Nobel Komitesi kimya ödülünü kazananları açıkladı. Kimyada Nobel, kriyo-elektron mikroskobunun geliştirilmesine layık görüldü Yılın kimyasında Nobel ödülü sahipleri

2017 Nobel Kimya Ödülü, çözeltilerdeki biyomoleküllerin yapılarını belirlemek için yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron mikroskobunun geliştirilmesi nedeniyle verildi. Ödül alanlar Lozan Üniversitesi'nden, Columbia Üniversitesi'nden Joachim Frank ve Cambridge Üniversitesi'ndendi.

Kriyo-elektron mikroskobu, bir numunenin kriyojenik sıcaklıklarda incelendiği bir transmisyon elektron mikroskobu şeklidir.

Bu teknik yapısal biyolojide popülerdir çünkü lekelenmemiş veya başka şekilde sabitlenmemiş örneklerin kendi doğal ortamlarında gösterilmesine olanak sağlar.

Elektron kriyomikroskopisi, bir moleküle giren atomların hareketini yavaşlatır, bu da molekülün yapısının çok net görüntülerinin elde edilmesini sağlar. Moleküllerin yapısı hakkında elde edilen bilgiler, kimyanın daha derin anlaşılması ve farmasötiklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere son derece önemlidir.

Bilimdeki birçok buluş, insan gözüyle görülmeyen nesnelerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesini içeriyor. Optik mikroskop, mikroorganizmaların varlığını kanıtlamayı, sperm ve yumurtalara bakmayı, hücresel yapıyı kısmen incelemeyi ve hatta kromozomları görmeyi mümkün kıldı. Işık akışı yerine elektron ışınını kullanan elektron mikroskobu, optik teleskopların fiziksel sınırlamalarının üstesinden gelmeyi mümkün kıldı.

Ancak onun da kusurları vardı. İlk olarak güçlü bir elektron ışını biyolojik materyali yok etti. İkincisi, elektronların hızlanması için bir vakuma ihtiyaçları vardır - buna göre ilacın bir vakum içinde olması gerekiyordu.

Bu nedenle "canlı" örnekleri onun yardımıyla incelemek imkansızdı.

Joachim Frank'ın katkısı yöntemin geniş çapta yayılmasına katkıda bulundu. 1975-1986 yıllarında, elektron mikroskobu kullanılarak elde edilen iki boyutlu görüntülerin analiz edilmesinden ve incelenen nesnelerin üç boyutlu yapılarının temel alınarak oluşturulmasından oluşan bir görüntü işleme yöntemi geliştirdi.

Jacques Dubochet numuneleri korumak için hızla soğutulmuş su kullanılmasını önerdi. Numuneleri korumanın bir yolu olarak soğutmak, bilim insanları tarafından uzun süredir düşünülüyor. Ancak su donup kristal kafes oluştuğunda numunelerin yapısı bozuldu. Ve sıvı haldeyken elektron mikroskobunun vakum odasında buharlaşarak yine incelenen moleküllerin yok olmasına yol açtı.

Sonunda kristalleşme aşamasını atlayıp suyun camsı bir duruma dönüşmesini sağlamanın bir yolu bulundu. Yönteme vitrifikasyon adı verildi.

Vitrifikasyon sırasında su, molekülleri vakumda bile yıkımdan koruyabildi.

Bu keşifler elektron mikroskobunun gelişimine güçlü bir ivme kazandırdı. 2013 yılında bilim insanları maddenin tek tek atomlarını bile incelemeyi başardılar.Böylesine yüksek bir çözünürlük, hücrelerin ribozomlarını ve mitokondrilerini, iyon kanallarını ve enzim komplekslerini incelemeyi mümkün kıldı.

2015 yılında Nature Methods dergisi, tek parçacıklı kriyoelektron mikroskobunun yılın çığır açan yöntemini seçti.

Bu alandaki son teknik gelişmeler, bilim adamlarının X-ışını kristalografisi yönteminden uzaklaşmasına olanak tanıdı; bu yöntemin ana dezavantajı, karmaşık yapılara sahip proteinler için zor olabilen proteini kristalleştirme ihtiyacıdır. Son yıllarda bilimsel dergiler Zika virüsünün yüzeyinin ve antibiyotik direncine neden olan proteinlerin detaylı görselleriyle doldu. Özellikle Staphylococcus aureus bakterilerinin antibiyotiklerin etkisine nasıl direnç gösterdiğini ve koronavirüslerin hücrelere nüfuz ettiği yapının anlık görüntüsünü görmek mümkün oldu.

Bu alandaki hızlı ilerlemeye rağmen, ekipman maliyeti ve standartlaştırılmış yöntemler, kriyoelektron mikroskobu teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini bir miktar yavaşlatmıştır.

Nobel Kimya Ödülü'ne aday olanlar arasında, adını taşıyan Kimyasal Fizik Enstitüsü'nün (ICP) önde gelen araştırmacılarından biri olan bir Rus da vardı. N. N. Semenov, ABD'den meslektaşlarıyla birlikte, organik bileşiklerin sentezi için yeni yöntemler geliştiren bir dal olan karbon-hidrojen işlevselleştirme alanına önemli katkılarda bulundu. Olası kazananlar listesinde ayrıca, katı yüzeylerde heterojen kataliz alanındaki temel ilerlemeleri nedeniyle Danimarkalı Jens Norskov ve perovskit mineralinin keşfi ve buna dayalı gelişmeler nedeniyle kimyagerlerden Tsutomu Miyasaki, Nam-Kyu Park ve Henry Snaith'ten oluşan bir ekip de vardı. .

