyon olgusu - bazı genlerin bakteriyofajlar tarafından aktarılması, bu da konseptin formüle edilmesini mümkün kıldı. vektör kümesi: gen taşıyıcı moleküller. Genetik mühendisliği metodolojisinin geliştirilmesinde büyük önem taşıyan enzimler, nükleik asitlerin dönüşümünde yer alan enzimlerdi: kısıtlama enzimleri (DNA moleküllerinde - sitelerde - kesin olarak tanımlanmış dizileri tanır ve bu yerlerde çift zinciri "keser"), DNA ligazları (kovalent olarak bağlanır) bireysel DNA fragmanları), ters transkriptaz (bir RNA şablonu üzerinde DNA'nın veya cDNA'nın tamamlayıcı bir kopyasını sentezler), vb. Enzimler, bireysel DNA fragmanlarını (genleri) elde etmek ve plazmitlerin ve virüslerin DNA'sına dayanan moleküler hibritleri - rekombinant DNA'yı (recDNA) oluşturmak için kullanılır. Sonuncusu, istenen geni konakçı hücreye ileterek çoğalmasını (klonlanmasını) ve orada nihai gen ürününün oluşumunu (ifadesini) sağlar.

Rekombinant DNA molekülleri oluşturma ilkeleri."Genetik mühendisliği" terimi, P. Berg ve iş arkadaşlarının ilk kez 1972'de, içinde bir Escherichia coli bakterisinin DNA parçalarının, virüsünün (bakteriyofaj λ) ve maymun virüsünün DNA'sının bulunduğu bir melez olan rekombinant DNA'yı elde etmesinden sonra yaygınlaştı. SV40 bağlandı (Şekil 1). 1973'te S. Cohen ve arkadaşları, pSC101 plazmitini ve onu kısa tamamlayıcı tek iplikli "kuyruklar" (genellikle 4-6 nükleotit) oluşturacak şekilde tek bir yerde kıran bir kısıtlama enzimi (EcoRI) kullandılar. çift ​​sarmallı bir DNA molekülünün uçları. Birbirleriyle çiftleşebildikleri (bir şekilde birbirine yapışabildikleri) için "yapışkan" olarak adlandırıldılar. Bu tür DNA, aynı kısıtlama enzimi ile muamele edilmiş ve aynı yapışkan uçlara sahip olan yabancı DNA fragmanları ile karıştırıldığında, her biri plazmitin EcoRI sahasına yerleştirilmiş en az bir yabancı DNA fragmanı içeren yeni hibrit plazmitler elde edildi (Şekil 2). Hem mikroorganizmalardan hem de daha yüksek ökaryotlardan elde edilen çeşitli yabancı DNA parçalarının bu tür plazmitlere eklenebileceği açık hale geldi.

recDNA elde etmek için ana mevcut strateji aşağıdaki gibidir:

1) Araştırmacının ilgilendiği belirli genleri veya yapay olarak elde edilmiş nükleotid dizilerini içeren başka bir organizmaya ait DNA fragmanlarının, kromozomdan bağımsız olarak çoğalabilen bir plazmit veya virüsün DNA'sına sokulması;

2) elde edilen hibrit moleküller, hassas prokaryotik veya ökaryotik hücrelere dahil edilir ve burada, içlerine gömülü DNA parçalarıyla birlikte çoğalırlar (çoğalırlar, çoğalırlar);

