In vitro koşullar altında. IN VITRO bitki çoğalmasının ana aşaması. İmmünolojik araştırma yöntemleri
V. V. Rogovaya, M. A. Gvozdev
TAŞ KÜLTÜRLERİNİN İN VITRO KOŞULLARDA MİKROKLONAL YAYILIMI ÖZELLİKLERİ
Makale, sert çekirdekli meyve mahsullerinin in vitro sistemde mikroklonal çoğaltılmasına yönelik yöntemlerin özelliklerini inceleyen bir inceleme sunmaktadır. Aksiller tomurcuklarla çoğaltma yöntemine ve kiraz, kiraz, şeftali ve kayısı yaprak eksplantlarından tesadüfi sürgünlerin yenilenmesi yöntemine özellikle dikkat edilir. Çeşitli patojenlerden bitki sağlığı ve sert çekirdekli meyve bitkilerinin bitki materyalinin viral enfeksiyonların varlığı açısından test edilmesi konuları ele alınmaktadır.
İlk kez, yirminci yüzyılın 50'li yıllarında Fransız bilim adamı Georges Morel tarafından orkideler üzerinde mikroklonal yayılım gerçekleştirildi. Çalışmalarında bitkilerin apikal meristemini yetiştirme tekniğini kullandı. Bu şekilde elde edilen bitkiler viral enfeksiyondan ariydi.
Ülkemizde meristem yöntemi ve klonal mikroçoğaltım kullanılarak bitki sağlığı üzerine araştırmalar 60'lı yıllarda adını taşıyan Bitki Fizyolojisi Enstitüsü'nde başlamıştır. K. A. Timiryazev SSCB Bilimler Akademisi.
Mikroklonal çoğaltma, orijinal eksplantla genetik olarak aynı olan bitkilerin in vitro üretilmesidir (bitkilerin in vitro kültürde vejetatif çoğaltılması yöntemi). Mikro çoğaltma, somatik bir bitki hücresinin benzersiz bir özelliğine - totipotens - hücrelerin tüm organizmanın genetik potansiyelini tam olarak gerçekleştirme yeteneğine dayanmaktadır.
Şu anda, tarımsal mahsullerin (öncelikle bitkisel olarak çoğaltılan) in vitro bir sistemde mikroklonal çoğaltılmasının çeşitli yöntemleri giderek daha alakalı hale gelmektedir: koltuk altı ve adventif tomurcuklarla çoğaltma, dolaylı morfogenez, somatik embriyogenez.
Bu yöntemlerin kullanılması şunları mümkün kılar:
Pazarlanabilir ürün elde etme süresinin 10-12 yıl yerine 2-3 yıla indirilmesi sonucunda seçim sürecinin hızlandırılması;
Kısa bir süre içinde, ana bitkiyle genetik olarak aynı olan, büyük miktarda sağlıklı, virüssüz materyal elde edilir;
Laboratuvar koşullarında çalışın ve tüm yıl boyunca aktif olarak büyüyen bitkileri sürdürün;
Olumsuz abiyotik ve biyotik faktörlerin etkisini ortadan kaldıran, bitkileri dış çevreyle neredeyse hiç temas etmeden çoğaltın;
Birim alan başına maksimum bitki sayısını elde edin;
Kısa sürede çoğaltılması zor veya vejetatif olarak çoğaltılamayan çok sayıda bitki elde edin;
Uzun bir gençlik aşamasına sahip bitkilerin yetiştirilmesiyle, gençlik aşamasından gelişimin üreme aşamasına geçiş hızlandırılabilir;
Bitki materyalini uzun süre (1-3 yıl) in vitro (taze ortama geçirmeden) muhafaza etme,
Değerli bitki türlerinin ve bunların bireysel organlarının uzun süreli depolanması için bankalar oluşturun;
İn vitro işlem görmüş materyalin dondurularak saklanmasına yönelik yöntemler geliştirin.
Sert çekirdekli meyve mahsullerinin mikro çoğaltılmasının aşamaları ve viral enfeksiyonların varlığının test edilmesi
Mikro çoğaltma işlemi birkaç aşamadan oluşur. Başlıcaları şunlardır:
Aşama 1 - eksplantın in vitro kültüre sokulması;
Aşama 2 - mikro çoğaltma;
Aşama 3 - mikro çekimlerin köklenmesi süreci;
Aşama 4 - köklü bitkilerin sterilden steril olmayan koşullara geçişi.