2016 yılında ödül, moleküler makinelerin icadı nedeniyle Jean-Pierre Sauvage, Stoddart ve Bernard Feringa'ya verildi.

2017 Nobel Kimya Ödülü, canlı organizmalardaki molekülleri çok detaylı ve çok yüksek çözünürlükte görüntülemelerine olanak tanıyan kriyo-elektron mikroskobu geliştirmeleri nedeniyle Jacques Dubochet, Joachim Frank ve Richard Henderson'a verildi.

Jacques Dubouche İsviçrelidir, İsviçre'nin Lozan Üniversitesi'nde çalışmaktadır, Joachim Frank, New York, ABD'deki Columbia Üniversitesi'nden bir Amerikalıdır, Richard Henderson, Cambridge'den (MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Cambridge, İngiltere) bir İngiliz bilim insanıdır.

Ödül alan kişilerin geçen yüzyılın 70'li ve 90'lı yıllarında devam eden araştırmalarının, daha önce tamamen görünmez olana, bireysel biyolojik moleküllere ve hatta biyolojik moleküllere ilk kez bakmayı mümkün kıldığı için biyolojide devrim niteliğinde bir atılım sağladığı vurgulanıyor. onları oluşturan atomlar.

Aslında bilim insanları elektron mikroskopisini modernize ettiler. Daha önce cansız maddeler elektron mikroskobu kullanılarak gözlemleniyordu. Ödül sahipleri bunu yaban hayatı nesnelerinin gözlemlenmesi için uyarladılar. Biyomoleküllerin şekil ve özelliklerini koruyabilmesi ve aynı zamanda onları gözlemlemeye uygun bir biçimde "sabitlenmesi" için bunları sulu bir çözeltide dondurmayı öğrendiler.

Bunun sonucunda elektron mikroskobu yardımıyla söz konusu canlıların üç boyutlu görüntülerinin elde edilmesi mümkün hale geldi. 2013 yılına gelindiğinde yöntemin çözümü olağanüstü hale geldi. Bakterileri antibiyotiklere dirençli hale getirenler gibi her türlü moleküler proteinin görüntüleri ortaya çıktı. Virüslerin, örneğin Zika virüsünün "fotoğrafını çekmek" bile mümkündü. Bu da ona karşı bir sonraki zaferi vaat ediyor.

Mikro dünyaya giren araştırmacılar şunu belirtiyor: Belirli bir nesnenin ayrıntılı bir resmi, onun özünü anlamanın en kısa yoludur. Yani bilgiye. Nobel Ödüllerini veren İsveç Kraliyet Bilimler Akademisi'nin de bu görüşü paylaştığı açıktır.

YARDIM KP

Şu anki Nobel Kimya Ödülü 109'uncudur. 1901'den bu yana dünyanın en onurlu bilim ödülü olan bu ödüle layık görülenler arasında 4 kadın da bulunuyor.

"Zamanımızın 100 dehası" listesine dahil edilen İngiliz bilim adamı Frederick Sandger, 1958 ve 1980'de olmak üzere iki kez Nobel Kimya Ödülü'nü aldı. İlki, insülin molekülündeki amino asitlerin tam dizilimini belirlemek içindi. İkincisi, DNA'nın birincil yapısını deşifre etmek için bir yöntem geliştirmek.

Geçen yıl ödül Fransa, ABD ve Hollanda'dan bilim insanlarına verildi. Fransız Jean-Pierre Sauvage, Amerikalı Sir James Fraser Stoddart ve Hollandalı Bernard L. Feringa, "moleküler makinelerin geliştirilmesi ve sentezinden dolayı" ödüle layık görüldü. Lureates aslında nanoteknolojinin maddi temelini attı.

Geçtiğimiz hafta, 2017 Nobel Kimya Ödülü'nün "biyomoleküllerin üç boyutlu yapılarını belirlemek için yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron mikroskobu tekniklerinin geliştirilmesi" nedeniyle İsviçreli Jacques Dubochet, Alman-Amerikalı Joachim Frank ve İskoçyalı Richard Henderson'a verileceği açıklandı. çözümde.” Çalışmaları, 1980'lerden başlayarak, bu tür mikroskopilerin test edilmesini ve kademeli olarak geliştirilmesini mümkün kıldı; öyle ki, son yıllarda bilim adamları karmaşık biyolojik molekülleri çok detaylı bir şekilde inceleyebilirler. Nobel Komitesi, kriyo-elektron mikroskobunun biyokimyayı yeni bir çağa taşıdığını ve yaşam molekülleri ve canlı sistemler hakkındaki bilgideki birçok boşluğu doldurduğunu belirtti.

Kriyojenik elektron mikroskobunun, maddenin fiziksel incelenmesi için temelde yeni ve kendi kendine yeterli bir yöntem olarak adlandırılmasının pek mümkün olmadığını hemen belirtelim. Daha ziyade, mikrobiyolojik nesnelerin incelenmesi için özel olarak uyarlanmış bir tür transmisyon elektron mikroskobudur (bu yöntemin yazarlarından biri olan Ernst Ruska, 1986'da Nobel Ödülü'nü almıştır).

Bir transmisyon elektron mikroskobunda, bir elektron ışını, elektronlara (genellikle bir mikronun onda biri ve yüzde biri kadar) şeffaf olacak kadar ince bir numuneden geçirilir; bunlar numuneden geçerken emilir ve saçılır, yönü değişir. hareket. Bu değişiklikler kaydedilebilir (günümüzde, yaratıcıları Willard Boyle ve George Smith'in ödüllü olduğu bir dedektör olarak çoğunlukla bir CCD matrisi kullanılmaktadır) ve analizden sonra, incelenmekte olan nesnenin bir düzlemde görüntüsünü elde etmek mümkündür. ışına dik. Elektronların asıl dalga boyu (elektron mikroskoplarının karakteristik enerjilerinde onlarca pikometre), görünür bölgedeki ışığın dalga boylarından (yüzlerce nanometre) çok daha kısa olduğundan, elektron mikroskobu, optik mikroskopiden çok daha ince ayrıntıları "görebilir". Ödüllü Eric Betzig, Stefan Hell ve William Moerner tarafından geliştirilen yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu (HRFM).