3) istenen recDNA molekülü türlerini içeren özel besleyici ortamlar (veya temizleme bölgeleri şeklindeki virüsler - bakteri hücrelerinin veya hayvan doku kültürlerinin sürekli büyüme tabakası üzerindeki plaklar) üzerindeki koloniler şeklinde hücre klonlarını seçin ve bunları tabi tutun kapsamlı bir yapısal ve işlevsel çalışma. RecDNA'nın mevcut olduğu hücrelerin seçimini kolaylaştırmak için bir veya daha fazla markör içeren vektörler kullanılır. Örneğin plazmitlerde, antibiyotik direnç genleri bu tür belirteçler olarak işlev görebilir (recDNA içeren hücrelerin seçimi, bir veya başka bir antibiyotiğin varlığında büyüme yeteneklerine göre gerçekleştirilir). İstenen genleri taşıyan RecDNA'lar seçilir ve alıcı hücrelere verilir. Bu andan itibaren, moleküler klonlama başlar - recDNA'nın kopyaları ve sonuç olarak bileşimindeki hedef genlerin kopyaları elde edilir. Yalnızca tüm transfekte edilmiş veya enfekte olmuş hücreleri ayırmak mümkünse, her klon ayrı bir hücre kolonisi tarafından temsil edilecek ve belirli bir recDNA içerecektir. Son aşamada, istenen geni içeren klonların tanımlanması (aranması) gerçekleştirilir. RecDNA'ya eklemenin, onu içeren hücrenin bazı benzersiz özelliklerini (örneğin, eklenen genin ekspresyon ürünü) belirlediği gerçeğine dayanır. Moleküler klonlama deneylerinde 2 temel prensip gözetilir: recDNA klonlamasının yapıldığı hücrelerin hiçbiri birden fazla plazmid molekülü veya viral partikül almamalı; ikincisi çoğalabilmelidir.

Genetik mühendisliğinde çok çeşitli plazmid ve viral DNA vektör molekülleri olarak kullanılır. En popüler klonlama vektörleri, birkaç genetik işaret içerir ve farklı kısıtlamalar için bir etki alanına sahiptir. Bu tür gereksinimler, örneğin, en iyi şekilde, recDNA ile çalışırken kullanılan yöntemler kullanılarak doğal olarak oluşan orijinal plazmitten oluşturulan plazmit pBR322 tarafından karşılanır; ampisilin ve tetrasikline direnç genlerinin yanı sıra 19 farklı restritaz için bir tanıma bölgesi içerir. Klonlama vektörlerinin özel bir durumu, amplifikasyonla birlikte yabancı genlerin alıcı hücrelerde doğru ve verimli ekspresyonunu sağlayan ekspresyon vektörleridir. Bazı durumlarda moleküler vektörler, yabancı DNA'nın bir hücre veya virüsün genomuna entegrasyonunu sağlayabilir (bunlara bütünleyici vektörler denir).

Genetik mühendisliğinin en önemli görevlerinden biri, klonlanan genlerin etkin ifadesini sağlayacak bakteri veya maya suşlarının, hayvan veya bitki dokularının hücre dizilerinin yanı sıra transgenik bitki ve hayvanların (bakınız Transgenik organizmalar) yaratılmasıdır. onlara. Genler çok kopyalı vektörlerde klonlanırsa yüksek düzeyde protein üretimi elde edilir, çünkü bu durumda hedef gen, hücrede çok sayıda bulunacaktır. DNA kodlama dizisinin, hücrenin RNA polimerazı tarafından etkili bir şekilde tanınan bir promotörün kontrolü altında olması ve elde edilen mRNA'nın nispeten kararlı ve verimli bir şekilde çevrilmesi önemlidir. Ayrıca, alıcı hücrelerde sentezlenen yabancı bir protein, hücre içi proteazlar tarafından hızlı bozunmaya tabi tutulmamalıdır. Transgenik hayvanlar ve bitkiler oluşturulurken, eklenen hedef genlerin dokuya özgü ifadesi sıklıkla elde edilir.

Genetik kod evrensel olduğu için, gen ifadesinin olasılığı yalnızca, konakçı hücre tarafından doğru bir şekilde tanınan transkripsiyon ve translasyonun başlatılması ve sonlandırılması için bileşimindeki sinyallerin varlığı ile belirlenir. Daha yüksek ökaryotların genlerinin çoğu, süreksiz bir ekson-intron yapısına sahip olduğundan, bu tür genlerin transkripsiyonunun bir sonucu olarak, sonraki ekleme sırasında kodlamayan dizilerin bulunduğu bir haberci RNA öncüsü (pre-mRNA) oluşur - intronlar parçalanır ve olgun mRNA oluşur. Bu tür genler, bir ekleme sistemi olmayan bakteri hücrelerinde ifade edilemez. Bu engeli aşmak için, ters transkriptaz kullanılarak olgun mRNA molekülleri üzerinde bir DNA kopyası (cDNA) sentezlenir ve buna DNA polimeraz kullanılarak ikinci bir iplikçik tamamlanır. Genlerin (artık intronlarla ayrılmayan) kodlama sekansına karşılık gelen bu tür DNA fragmanları, uygun bir moleküler vektöre yerleştirilebilir.