Bitkilerin in vitro mikro çoğaltılması yönteminde önemli bir adım, virüs taşıyıcılarının erişemeyeceği koşullar altında, yetiştirme evlerinde veya kışlık seralarda izole edilmiş kutularda virüssüz uterus bitki formlarının yetiştirilmesidir. Daha sonra in vitro kültüre eklenmek üzere eksplant donör bitkileri, PCR teşhis yöntemleri veya moleküler hibridizasyon veya enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) kullanılarak viral, mikoplazma ve bakteriyel enfeksiyonların varlığı açısından test edilmelidir.
ELISA yöntemi, sert çekirdekli meyvelere bulaşan virüslerin büyük çoğunluğunun hızlı bir şekilde tespit edilmesini mümkün kılar: erik cüce virüsleri, sert çekirdekli meyvelerin nekrotik halka nokta virüsleri, erik Sharki potyvirüsü, kiraz yaprağı kıvrımının povirüs olmayan virüsleri. ELISA ile temas virüslerinden ari olduğu tespit edilen klonlar daha sonra, indikatör bitkiler üzerinde yapılan bir testle birlikte serolojik testleri içeren temel testlere tabi tutulur. Virüslerden ve diğer düzenlenmiş patojenlerden ari olarak test edilen bitkilere "virüssüz" temel klon kategorisi atanır. Bir enfeksiyon tespit edilirse orijinal bitkiler rehabilite edilebilir. Sert çekirdekli meyve bitkilerinin virüslere karşı sağlığını iyileştirmek için, kuru hava termoterapisi ve in vitro kültür yöntemlerinin birleştirilmesi en çok tavsiye edilir. İzole edilmiş apikal meristem kültürü kullanılarak test edilen virüslerden kurtulmak mümkün değilse, bitkilerde in vitro viral enfeksiyonun gelişimini engelleyen kimyasalların besin ortamına sokulmasına dayanan kemoterapi yöntemleri kullanılır.
Bazen bakteriyel mikroflorayı aktif olarak tespit etmek için ortam, saprofitik mikroorganizmaların gelişimini tetikleyen kazein hidrolizat gibi çeşitli organik katkı maddeleri ile zenginleştirilir. 7-10 gün sonra istila görsel olarak değerlendirilir. "Temiz" eksplantlar daha fazla ekim için besin ortamına yerleştirilir. Bu aşamada büyüme maddeleri içermeyen ortamların kullanılması da uygulanmaktadır.
Sert çekirdekli meyve bitkilerinin in vitro kültürüne ve mikro çoğaltılmasına giriş
Sert çekirdekli meyve mahsullerinin klonal mikro çoğaltılmasında, apikal ve yan tomurcukların yanı sıra meristematik uçlar genellikle eksplant kaynağı olarak kullanılır. Apikal meristemin izolasyonu, bitki materyalinin aşamalı olarak sterilizasyonundan sonra genel kabul görmüş yöntemlere göre gerçekleştirilir.
Sert çekirdekli meyvelerin mikro çoğaltılması için çeşitli ortamlar kullanılır: kirazların mikro çoğaltılması için - Pierik, Gautre, White, Heller, kiraz ve erikler için - Rosenberg ortamı, meyve bitkileri ve erikler için değiştirilmiş - Lepoivre ve B5 ortamı. Ancak kiraz, tatlı kiraz ve eriklerin mikroklonal çoğaltımı için en uygun olanı Murashige-Skoog (MS) besin ortamıdır.
Sert çekirdekli meyve mahsullerinin mikroklonal çoğalma aşamasına bağlı olarak, besin ortamına 0,2-2 mg/l konsantrasyonlarda 6-benzilaminopurin (6-BAP) eklenir. İn vitro kültüre uygulama aşamasında daha düşük bir sitokinin konsantrasyonu kullanılır - 0,2 mg/l BAP. Maksimum sayıda sürgün elde etmek amacıyla koltuk altı tomurcuklarının çoğalmasını teşvik etmek için kiraz mikrobitkileri, 0,5-2 mg/l konsantrasyonlarda BAP, erik mikrobitkileri - 0,5-1 mg/l BAP ilavesiyle yetiştirilir.