Elektron mikroskoplarının maksimum çözünürlüğüne (birkaç angstrom (bir nanometrenin onda biri)) neredeyse ulaşıldı. Bu, örneğin tek tek atomların ayırt edilebildiği görüntülerin elde edilmesini mümkün kılar. Karşılaştırma için: HRFM yeteneklerinin sınırı 10–20 nm'dir. Ancak farklı yöntemleri maksimum çözünürlüğe göre karşılaştırmak oldukça anlamsızdır. Elektron mikroskopları yüksek çözünürlüğe sahiptir ancak onu kullanmak her zaman mümkün değildir. Gerçek şu ki, numune, hazırlık sırasında öğütmenin yanı sıra, çalışma sırasında da oldukça ciddi bir elektron ışınına maruz kalır (kabaca konuşursak, ışın ne kadar yoğunsa, hata o kadar az olur ve sonuç o kadar iyi olur). bir vakumda (ortamın numunenin dışına elektronları dağıtmaması için bir vakuma ihtiyaç duyulur, böylece gereksiz bozulmalara neden olur). Karmaşık biyolojik molekülleri ve nesneleri incelemeniz gerekiyorsa bu tür koşullar tamamen uygun değildir - bunlar nadir bir ortamda hasar görür ve içlerinde çalışma sırasında kolayca yok edilecek oldukça zayıf bağlar vardır.

Ek iyileştirmeler olmadan elektron mikroskobunun biyomoleküllerin ve canlı sistemlerin incelenmesine uyarlanamayacağı anlayışı, buluşundan hemen sonra ortaya çıktı. Örneğin Macar fizikçi Ladislav Marton, 1931'de Ernst Ruska'nın elektron mikroskobunun çalışma prensibini göstermesinden üç yıl sonra bunu yazdı (L. Marton, 1934. Biyolojik Nesnelerin Elektron Mikroskobu). Aynı makalede Marton da bu sorunu çözmenin yollarını önerdi. Özellikle numunelerin dondurulmasının, elektron ışınıyla ışınlamanın neden olduğu hasarı azaltabileceğine de dikkat çekti. Marton'un makalesinde belirtilmese de numunenin dondurulmasının aynı zamanda moleküllerin termal titreşimini azaltarak yardımcı olduğunu ve bunun da sonuçta ortaya çıkan görüntüyü iyileştirdiğini belirtmek önemlidir.

1970'li ve 80'li yıllarda bilim ve teknoloji her türlü zorluğun üstesinden gelebilecek bir gelişme düzeyine ulaştı. Ve bu büyük ölçüde bu yılın ödül kazananlarının çabaları sayesinde gerçekleşti.

Richard Henderson, transmisyon elektron mikroskobu kullanarak (numune soğutulmuş halde) asimetrik bir proteini atomik çözünürlükte görüntüleyen ilk kişiydi. Araştırmalarına 70'li yılların ortalarında başladı. Dahası, ilk başta Henderson, X-ışını kırınım analizi yöntemini kullanarak hücre zarından çeşitli proteinlerin yapısını elde etmeye çalıştı; bu, o zaman bile birkaç angstromun çözünürlüğünü verebilirdi. Bununla birlikte, bu yöntemin iyi bir sonuç elde edemeyeceği kısa sürede anlaşıldı: incelenen madde kristal formda olmalı ve çevrelerinden ekstrakte edilen zar proteinleri ya zayıf bir şekilde kristalleşiyor, hatta şekillerini kaybediyor. Daha sonra elektron mikroskobuna geçti.

Spesifik bir protein seçildi - bakteriorhodopsin - ve onun zardan çıkarılmasına değil, doğrudan içinde incelenmesine karar verildi. Bilim adamları ayrıca numuneleri vakumda kurumasını önlemek için bir glikoz çözeltisiyle kapladılar. Bu, yapıyı koruma sorununun çözülmesine yardımcı oldu. Daha sonra Henderson ve meslektaşları, daha önce açıklanan, bir elektron ışınının etkisi altında numunelerin yok edilmesi sorunuyla karşı karşıya kaldılar. Birkaç faktörün birleşimi sorunun çözülmesine yardımcı oldu.

İlk olarak, bakteriorhodopsin zarda düzenli olarak yerleştirilmiştir, bu nedenle bu düzenliliğin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi ve farklı açılardan çekim yapılması bir resim oluştururken büyük ölçüde yardımcı olur. Bu, ışın yoğunluğunun azaltılmasına ve pozlama süresinin kısaltılmasına, ancak kalitenin artırılmasına yardımcı oldu. Zaten 1975 yılında, bu proteinin 7 angstrom çözünürlükte bir görüntüsünü elde etmek mümkündü (Şekil 3, bkz. R. Henderson, P.N.T. Unwin, 1975. Elektron mikroskobu ile elde edilen üç boyutlu mor membran modeli).