Hedef polipeptitin amino asit dizisini bilmek, onu kodlayan nükleotit dizisini sentezlemek, sözde eşdeğer geni elde etmek ve onu uygun ifade vektörüne eklemek mümkündür. Eşdeğer bir gen oluştururken, genellikle genetik kodun dejenere olma özelliği (20 amino asit 61 kodon tarafından kodlanır) ve bu genin planlandığı hücrelerde her bir amino asit için kodonların oluşma sıklığı dikkate alınır. tanıtılacak, çünkü kodonların bileşimi farklı organizmalarda önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Uygun şekilde seçilen kodonlar, alıcı hücrede hedef proteinin üretimini önemli ölçüde artırabilir.

Genetik mühendisliğinin değeri. Yabancı DNA'yı çeşitli hücre türlerine sokmak ve işlevlerini incelemek mümkün hale geldiğinden, genetik mühendisliği moleküler biyolojinin deneysel sınırlarını büyük ölçüde genişletti. Bu, çeşitli organizmalarda genel biyolojik organizasyon modellerini ve genetik bilginin ifadesini ortaya çıkarmayı mümkün kıldı. Bu yaklaşım, biyolojik olarak aktif maddelerin temelde yeni mikrobiyolojik üreticilerinin yanı sıra işlevsel olarak aktif yabancı genler taşıyan hayvanlar ve bitkilerin yaratılması için umutlar açtı. İnterferonlar, interlökinler, peptit hormonları ve kan faktörleri dahil olmak üzere daha önce erişilemeyen biyolojik olarak aktif birçok insan proteini, bakteri, maya veya memeli hücrelerinde büyük miktarlarda üretilmeye başlandı ve tıpta yaygın olarak kullanılıyor. Dahası, iki veya daha fazla doğal proteinin özelliklerine sahip olan kimerik polipeptitleri kodlayan genleri yapay olarak yaratmak mümkün hale geldi. Bütün bunlar, biyoteknolojinin gelişimine güçlü bir ivme kazandırdı.

Genetik mühendisliğinin ana hedefleri bakteri Escherichia coli (Escherichia coli) ve Bacilltis subtilis (saman basili), fırıncı mayası Saccharomices cerevisiae, çeşitli memeli hücre dizileridir. Genetik mühendisliği etkisine sahip nesnelerin aralığı sürekli genişlemektedir. Transgenik bitki ve hayvanların yaratılmasına ilişkin araştırma yönleri yoğun bir şekilde geliştirilmektedir. Çeşitli enfeksiyöz ajanlara karşı en yeni nesil aşılar, genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak oluşturulur (bunlardan ilki, insan hepatit B virüsünün yüzey proteinini üreten maya temelinde oluşturulmuştur). Memeli virüslerine dayalı klonlama vektörlerinin geliştirilmesine ve bunların, kanserli tümörlerin ve kalıtsal hastalıkların gen tedavisi için moleküler vektörlerin yanı sıra veterinerlik tıbbı ve tıbbının ihtiyaçları için canlı polivalan aşıların oluşturulmasında kullanılmasına büyük önem verilmektedir. RecDNA'nın insan ve hayvan organizmalarına doğrudan sokulması için, hücrelerinde çeşitli enfeksiyöz ajanların antijenlerinin üretimini yöneten bir yöntem geliştirilmiştir (DNA aşılaması). Genetik mühendisliğindeki son trend, enfeksiyöz ajanların immünojenik proteinlerini üreten domates, havuç, patates, mısır, marul vb. gibi transgenik bitkilere dayalı yenilebilir aşıların oluşturulmasıdır.