Mikro çekimlerin köklenmesi süreci
Köklenme aşaması özel dikkat gerektirir. Sert çekirdekli meyve bitkilerinin sürgünlerinin in vitro köklenmesi işlemi, çeşit özelliklerine, gerçekleştirilen geçiş sayısına, oksinin konsantrasyonuna ve türüne ve uygulama yöntemine bağlıdır. Sert çekirdekli meyve mahsullerinin tamamen oluşmuş mikro bitkilerini elde etmek için, rizogenez süreçlerine müdahale eden 6-BAP ortamdan çıkarılır ve başta β-indolil-3-bütirik asit (IBA) olmak üzere oksinler ortama eklenir. Besleyici ortamda optimum IBA konsantrasyonunun 0,5-1 mg/l aralığında olduğu tespit edilmiştir. Ortamda 2 mg/l konsantrasyonda IBA bulunması hipertrofik köklerin oluşmasına neden olur.
Ribav ilacının (1 ml/l) ve geleneksel fitohormonlar oksinlerin [IBA ve β-indolilasetik asit (IAA) her biri 0,5 mg/l) köklendirme ortamına birlikte uygulanması, birçok taş çeşidinin sürgün köklenme yüzdesini artırır. meyve bitkileri.
Kök oluşumunu teşvik eden maddelerle ilgili karşılaştırmalı bir çalışmada: IAA, IAA ve a-naftilasetik asit (NAA), IAA'nın 6,0 mg/l konsantrasyonda yüksek verimliliği ortaya çıktı. En fazla sayıda köklü kiraz mikro kesimi NAA içeren bir ortamda elde edildi. Ancak aynı zamanda sürgünlerin bazal bölgesinde yoğun kallus büyümesi meydana geldi ve bu da köklü test tüpü bitkilerinin steril olmayan koşullara aktarılmasını zorlaştırdı.
Test tüpü sert çekirdekli meyve bitkilerinin etkili bir şekilde köklenmesi için yalnızca uyarıcının türü değil, aynı zamanda uygulama yöntemi de büyük önem taşımaktadır. Oksinlerin besin ortamına dahil edilmesine ek olarak, rizogenezi teşvik etmek için, sürgünlerin steril sulu IBA (25-30) mg/l solüsyonunda 12-24 saatlik bir maruz kalma ile ön ıslatılması kullanılır. Deneyler, mikro kesimlerin sulu bir IBA çözeltisi ile işlenmesinin, bu regülatörün kültür ortamına sokulmasından daha etkili olduğunu gösterdi. Bir rizogenez indükleyicisi ile ön tedavi uygulandığında ilk adventif köklerin büyük görünümü 20-25. günlerde kaydedildi. Rizogenezi tetiklemenin bir başka yolu, sert çekirdekli meyve mahsullerinin sürgünlerini, %0,125, %0,25 konsantrasyonunda talk oksin içeren toz IBA ve %0,25, %0,5 konsantrasyonunda IAA ile işleme tabi tutmaktır. Hormonal toz kullanıldığında, rizogenez indükleyicilerin kullanımının yüksek verimliliği ve üretilebilirliği kaydedildi. Ancak farklı oksin konsantrasyonlarına sahip IMC talk tozunun kullanılması, erik mikro kesimlerinin köklenmesinde çeşitli spesifikliği ortaya çıkardı.
Rizogenez süreci en yoğun olarak değiştirilmiş MS ve White ortamlarında meydana gelir. Diğer verilere göre, kök oluşumu için en iyi ortam, Heller'e göre makro elementler içeren, vitaminlerin ilave edildiği ve 15 mg/l azaltılmış sükroz içeriğine sahip yarı seyreltilmiş MS ortamıdır ve mezo-inositol hariçtir. kallus dokusu oluşumunu teşvik eder. Ancak çoğu araştırma, sert çekirdekli meyve mahsullerinin mikro sürgünlerini köklendirmek için Murashige ve Skoog ortamlarını kullanıyor.
Mikro yayılım yöntemleri
Bitkilerin in vitro mikroklonal çoğaltılması için çeşitli yöntemler vardır:
Aksiller tomurcuklarla çoğaltma yöntemleri;
Maceracı tomurcuklarla çoğaltma yöntemleri;
Dolaylı morfogenez;
Somatik embriyogenez.
Her türlü in vitro rejenerasyon için başarısını belirleyen dört grup faktör ayırt edilebilir: orijinal ana bitkinin genotipi ve durumu; yetiştirme koşulları ve yöntemleri; besin ortamının bileşimi; Bir eksplantın steril bir kültüre sokulmasının özellikleri.