İkinci olarak Henderson farklı araştırma merkezlerine seyahat etme ve farklı elektron mikroskoplarını deneme fırsatı buldu. O yıllarda birleşme olmadığından, farklı mikroskopların kendi avantajları ve dezavantajları vardı: farklı derecelerde bölme tahliyesi, farklı derecelerde numune soğutma (bu, elektron ışınlamasından kaynaklanan hasarı azaltır), farklı elektron ışın enerjileri ve farklı dedektör hassasiyetleri. Bu nedenle, aynı nesneyi farklı mikroskoplarda inceleme olasılığı, önce görüntü elde etmek için "en az elverişsiz" koşulların seçilmesini ve ardından bunların kademeli olarak iyileştirilmesini mümkün kıldı. Böylece Henderson verileri topladı ve bakteriorodopsin'in giderek daha doğru bir yapısını elde etti. 1990 yılında, bu proteinin atomik çözünürlüğe sahip bir modelini sunan makalesi yayınlandı (R. Henderson ve diğerleri, 1990. Yüksek çözünürlüklü elektron kriyo-mikroskopisine dayalı bakteriyorhodopsin yapısı için model).

Bu öncü araştırmada Henderson, kriyo-elektron mikroskobunun, o zamanlar bir buluş olan, X-ışını kırınımı kadar iyi çözünürlükte görüntüler üretebildiğini gösterdi. Doğru, bu sonuç, bakteriyorhodopsinin hücre zarında düzenli olarak yer aldığı gerçeğinden önemli ölçüde yararlandı ve diğer "düzensiz" moleküller için böyle bir çözünürlüğün elde edilip edilemeyeceği açık değildi.

Rasgele konumlandırılmış biyolojik olarak aktif moleküllerden gelen zayıf sinyallerin işlenmesi sorunu, 2017 Nobel Ödülü sahibi bir başka Joachim Frank tarafından çözüldü. Kriyo-elektron mikroskobuna ana katkısı, yüksek kaliteli üç boyutlu bir modelin oluşturulmasına olanak tanıyan, kriyo-elektron mikroskobu kullanılarak elde edilen iki boyutlu görüntüleri analiz etmek için algoritmaların oluşturulmasıdır. Diğer mikroskopi teknikleri için benzer algoritmalar zaten geliştirilmiştir. Frank, elektron mikroskobundan elde edilen yararlı bilgilerin gürültüden kaynaklanan sinyallerden ayrılmasını mümkün kılan matematiksel analiz yöntemlerini optimize etti ve büyük ölçüde geliştirdi. Hassas elektronik cihazlarda çeşitli nedenlerden dolayı gürültü meydana gelir: akım ve voltajdaki rastgele dalgalanmalar, vakum bloklarındaki elektronların eşit olmayan emisyonundan, yarı iletken bloklardaki yük taşıyıcılarının (iletken elektronlar ve delikler) eşit olmayan oluşum ve rekombinasyon süreçlerinden, yarı iletken bloklardaki termal hareketten kaynaklanabilir. iletkenlerdeki akım taşıyıcıları (termal gürültü) veya dış gürültü (her şeyin genellikle iyi yalıtılmış olmasına rağmen).

Görev bu nedenle daha da karmaşıklaşıyor. Nesneler, aynı veya yaklaşık olarak aynı olsa bile, bu tür çalışmalarda olması gerektiği gibi düzensizse, yapı olarak biraz farklı olan ve birbirini bulanıklaştırabilecek sinyaller verirler. Üstelik bu tür bulanıklığın nedenini (gürültü mü yoksa algoritma hatası mı) belirlemek kolay değil. Veri işleme prensibi Şekil 2'de şematik olarak gösterilmektedir. Şekil 5: incelenen molekülün çok sayıda düz görüntüsü gürültüden arındırılmış ve "açılara" göre yazılıyor, ardından yakın açılı görüntülerden daha yüksek kalitede bir profil oluşturuluyor ve son olarak bu profillerden üç boyutlu bir model oluşturuluyor .

1981 yılında Frank, SPIDER bilgisayar programının ilk versiyonundaki matematiksel modelleri özetledi (Elektron mikroskobu ve İlgili alanlardan Görüntü Verilerini İşleme Sistemi - Elektron mikroskobu ve ilgili alanlardan verileri işleme sistemi, ilk olarak yayınlandı: J. Frank ve diğerleri. , 1981. Spider - Elektron görüntü işleme için modüler bir yazılım sistemi). Bu yazılım paketi günümüze kadar mevcut ve günceldir, üstelik bu programların dağıtımı ücretsizdir ve bu da kesinlikle dünyanın her yerindeki bilim adamlarının işini kolaylaştırmaktadır. Frank, genetik bilgiye dayalı olarak amino asitlerden protein biyosentezine hizmet eden, RNA iplikçiklerinden ve ilgili proteinlerden oluşan bir hücre organeli olan ribozomun yüzeyinin bir görüntüsünü elde etmek için kendi algoritmalarını kullandı.

Konsol "kriyo-"Üçüncü ödül sahibi Jacques Dubochet sayesinde elektron mikroskobunda ortaya çıktı. Örneklerle sulu çözeltilerin hızlı soğutulması için bir yöntem geliştirdi (J. Dubochet, A.W. McDowall, 1981. Elektron mikroskobu için saf suyun vitrifikasyonu). Dahası, suyun o kadar hızlı donması gerekir ki, moleküllerin kristal bir kafes halinde sıralanıp rastgele donması için zamanları olmaz (bkz. amorf buz). Bu, içinde numune bulunan ince bir çözelti tabakasının -160°C'ye soğutulmuş sıvı etan içeren bir kaba hızlı bir şekilde daldırılmasıyla elde edilir (Şekil 6). Doğru dondurma yöntemi, tüm yöntemin başarısının anahtarı olarak adlandırılabilir, çünkü sıralı buz kristalleri elektron kırınımına neden olarak incelenen moleküller hakkındaki bilgileri bozabilir. Proteinlerin ve nükleik asitlerin büyük moleküler ağırlığından dolayı bu moleküller hantaldır, dolayısıyla şokla dondurulduklarında konumlarını veya şekillerini değiştirmeye zamanları olmaz. Yani bu yöntemle hızlı dondurma sırasında biyolojik olarak aktif moleküllerin yapısı değişmez. Bunu kullanarak Dubochet, virüslerin yapısını incelemek için kriyo-elektron mikroskobu kullanan ilk kişi oldu (Şekil 7, bkz. M. Adrian ve diğerleri, 1984. Virüslerin kriyo-elektron mikroskobu).