Genetik mühendisliği deneylerinin yürütülmesiyle ilgili korkular. RecDNA'yı elde etmeye yönelik ilk başarılı deneylerden kısa bir süre sonra, P. Berg liderliğindeki bir grup bilim adamı, bir dizi genetik mühendisliği deneyinin sınırlandırılmasını önerdi. Bu korkular, yabancı genetik bilgi içeren organizmaların özelliklerinin tahmin edilmesinin zor olduğu gerçeğine dayanıyordu. İstenmeyen belirtiler alabilir, ekolojik dengeyi bozabilir, insanlarda, hayvanlarda ve bitkilerde olağandışı hastalıkların ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açabilirler. Ayrıca, canlı organizmaların genetik aparatına insan müdahalesinin ahlak dışı olduğu ve istenmeyen sosyal ve etik sonuçlara yol açabileceği kaydedildi. 1975 yılında Asilomar'da (ABD) düzenlenen uluslararası bir konferansta bu sorunlar tartışıldı. Katılımcıları, genetik mühendisliği yöntemlerini kullanmaya devam etmenin gerekli olduğu, ancak belirli kural ve tavsiyelere zorunlu olarak uyulması gerektiği sonucuna vardılar. Daha sonra, birkaç ülkede oluşturulan bu kurallar önemli ölçüde gevşetildi ve mikrobiyolojik araştırmalarda yaygın olan yöntemlere, biyolojik ajanların çevrede yayılmasını önleyen özel koruyucu cihazların oluşturulmasına, güvenli vektörlerin ve alıcı hücrelerin kullanımına indirgendi. doğal koşullarda çoğalmayan.

Genellikle genetik mühendisliği sadece recDNA ile çalışmak olarak anlaşılır ve “moleküler klonlama”, “DNA klonlama”, “gen klonlama” terimleri genetik mühendisliği ile eşanlamlı olarak kullanılır. Ancak tüm bu kavramlar, yalnızca bireysel genetik mühendisliği işlemlerinin içeriğini yansıtır ve bu nedenle "genetik mühendisliği" terimiyle eşdeğer değildir. Rusya'da "genetik mühendisliği" terimi, genetik mühendisliği ile eşanlamlı olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu terimlerin anlamsal içeriği farklıdır: Genetik mühendisliği, yeni bir genetik programa sahip organizmalar yaratmayı amaçlarken, "genetik mühendisliği" terimi bunun genleri manipüle ederek nasıl yapıldığını açıklar.

Kaynak: Shchelkunov S. N. Genlerin klonlanması. Novosib., 1986; o. genetik mühendisliği. 2. baskı, Novosib., 2004; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinant DNA. M., 1986; DNA klonlaması Yöntemler. M., 1988; DNA klonlamada yenilikler: Yöntemler. M., 1989.

Ekonomik önem

Genetik mühendisliği, değiştirilmiş veya genetiği değiştirilmiş bir organizmanın istenen niteliklerini elde etmeye hizmet eder. Genotipin yalnızca dolaylı olarak değiştirildiği geleneksel üremenin aksine, genetik mühendisliği, moleküler klonlama tekniğini kullanarak genetik aparata doğrudan müdahale etmenizi sağlar. Genetik mühendisliği uygulamalarının örnekleri, genetiği değiştirilmiş yeni mahsul çeşitlerinin üretimi, genetiği değiştirilmiş bakteriler kullanılarak insan insülini üretimi, hücre kültüründe eritropoietin üretimi veya bilimsel araştırma için yeni deneysel fare türleridir.

Mikrobiyolojik, biyosentetik endüstrisinin temeli bakteri hücresidir. Endüstriyel üretim için gerekli hücreler, belirli kriterlere göre seçilir; bunların en önemlisi, belirli bir bileşiği - bir amino asit veya bir antibiyotik, bir steroid hormon veya bir organik asit - mümkün olan en yüksek miktarlarda üretme, sentezleme yeteneğidir. . Bazen, örneğin yağı veya atık suyu "yiyecek" olarak kullanabilen ve bunları biyokütleye veya hatta yem katkı maddeleri için oldukça uygun proteine ​​​​işleyebilen bir mikroorganizmaya sahip olmak gerekir. Bazen yüksek sıcaklıklarda veya diğer mikroorganizma türleri için tartışmasız öldürücü olan maddelerin varlığında büyüyebilen organizmalara ihtiyaç duyulur.