Genotipin mikro çoğaltımın verimliliği üzerindeki etkisi
Genotip, mikro çoğaltımın verimliliği üzerinde en önemli etkiye sahiptir. Bitkilerin aseptik yetiştirme koşullarına tepkisi çeşit özelliklerine bağlıdır ve meyve ve meyve bitkisi çeşitlerinin farklı rejeneratif yetenekleriyle açıklanır. Örneğin, yeni kiraz çeşitlerinin çoğalmasını hızlandırmak için klonal mikro çoğaltma kullanıldığında, bitkilerin mikro çoğaltma yeteneğinde çeşit özelliklerinin baskın faktörler olduğu bulundu.
Çeşit farklılıkları hem çoğalma aşamasında hem de kök oluşumu aşamasında ortaya çıkmıştır.
Aynı türdeki meyve bitkilerinin farklı çeşitlerinin eksplantları arasında, genellikle besiyerinde bulunan büyüme düzenleyicilerine farklı derecelerde tepkiler gözlenir; bu, açıkça, bir dereceye kadar, meyve bitkilerinin genetik olarak belirlenmiş bir özelliği olan büyüme maddelerinin endojen içeriğini yansıtır. tür veya çeşitlilik. Aynı zamanda, Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa türleri arasındaki melezlerde in vitro embriyo kültüründe morfogenetik potansiyelin gerçekleştirilmesi esas olarak genotip tarafından belirlendi ve daha az ölçüde bileşime bağlıydı. besin ortamının.
Yetiştirme koşulları
Bitki mikroçoğaltımının başarısını belirleyen bir diğer faktör de yetiştirme koşullarıdır. Sert çekirdekli meyve mahsullerinin yetiştirilmesi için en uygun koşullar şunlardır: kirazlar için 22-26 °C ve erikler için 26-28 °C sıcaklık, 16 saatlik bir fotoperiyod ile kirazlar için 2000-5000 lüks ve erikler için 3500 lüks aydınlatma. Mikro bitkiler iklim odalarında veya kontrollü odalarda yetiştirilmelidir.
Çoğalma aşamasındaki kiraz çeşitlerinde, besin ortamlarının alternatif mineral bileşimleri ve mavi ışık lambalarının kullanılmasıyla üreme katsayısında bir artış ve köklenmeye uygun sürgün oranında bir artışın sağlanabileceği belirtilmelidir (LP 1). ). Rejenerantlar yatay olarak yerleştirildiğinde çok sayıda sert çekirdekli meyve mahsulü sürgünü (30'a kadar) oluşturulabilir. İlk geçişlerdeki çoğalma oranını arttırmak için, sert çekirdekli meyve mahsullerinin tomurcuk ve sürgün kümeleri ayrı birimlere bölünemez, ancak tamamen taze bir besin ortamına aktarılır. Bu tekniği kullanırken çarpma faktörü keskin bir şekilde artar ve çeşide bağlı olarak pasaj başına 40-70'e ulaşabilir.
Aksiller tomurcuklarla yayılma yöntemi: dolaylı morfogenez
Mikroklonal çoğaltmanın en güvenilir yöntemi, koltuk altı tomurcuklarının geliştirilmesi yoluyla bitki rejenerasyonu yöntemidir. Bu yöntemin avantajı, en yüksek fenotipik ve genotipik stabiliteyi sağlarken orijinal genotipin nispeten hızlı çoğaltılmasıdır. Bu in vitro mikro çoğaltma yönteminin potansiyeli, gövdenin apikal tomurcuğunun gelişimini baskılayan ve koltuk altı tomurcuklarının oluşumunu uyaran besin ortamına sitokininlerin eklenmesiyle gerçekleştirilir.
İzole edilmiş apikal meristemlerin kültür yöntemini kullanarak kirazların mikroklonal çoğaltılması işlemi, mevcut meristemlerin daha sonraki gelişimini destekleyen ve ekim materyalinin genetik homojenliğini sağlayan apikal baskınlığın kaldırılması olgusuna dayanmaktadır.
riyal. Apikal baskınlığın ortadan kaldırılması sitokininlerin eklenmesiyle sağlanır. Birçok kiraz çeşidi, dallanmış bir tomurcuk kümesinin ve yanal mikro sürgünlerin oluşumuna katkıda bulunan tepe noktasındaki yüksek mitotik aktivite ile karakterize edilir.