1990'lı ve 2000'li yıllarda, kriyo-elektron mikroskobu, hesaplama gücü ve cihaz hassasiyetindeki ilerlemelerle birlikte yavaş yavaş gelişti ve gelişti. Ancak kriyoelektron mikroskobunun asıl gelişmesi 2012'de başlıyor. Bir numuneden geçen elektronları doğrudan yakalayabilen CMOS'a (CMOS) dayalı doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışıyla ilişkilidir. Bu, karmaşık odaklama ve sinyal dönüştürme sistemlerini ortadan kaldırarak ve rastgele gürültü oluşturabilecek düğüm sayısını azaltarak elektron mikroskoplarının tasarımını basitleştirmeyi mümkün kılmıştır. Sonuç olarak, kriyoelektron mikroskobu yönteminin çözünürlüğü 2-3 angstroma yükseldi (Şekil 8).

Bu alanda kriyoelektron mikroskobunun pratik uygulamasının bir örneği Zika virüsünün incelenmesidir (Şekil 10). 2016 yılında Brezilya'da Zika salgınının patlak vermesi sırasında, araştırmacıların kriyo-elektron mikroskobu kullanarak virüsün yapısı hakkında bilgi edinmek için birkaç ayı vardı (D. Sirohi ve diğerleri, 2016. Zika'nın 3,8 Å çözünürlüklü kriyo-EM yapısı) virüs).

Başka bir örnek - bu yıl, kriyoelektron mikroskobu, herpes virüsleri ailesinin en büyük temsilcisi olan insan sitomegalovirüsünün kapsidinin yapısını elde etmeyi mümkün kıldı (X. Yu ve diğerleri, 2017. İnsan sitomegalovirüs kapsidinin atomik yapısı ile birlikte) pp150'nin tegument tabakasının sabitlenmesi). Çalışmanın sonuçları, viral kapsidin antiviral ilaçlar için moleküler hedefler haline gelebilecek olası bölgelerinin araştırılmasının temelini oluşturdu.

Arkady Kuramşin

Bireysel atomları "görmeyi" mümkün kılan tekniklerin önemini kabul etmek Nobel Komitesi için iyi bir gelenek haline geldi: 2014'te süper çözünürlüklü mikroskopi dikkat çekti ve 4 Ekim 2017'de Nobel Kimya Ödülü verildi. "kriyo-elektron mikroskobu yönteminin geliştirilmesi için" ödülüne layık görüldü. Kazanan üç araştırmacı oldu: Lozan Üniversitesi'nden Jacques Dubochet, New York'taki Columbia Üniversitesi'nden Jochim Frank ve Cambridge'deki Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'ndan Richard Henderson. Biyomoleküllerin hareket halinde dondurulması, bunların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin elde edilmesini mümkün kılar ve bilgisayarla yeniden yapılandırma teknikleri, atomik hassasiyetle uzaysal yapı sağlar. 1970'lerde başlayan araştırmalar giderek biyoorganik komplekslerin mimarisini değerlendirebilmektedir.

Düzenli olarak önde gelen bilimsel dergilerdeki makaleleri okuyan kişiler, çok sayıda moleküler görsele uzun süredir alışkındır. Ancak mikroskoplar tek tek molekülleri görmenize izin vermez. Doğru, 2014 yılında Nobel Kimya Ödülü'nün verildiği süper çözünürlüklü mikroskopi var, ancak tek tek atomları "görmenize" izin vermiyor. Biyolojik moleküllerin yapısının bu kadar detaylı incelenmesi yapısal biyolojinin alanıdır ve yakın zamana kadar bunların önde gelen teknikleri X-ışını kırınım analizi (XRD) ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) olarak kabul ediliyordu. İlginç bir yöntem de atomik kuvvet mikroskobudur, ancak bugünkü hikayemizin kahramanı farklıdır: bu kriyoelektron mikroskobu Geliştirilmesi nedeniyle bu yıl 2017 Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü.

Küçük boyutları nedeniyle daha önce “görünmez” kabul edilen karmaşık yapıların görselleştirilmesi birçok temel atılımın gerçekleşmesini sağladı. Bunlardan biri, yakın zamanda aynı adı taşıyan hastalığın pandemisine neden olan Zika virüsüne karşı mücadelede kaydedilen ilerlemedir (Şekil 1). Son beş yılda yapısal biyolojinin "üç büyük" yönteminden biri haline gelen kriyoelektron mikroskobu sayesinde, bu sinsi ajanın üç boyutlu bir modelini elde etmek mümkün oldu. Bu da hastalıkla baş edebilecek ilaçlar için potansiyel hedef arayışının başlangıcı oldu.

Şekil 1. Bazı protein komplekslerinin örnekleri. A - Sirkadiyen ritmi düzenleyen protein kompleksi. B - Basınçtaki değişiklikleri algılayan ve duymamızı sağlayan bir kulak sesi sensör kompleksi. V - Zika virüs modeli.