Bu tür endüstriyel suşları elde etme görevi, modifikasyonları ve seçimleri için çok önemlidir, güçlü zehirlerle tedaviden radyoaktif ışınlamaya kadar hücre üzerinde çok sayıda aktif etki yöntemi geliştirilmiştir. Bu tekniklerin amacı aynıdır - hücrenin kalıtsal, genetik aparatında bir değişiklik elde etmek. Sonuçları, yüzlerce ve binlerce bilim insanının belirli bir amaca en uygun olanı seçmeye çalıştığı çok sayıda mutant mikrop üretimidir. Kimyasal veya radyasyon mutajenezi için tekniklerin yaratılması, biyolojide olağanüstü bir başarıydı ve modern bilimde yaygın olarak kullanılıyor. biyoteknoloji.

Ancak yetenekleri, mikroorganizmaların doğası gereği sınırlıdır. Başta şifalı ve uçucu yağlar olmak üzere bitkilerde biriken bir takım değerli maddeleri sentezleyemezler. Hayvanların ve insanların yaşamı için çok önemli olan maddeleri, bir takım enzimleri, peptit hormonları, bağışıklık proteinlerini, interferonları ve daha pek çok hayvan ve insanda sentezlenen basit dizilişli bileşikleri sentezleyemezler. Elbette mikroorganizmaların imkanları tükenmekten çok uzaktır. Mikroorganizma bolluğunun yalnızca küçük bir kısmı bilim ve özellikle endüstri tarafından kullanılmıştır. Mikroorganizma seçimi amaçları açısından, örneğin oksijenin yokluğunda yaşayabilen anaerobik bakteriler, bitkiler gibi ışık enerjisini kullanan fototroflar, kemoototroflar, yakın zamanda keşfedildiği gibi bir sıcaklıkta yaşayabilen termofilik bakteriler büyük ilgi görmektedir. , yaklaşık 110 ° C, vb.

Yine de "doğal malzemenin" sınırlamaları açıktır. Bitki ve hayvanların hücre kültürleri ve dokuları yardımıyla kısıtlamaları aşmaya çalıştılar ve çalışıyorlar. Bu çok önemli ve ümit verici bir yoldur ve ülkemizde de uygulanmaktadır. biyoteknoloji. Son birkaç on yılda, bilim adamları, bir bitki veya hayvan dokusunun tek hücrelerinin, bakteri hücreleri gibi vücuttan ayrı büyüyüp çoğalmasını sağlayan yöntemler geliştirdiler. Bu önemli bir başarıydı - elde edilen hücre kültürleri, deneyler için ve bakteri kültürleri kullanılarak elde edilemeyen bazı maddelerin endüstriyel üretimi için kullanılıyor.

Gelişim tarihi ve ulaşılan teknoloji seviyesi

20. yüzyılın ikinci yarısında, birçok önemli keşif ve buluş yapıldı. genetik mühendisliği. Genlerde "kaydedilen" biyolojik bilgiyi "okumak" için uzun yıllar süren girişimler başarıyla tamamlandı. Bu çalışma, İngiliz bilim adamı F. Sanger ve Amerikalı bilim adamı W. Gilbert (Nobel Kimya Ödülü) tarafından başlatıldı. Bildiğiniz gibi genler, enzimler de dahil olmak üzere vücuttaki RNA moleküllerinin ve proteinlerin sentezi için bilgi-talimat içerir. Bir hücreyi kendisi için yeni, alışılmadık maddeler sentezlemeye zorlamak için, karşılık gelen enzim setlerinin onda sentezlenmesi gerekir. Ve bunun için ya içindeki genleri kasıtlı olarak değiştirmek ya da daha önce bulunmayan yeni genleri içine sokmak gerekir. Canlı hücrelerdeki genlerdeki değişiklikler mutasyonlardır. Örneğin mutajenlerin - kimyasal zehirler veya radyasyonun etkisi altında ortaya çıkarlar. Ancak bu tür değişiklikler kontrol edilemez veya yönlendirilemez. Bu nedenle bilim adamları çabalarını, bir kişinin ihtiyaç duyduğu yeni, çok özel genleri hücreye sokmak için yöntemler geliştirmeye yoğunlaştırdılar.