İn vitro elde edilen materyalin genetik stabilitesi üreme modeline bağlıdır. Sert çekirdekli meyve bitkilerinin üreme süreci, koltuk altı meristemlerin çoğalması ile ilişkilidir. Genetik stabilite, meristemin ayrılmaz bir özelliğidir ve meristemin kallus oluşumunu engelleyen koşullar altında yetiştirilmesi durumunda in vitro olarak korunabilir. Kallus oluşumunu uyaran ortamların kullanılması durumunda genetik çeşitlilik ortaya çıkabilir.
Daha yüksek üreme oranları elde etmek için, besin ortamları genellikle sitokinin niteliğindeki ilaçlara ek olarak, kallus dokusunun gelişimini uyaran oksin grubundan maddelerle zenginleştirilir. Bu iki ilacın kombinasyonları kallus dokularında organogenezi teşvik etmek için kullanılır. Kallus-sürgün sisteminde, sürgünün organize yapısı organogenez süreçlerini etkileyebilir, kallus hücrelerinin meristematizasyonunu uyarabilir ve bu da farklı özelliklere sahip organların ortaya çıkmasına neden olabilir. Maksimum hücre çoğalmasını sağlamak için kültür ortamına eklenen büyüme düzenleyicilerinin içeriğini basitçe değiştirmek, ortaya çıkan materyalin genetik stabilitesini etkileyebilir.
Macera dolu tomurcuklar ve dolaylı morfojenez yoluyla yayılma yöntemi
Maceracı tomurcuklara, doğrudan bitki eksplantlarının dokularından ve hücrelerinden ortaya çıkan ve genellikle onları oluşturmayan tomurcuklar denir. Maceracı (veya maceracı) tomurcuklar, çoğunlukla kallus dokusundan ikincil olarak oluşan meristem bölgelerinden oluşur. Maceracı tomurcuklar meristem ve meristem olmayan dokulardan (yapraklar, gövdeler) ortaya çıkabilir. Pek çok bitki türünde tesadüfi tomurcukların oluşumu, besin ortamındaki sitokininlerin oksinlere oranının yüksek olmasıyla tetiklenir.
Eksplantın somatik bitki hücrelerinden sürgünlerin, köklerin veya embriyoidlerin rejenerasyonu, dolaylı rejenerasyon - kallus oluşumu ve sürgün oluşumu yoluyla veya eksplant hücreleri, kallus dokuları oluşmadan rejenerasyon yapabilme yeteneğine sahip olduğunda "doğrudan" rejenerasyon yoluyla gerçekleşebilir.
Maceracı sürgünler, çeşitli sert çekirdekli meyve ve meyve bitkilerinin yapraklarının, saplarının, köklerinin ve diğer bitki organlarının eksplantları üzerinde oluşabilir. Sürgünlerin doğrudan eksplantlardan elde edilmesi bazı durumlarda bitki klonlama için kullanılır, ancak bu genetik olarak dengesiz bitkilerle sonuçlanabilir. Bu nedenle, bu bitki rejenerasyon yöntemi genetik olarak çeşitli bitkileri teşvik etmek için kullanılabilir.
Yenileyici sürgünler yaprak ayasının çeşitli kısımlarından oluşturulabilir, ancak dokular en büyük yenilenme yeteneğine sahiptir.
Yaprağın tabanı, çünkü en aktif meristematik hücreler yaprak bıçağının bu bölgesinde bulunur. Yaprakların morfogenetik potansiyelinin gövdenin üst kısmına doğru konumlandıkça arttığını da hesaba katmak gerekir. Maceracı sürgünler, gelişen yaprakların genç meristematik dokusundan daha iyi yenilenir. Ancak daha yaşlı yapraklar kullanıldığında genetiği değiştirilmiş sürgünlerin ortaya çıkma olasılığı çok daha yüksektir.
Kiraz, tatlı kiraz, şeftali, kayısı gibi sert çekirdekli meyve bitkilerinin sürgünlerini ilk eksplantlardan (tüm yapraklar ve bunların bölümleri) yenilemek için çeşitli ortamlar kullanılır: Murashige-Skoog (MB), Lloyd ve McCown (WPM), Driver ve Kuniyuki (DKW), Kuren ve Lepoiv-ra (QL).