1975'e kadar mikroskopinin tarihine kısa bir bakış

20. yüzyılın ilk yarısı boyunca en ünlü üç biyolojik yapı (DNA, RNA ve protein) biyokimyasal dünya haritasında boş bir nokta olarak kaldı. Vücutta var oldukları ve hücrelerin yaşamında önemli rol oynadıkları biliniyordu, ancak yapılarının ne olduğu hakkında kimsenin en ufak bir fikri yoktu. Aralarında Francis Crick, James Watson, Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin'in de bulunduğu Cambridge'den ünlü bir grup bilim insanı, 1950'lerin başlarına kadar DNA'yı X ışınlarıyla ışınlamaya çalışarak ünlü çift sarmalın keşfine yol açtı.

Richard Henderson ilk başta aynı zamanda bir kristalograftı ve ilk araştırmalarından dolayı Nobel Ödülü olmasa da doktora unvanını aldı. X-ışını kırınımı yöntemi, bir molekülün yapısının tanımlanmasına yardımcı olan, X-ışınlarının bir kristal kafes tarafından kırınmasını içerir. Ancak o zamanlar hala mükemmel olmaktan uzaktı, ancak bugün maddenin yapısını incelemenin ana yollarından biri olmasına rağmen. 30 yıl ileri giderek, bilimin biyomoleküllerin yapısını çözmenin başka bir yolunu kazandığını öğreniyoruz: 1980'lerde nükleer manyetik rezonans yöntemi çözeltideki proteinlerin yapısını ve dinamiklerini incelemek için kullanılmaya başlandı (ve bugün hala kullanılıyor) ).

Bu iki yöntem sayesinde biyolojik moleküllerin yapısı hakkında etkileyici miktarda bilgi biriktirmek mümkün oldu: bugün PDB 100 binden fazla yapı içeriyor. Ancak sıklıkla olduğu gibi her iki yöntemin de dezavantajları vardır. Böylece NMR yardımıyla yalnızca çözeltideki proteinler görüntülenebilir ve boyutlarının küçük olması gerekir. Ve X-ışını kristalografisinin dezavantajı, yöntemin adında görülebilir: kristaller gibi kararlı yapılar üzerinde çalışır, ancak dinamik "canlı" moleküller üzerinde çalışmaz. Bu yöntemle elde edilen görüntüler, tarihteki ilk kameraların çektiği fotoğrafları anımsatıyor: siyah beyaz ve donmuş, proteinin hareketli yapısı hakkında hiçbir bilgi taşımıyor. Bu sorun, Richard Henderson'ın 1970'li yıllarda X-ışını kristalografisinden vazgeçmesine neden oldu ve bu, 2017 Nobel Ödülü'ne giden yolda başlangıç ​​noktası oldu.

Birinci adım: bir elektron ışınının tabancasının altında bakteriyorhodopsin

Henderson en başından beri membran proteinleriyle ilgileniyordu. Neden görselleştirmeleri o dönemdeki X-ışını yönteminin yeteneklerinin ötesinde çıktı? Proteini kristalleştirme girişimlerinde başarısızlıklar meydana geldi ve böylece hücrenin lipit zarındaki doğal durumu bozuldu. Membran proteinlerinin doğal durumlarını bozmadan zardan çıkarılması son derece zordur: çoğu zaman daha fazla çalışmaya konu olmayan tek bir kütle halinde "birbirine yapışırlar". Ancak artık zar proteinlerinin kristalizasyonunda büyük bir ilerleme var: Zarı kristalin bir parçası yapmayı öğrendiler.

Bir dizi başarısız denemeden sonra Richard Henderson tek uygulanabilir seçeneğe yöneldi: elektron mikroskobu. Elektron mikroskobu ile optik mikroskop arasındaki temel fark nedir? Transmisyon elektron mikroskobunda (bu tekniğe bu ad verilir), numuneye ışık ışını yerine bir elektron ışını gönderilir. Elektronların dalga boyu, ışığın dalga boyundan çok daha kısa olduğundan, tek tek atomların seviyesine kadar çok küçük yapılar bile bir elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir.

Teorik olarak elektron mikroskobu, Richard Henderson'ın araştırması için idealdi çünkü membran proteinlerini atomik seviyede görüntülemeyi mümkün kılıyordu. Ancak pratikte bu fikir gerçekçi görünmüyordu. Elektron mikroskobunun icadından bu yana bu yöntemin yalnızca cansız maddeleri incelemek için kullanılabileceğine inanılıyordu. Bunun nedeni elektron ışınıdır: Yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmenizi sağlar, ancak aslında yolu üzerindeki canlı yapıları "yakar". Yoğunluğunu azaltırsanız görüntü kontrastı kaybeder ve bulanıklaşır.

Biyomoleküllerin elektron mikroskobu altında görüntülenmesinin önündeki ek bir engel de vakum yaratma ihtiyacıdır. Biyolojik bir numuneden hava dışarı pompalandığında, canlı yapıları saran su da buharlaşarak doğal şekillerini kaybetmelerine neden olur. Dolayısıyla tüm koşullar Henderson'ın aleyhineydi. Ancak fikri, membranda olağanüstü stabiliteye sahip olan özel bir protein olan bakteriorhodopsin sayesinde kurtarıldı.