Genetik mühendisliği problemini çözmenin ana aşamaları aşağıdaki gibidir:

1. İzole edilmiş bir genin elde edilmesi. 2. Bir organizmaya transfer için bir genin bir vektöre sokulması. 3. Bir gen içeren bir vektörün değiştirilmiş bir organizmaya aktarılması. 4. Vücut hücrelerinin dönüşümü. 5. Genetiği değiştirilmiş organizmaların seçimi ( GDO) ve başarıyla değiştirilmemiş olanları ortadan kaldırmak.

Gen sentezi süreci şu anda çok iyi gelişmiştir ve hatta büyük ölçüde otomatikleştirilmiştir. Hafızasında çeşitli nükleotit dizilerinin sentezi için programların saklandığı bilgisayarlarla donatılmış özel cihazlar vardır. Böyle bir aparat, uzunluğu 100-120 nitrojen bazına (oligonükleotitler) kadar olan DNA segmentlerini sentezler. Mutant DNA da dahil olmak üzere DNA sentezi için polimeraz zincir reaksiyonunun kullanımına izin veren bir teknik yaygınlaştı. İçinde termostabil bir enzim olan DNA polimeraz, yapay olarak sentezlenmiş nükleik asit - oligonükleotit parçaları için bir tohum olarak kullanılan şablon DNA sentezi için kullanılır. Ters transkriptaz enzimi, bu tür primerleri (primerleri) kullanarak hücrelerden izole edilen bir RNA matrisi üzerinde DNA sentezlemeyi mümkün kılar. Bu şekilde sentezlenen DNA, tamamlayıcı (RNA) veya cDNA olarak adlandırılır. İzole edilmiş, "kimyasal olarak saf" bir gen, bir faj kitaplığından da elde edilebilir. Bu, faj tarafından tüm DNA'sı ile birlikte çoğaltılan genom veya cDNA'dan genom rastgele fragmanlarının eklendiği bir bakteriyofaj preparasyonunun adıdır.

Genleri bakterilere sokma tekniği, Frederick Griffith'in bakteriyel dönüşüm fenomenini keşfetmesinden sonra geliştirildi. Bu fenomen, bakterilerde kromozomal olmayan DNA'nın küçük parçalarının, plazmidlerin değişiminin eşlik ettiği ilkel bir cinsel sürece dayanmaktadır. Plazmid teknolojileri, yapay genlerin bakteri hücrelerine dahil edilmesinin temelini oluşturdu.

Hazır bir genin bitki ve hayvan hücrelerinin kalıtsal aparatına dahil edilmesiyle ilgili önemli zorluklar vardı. Bununla birlikte, doğada, bir hücrenin genetik aparatına yabancı DNA'nın (bir virüsün veya bir bakteriyofajın) dahil edildiği ve metabolik mekanizmalarının yardımıyla “kendi” proteinini sentezlemeye başladığı durumlar vardır. Bilim adamları, yabancı DNA'nın girişinin özelliklerini incelediler ve bunu, genetik materyali bir hücreye sokmak için bir ilke olarak kullandılar. Bu sürece transfeksiyon denir.

Tek hücreli organizmalar veya çok hücreli hücre kültürleri değiştirilirse, klonlama bu aşamada başlar, yani modifikasyona uğramış organizmaların ve onların soyundan gelenlerin (klonlar) seçimi. Görev çok hücreli organizmalar elde etmek olduğunda, genotipi değiştirilmiş hücreler bitkilerin vejetatif üremesi için kullanılır veya hayvanlar söz konusu olduğunda taşıyıcı annenin blastokistlerine enjekte edilir. Sonuç olarak, yavrular değiştirilmiş veya değişmemiş bir genotiple doğarlar ve aralarından sadece beklenen değişiklikleri gösterenler seçilir ve kendi aralarında çaprazlanır.

Bilimsel araştırmalarda uygulama

Küçük ölçekte de olsa genetik mühendisliği, bazı kısırlık türlerine sahip kadınlara hamile kalma şansı vermek için şimdiden kullanılıyor. Bunu yapmak için sağlıklı bir kadının yumurtalarını kullanın. Sonuç olarak çocuk, genotipi bir baba ve iki anneden alır.

Bununla birlikte, insan genomunda daha önemli değişiklikler getirme olasılığı, bir dizi ciddi etik sorunla karşı karşıyadır.