Kirazların tesadüfen yenilenmesine ilişkin deneyler için, çoğunlukla Lloyd ve McCown'un odunsu bitkiler için ortamı - çeşitli büyüme uyarıcılarıyla desteklenen Woody Plant Medium (WPM) kullanılır. Sitokininlerden esas olarak 6-BAP, tidiazuron (TDZ) kullanılır ve oksinlerden - NAA, IBA, 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) kullanılır.
Yabancı araştırmacılar arasında sürgün rejenerasyonunda TDZ kullanımının BAP'a kıyasla etkinliği, eksplant türü (tüm yapraklar, üzerlerine enine kesimler uygulanmış veya bölümlere ayrılmış) ve yetiştirme yöntemi konusunda fikir birliğinin bulunmadığına dikkat etmek önemlidir. eksplantlar (abaksiyel veya adaksiyel yüzey yukarı).
2,27 veya 4,54 |M TDZ + 0,27 | M NUK ile takviye edilmiş WPM ortamı üzerine abaxis (alt) yüzey yukarıya yerleştirilen bütün kiraz yaprağı eksplantlarında (yaprağın orta damarı boyunca enine kesimlerle) yüksek bir rejenerasyon yüzdesi gözlendi.
Öte yandan çalışma, kiraz ve tatlı kiraz yapraklarından bitki rejenerasyonunda BAP'ın TDZ'den daha etkili olduğunu ve ayrıca 2 mg/l ve 1 mg/l konsantrasyonunda BAP ve NAA'nın en uygun kombinasyon olduğunu gösteriyor. kiraz bitkisi büyüme düzenleyicileri ve kirazlar. MS, QL ve DKW ortamından daha fazla kallusogenezi uyarmasına rağmen en yüksek rejenerasyon frekansı WPM ortamında elde edildi. Kallus oluşumunun etkinliğinin yaprak segmentlerinin türüne bağlı olduğu ortaya çıktı. Böylece en yüksek kallus oluşumu oranları orta yaprak segmentlerinde kaydedildi; en düşük olanı apikal segmentlerde ve baz segmentlerinde doğrudan rejenerasyon (kallus oluşumu olmadan) kaydedildi.
Yaprak eksplantları, değiştirilmiş DKW ortamına kıyasla TDZ ile takviye edilmiş WPM ortamında yetiştirildiğinde, siyah kirazın (Prunus serótina Ehrh.) maceracı rejenerasyonu daha sık meydana geldi.
Yabani kirazın (Prunus avium L.) tesadüfi rejenerasyonunun verimliliği, eksplantın boyutundan önemli ölçüde etkilenmiştir. Sonuçlar, yaprak eksplantının boyutunun maceralı sürgünlerin oluşumu için kritik olduğunu gösterdi; 3-5 mm uzunluğundaki yapraklar en fazla sayıda maceracı sürgünü oluşturdu. Yabani kirazların gelişigüzel rejenerasyonu için, 0,54 tM NAA ve 4,4 tM TDZ ile desteklenen WPM ortamı kullanıldı.
Yetiştirme öncesinde özel bir ön işlem (bir gün boyunca 5 mg/L 2,4-D ile ıslatma), kiraz yaprağı eksplantlarından tesadüfi sürgünlerin tetiklenmesinde etkili olmuştur. Yaprak eksplantlarının 5 mg/l TDZ ile takviye edilmiş WP rejenerasyon agar ortamında daha sonra yetiştirilmesi, kiraz tesadüfi rejenerasyonunun verimliliğini arttırdı. Genç kiraz yaprağı eksplantları eskilere göre daha yüksek bir yenilenme yeteneği gösterdi.
Etilen inhibitörlerinin çeşitli kayısı çeşitlerinin yapraklarının tesadüfen yenilenmesi üzerindeki önemli etkisine dikkat etmek gerekir. Örneğin çalışma, etilen inhibitörlerinin (gümüş tiyosülfat veya aminoetoksivinilglisin) düşük kanamisin içeriğiyle birlikte kullanılmasının tesadüfi rejenerasyonu %200'den fazla arttırdığını gösterdi. Saf agar kullanımı aynı zamanda agar jeli veya agaroz kullanımına kıyasla kayısı yapraklarının yenilenmesini de arttırmıştır. Bu çalışmada LQ, DKW medyası, TDZ ve NUK ile desteklenmiş çalışmalar yapılmıştır. Yaprak yetiştirme yöntemi ortama eksenel yüzeyle yapılır.