1991 yılında Joachim Frank, Dubochet yöntemini kullanarak ribozomları "dondurdu" ve bunların üç boyutlu yapısının bir görüntüsü elde edildi. Fotoğrafın elektron mikroskobu için benzeri görülmemiş bir çözünürlükte çekilmiş olmasına rağmen, araştırmacılar sadece ribozomun ana hatlarını gösterebildiler. Gözyaşı damlası şeklindeki tuhaf yapılar hâlâ X-ışını kristalografisinin atomik çözünürlüğüyle karşılaştırılmaya dayanamıyordu. Kriyo-elektron mikroskobu yalnızca kabarcıklara benzeyen düzensiz elektron yoğunluğu konturlarını görselleştirebiliyordu; bu nedenle yönteme şaka amaçlı "bloboloji" adı verildi ( bloboloji). Ancak ilerleme devam ediyor ve 2010'dan sonra yeni bir tür elektronik dedektör yaygınlaştı - Doğrudan Elektron Dedektörü biyolojik yapıların çok daha ayrıntılı bir görüntüsünün elde edilmesini sağlar.

Günümüzde kriyoelektron mikroskobu, biyolojik yapıların farklı aşamalarda “dinamik olarak” “yakalanmasını” mümkün kılmaktadır. Ortaya çıkan görüntüleri birleştirerek araştırmacılar, proteinlerin diğer moleküllerle hareketlerini ve etkileşimlerini gösteren tam filmler oluşturabiliyorlar. Son beş yılda neredeyse her ikinci moleküler yapı dergilerde yayınlandı. Bilim Ve Doğa, kriyomikroskobik: bunlar ribozomun, ATPazların, çeşitli reseptörlerin ve gizemli tau peptidinin filamanlarının, inflammozomun ve sıcaklığa duyarlı iyon kanalı TRPV1'in yeni durumları ve çok daha fazlasıdır. Ve bu sadece başlangıç: Bilim insanları birçok proteinin ve diğer karmaşık biyolojik yapıların kesin yapısını ve mekanizmasını henüz belirleyemedi.

Edebiyat

1. Resimlerde 12 yöntem: mikroskopi;
2. Kırınım Bariyerinin Ötesinde: 2014 Nobel Kimya Ödülü;
3. Resimlerle 12 yöntem: yapısal biyoloji;
4. Atomik kuvvet mikroskobu: dokunarak görün;
5. Fernholm A. (2017).

2017 Nobel Kimya Ödülü, ultra hızlı dondurma kullanarak maddeyi inceleme yöntemi olan kriyo-elektron mikroskobunun geliştirilmesi nedeniyle verildi. 9 milyon İsveç kronu tutarındaki ödül İsviçreli Jacques Dubochet, Amerikalı Joachim Frank ve İngiliz Richard Henderson tarafından paylaşılacak. Uzmanlar, bunların geliştirilmesinin, protein komplekslerinin, kompleks reseptörlerin ve kristalografi ve spektroskopi ile incelenemeyen diğer bileşiklerin yapısını belirlemeyi mümkün kıldığını söylüyor.

İsviçreli Jacques Dubochet, Amerikalı Joachim Frank ve İngiliz Richard Henderson, çözeltideki yüksek molekül ağırlıklı biyomoleküllerin yapısını belirlemeye yönelik kriyo-elektron mikroskobu teknolojisini geliştirdikleri için Nobel Kimya Ödülü'nü alacaklar. Nobel Komitesi'nin bir bildirisinde böyle bir mikroskobun, nesnelerin hızla dondurulduktan sonra incelenmesine olanak tanıdığı ve moleküldeki atomların doğal şeklini koruduğu belirtildi.

Daha önce, bu cihazın güçlü elektron ışınları biyolojik materyali tahrip ettiğinden, elektron mikroskopları aracılığıyla yalnızca inorganik bileşikler ve cansız maddeler inceleniyordu. 1990 yılında Richard Henderson mikroskop kullanarak bir proteinin atomik düzeyde 3 boyutlu görüntüsünü oluşturmayı başardı. Joachim Frank bu teknolojiyi daha dikkatli geliştirdi: 1975'ten 1986'ya kadar atomların görüntüsünü daha net hale getirmek için çalıştı. Sonunda Jacques Dubochet elektron mikroskobunda suyun kullanım alanını bulmayı başardı. Bir "parlama" teknolojisi kullandı: Biyolojik bir numunenin etrafındaki suyu hızlı bir şekilde soğutarak moleküllerin doğal şekillerini korumalarını sağladı. Mevcut ödül sahipleri tarafından keşfedilen yöntem, protein bileşiklerinin yapısının belirlenmesine olanak tanıyor.

Kurchatov Enstitüsü'ndeki elektron mikroskobu laboratuvarının başkanı Alexander Vasiliev, "Bu yöntem artık bilimin en ileri seviyesindedir" dedi. Rusya Bilimler Akademisi Biyoorganik Kimya Enstitüsü'nden araştırmacı Alexey Pakhomov, Nobel ödüllülerin keşfettiği yöntem sayesinde bilim adamlarının protein kompleksleri, kompleks reseptörler, çoklu protein bileşikleri ve kristalografi ve nükleer manyetik ile incelenemeyen diğer malzemelerle çalışabileceğini açıkladı. rezonans spektroskopisi (NMR). Bay Pakhomov, Russia 24 TV kanalına şöyle açıkladı: "Bu, tek tek moleküllerin yapısını çok yüksek çözünürlükte ve kristal halinde değil, doğal hallerinde elde etmenize olanak tanıyan çok güçlü bir yöntemdir." NMR ödülü verildiğinde, kriyomikroskopi oldukça haklı bir şekilde not edildi”.

Moskova Devlet Üniversitesi Fiziko-Kimyasal Biyoloji Araştırma Enstitüsü'nün elektron mikroskobu bölümü başkanı Igor Kireev de bu yöntemi kullanarak biyolojik yapıları "intravital'e yakın bir durumda" incelemenin mümkün olduğunu söylüyor. Ultra hızlı dondurma teknolojisinin numuneleri "sanki bir hücrenin içindeymiş gibi sulu bir ortamda" bıraktığını söylüyor. Bay Kireev, "Aynı zamanda sertleşiyorlar, bu da dokulardan veya hücrelerden bahsediyorsak elektron mikroskobu için bölümler oluşturmaya olanak tanıyor" diye açıkladı. Bilim insanına göre bu teknoloji, moleküllerdeki tek tek atomlara kadar örnekleri yüksek çözünürlükte incelemeyi mümkün kılıyor. Bay Vasiliev, "Proteinlerde meydana gelen bazı reaksiyonları yakalamak mümkündür" diye ekledi. Igor Kireev, Rusya'da, örneğin Kurchatov Enstitüsü'nde bu türden yalnızca birkaç yeni mikroskobun bulunduğuna, çünkü bu ekipmanın "çok pahalı" olduğuna inanıyor.

Rusya Bilimler Akademisi Biyoorganik Kimya Enstitüsü'nün kıdemli araştırmacısı Konstantin Mineev, proteinlerle ilgilenen bilim alanında "bunun kesinlikle hak edilmiş bir ödül olduğunu" belirtti. "Proteinler vücudumuzda asıl işi yapan şeydir, küçük makineler gibi çalışırlar" diyen bilim insanı, "Nasıl çalıştıklarını anlarsak, yapılarını bilirsek onları değiştirebilir, durdurabilir ve buna göre tedavi arayabiliriz. Verileri modelleyerek ve analiz ederek. O zaman rastgele değil rastgele bir ilaç seçebiliriz. Bu yaklaşıma rasyonel ilaç tasarımı denir."

“Sıradan bir elektron mikroskobuna benziyor, ancak çok yüksek bir çözünürlüğe sahip ve bilgisayar görüntü işleme algoritmalarıyla destekleniyor: büyük moleküler komplekslerin görüntüleri, farklı açılardan birkaç yüz bin miktarda biriktiriliyor, bu da 3 boyutlu bir yeniden yapılandırmayı mümkün kılıyor. Rusya Bilimler Akademisi Biyoorganik Kimya Enstitüsü'nde kıdemli araştırmacı olan fiziksel ve matematik bilimleri adayı Anton Chugunov, Kommersant'a bilim adamlarının kriyoelektron mikroskobunu nasıl kullandıklarını açıkladı. Yöntemin kendisi bu kadar yüksek bir çözünürlük sağlamaz, ancak bilgisayar algoritmalarıyla birlikte kullanılması buna izin verir." . Yaklaşık beş yıl önce bu yöntemin popüler olmadığını, çünkü ortaya çıkan çözünürlüğün oldukça düşük olduğunu ve verilerin çalışmada kullanılmasının zor olduğunu belirtti: bilgisayar modellemesi ve sürükleme tasarımı (ilaç oluşturma) için uygun değillerdi: "Ama Son beş yılda çok büyük atılım yapıldı, çözünürlük iyileştirildi.”

Kriyoelektron mikroskobundan önce, biyolojideki yapısal çalışmaların ana lideri X-ışını kırınım analiziydi; maddeleri moleküler düzeyde incelemek için başka bir yöntem nükleer manyetik rezonanstır. Bilim adamı şöyle açıklıyor: "Ancak her birinin kendi dezavantajları var. NMR büyük molekül komplekslerini almaz, X-ışını kristalografisi moleküllerin kristalleşmesini gerektirir ve molekül ne kadar büyükse, o kadar zor olur.

Ve burada büyük kompleksler üzerinde çok iyi çalışan kriyomikroskopi ortaya çıktı; bunlar birkaç tane, 5-10 adet büyük protein, karmaşık bir şekilde bağlılar, karmaşık bir uzaysal şekle sahipler ve bu da diğer tüm yöntemler için sınırlayıcı bir faktör oldu.”

Bay Chugunov aynı zamanda kriyoelektron mikroskobunun küçük molekül kompleksleri için kullanımının zor olduğunu da belirtti: "Dolayısıyla artık bu yöntemler birlikte çalışıyor ve bu çok başarılı." Uzman, kriyoelektron mikroskobunun dünyada yaygın olarak kullanıldığını ancak Rusya'da "bunun henüz çok yaygın bir yöntem olmadığını" kaydetti.

Kazananlardan biri olan Joachim Frank, ödül karşısında şok olduğunu söyledi. Aynı zamanda kriyoelektron mikroskobu yönteminin ancak zamanla pratik uygulama bulacağını da belirtti. Bay Frank, "Doğrudan pratik fırsatları görmek her zaman zaman alır" dedi.

Kimya Ödülü bugün 109. kez verildi. Bu yıl, Nobel Vakfı, 2001'den bu yana ilk kez ödül kazananlara yapılacak ödeme miktarını 8 milyondan 9 milyon İsveç kronuna (1,12 milyon dolar) çıkardı. 2016 yılında kimya ödülünün Jean-Pierre Savage, Fraser Stoddart ve Bernard Feringa'ya molekülleri veya komplekslerini hareket ettiren mikroskobik cihazlar olan "moleküler makineler" geliştirmeleri nedeniyle verildiğini hatırlayalım. Bu cihazların tıpta çeşitli sensörlerde kullanılması planlanıyor.

5 Ekim Nobel Edebiyat Ödülü sahipleri açıklanacak 6 Ekim Nobel Barış Ödülü'ne layık görülecek. 9 Ekim Alfred Nobel Anısına İsveç Ulusal Bankası İktisadi Bilimler Ödülü'nün (gayri resmi olarak "Nobel İktisat Ödülü" olarak anılır) sahibi olacak.

Alexander Voronov, Valeria Mishina