İtalyan araştırmacılar, 6-BAP ve NAA ile desteklenen ortamda karanlıkta inkübe edilen bütün şeftali yapraklarından tesadüfi bir rejenerasyon yöntemi geliştirdiler. Çalışmalarda MS, Quoirin, Rugini ve Muganu'ya göre çeşitli ortamların makrotuzları ve mikrotuzlarının kombinasyonları, hem sitokininler - 6-BAP ve TDZ hem de rejenerasyon ortamı ile temas halinde olan adaksiyel yüzey - yaprakları yetiştirme yöntemi kullanıldı. Yaprak saplarının tabanında kallus gelişti. Oksin içermeyen bir ortama aktarıldıktan ve ışıkta ekimden sonra bu kallus üzerinde maceracı sürgünler ortaya çıktı. Kallusun morfogenetik yeteneği birkaç ay boyunca muhafaza edildi. Bu çalışmalarda şeftali adventif sürgünleri dolaylı morfogenez yoluyla ortaya çıkmıştır.
Dolaylı morfogenez, tomurcukların kallus dokularından ikincil farklılaşmasını içerir. Daha sonra sürgünlerin oluşturulduğu kallus oluşturmak için çeşitli eksplantlar kullanılır. Çok yıllık bitkilerden morfojenik kallus elde etmek için sürgün uçları veya bunlardan izole edilen meristematik doku bölümleri alınmalıdır. Bu sistem, genetik istikrarsızlık nedeniyle bitkilerin in vitro mikro çoğaltılması için önerilmez. Dolaylı morfogenez, somaklonal değişkenliğin incelenmesi ve somaklonal varyantların elde edilmesi için önemlidir.
İngiltere'de Maidstone Deney İstasyonu'nun Fizyoloji Bölümü'nde Colt kirazı anaçlarındaki gövde ve yaprak kalluslarından bitki rejenerasyonu araştırıldı. Kallus başlatma, 2.0-10.0 mg/1 NAA içeren Mu-rasige-Skoog ortamı üzerinde gerçekleştirildi. Ortaya çıkan kallus, 0,5 mg/1 konsantrasyonda BAP içeren bir rejenerasyon ortamına aktarıldı. Bu kiraz anacı üzerinde kalluslardan sürgünlerin yeniden üretilmesi mümkün olmuştur.
I.V. Michurin adını taşıyan Merkezi Genetik Laboratuvarı'nda, yıllık kiraz sürgünlerinden elde edilen pasajlı kallus dokularının kültüründe kök oluşumu gözlemlendi. Büyüme düzenleyicileri içeren bir ortama yeniden tohumlama yapıldığında meristematik oluşumların görünümü gözlendi.
Somatik embriyogenez
Bitkilerin in vitro mikroklonal çoğaltılmasının bir başka yöntemi, somatik embriyogenezdir - somatik (üremeyen) hücrelerden embriyo benzeri yapıların oluşma süreci. Somatik bir embriyo, fiziksel olarak dokuya bağlı olmayan, kök ve kök uçlarının aynı anda geliştiği bir yapının oluştuğu bağımsız bir bipolar yapıdır.
Hücre, doku ve organ kültüründe somatik embriyoların oluşumu doğrudan veya dolaylı olarak gerçekleşebilir. Doğrudan somatik embriyogenez, ara kallus oluşumu aşaması olmaksızın eksplant dokusunun bir veya birkaç hücresinden bitkisel bir embriyonun oluşmasıdır. Dolaylı embriyogenez birkaç aşamadan oluşur: eksplantın kültüre yerleştirilmesi, ardından kallus büyümesinin uyarılması ve kallus hücrelerinden ön embriyo oluşumu, ön embriyolardan bipolar embriyoların oluşumu için kallusun büyüme faktörleri olmayan bir besin ortamına aktarılması.
Çalışmada kiraz anaçlarının köklerinden elde edilen kalluslardan bitki rejenerasyonunun mümkün olup olmadığı araştırılmıştır. Kallus, kiraz filizlerinin mikroklonlanması sırasında kesilmiş köklerden veya steril koşullar altında yetiştirilen bütün bitkilerden elde edildi. Colt kirazı anaçlarında, sağlam bitkilerin köklerinden elde edilen kalluslar, sürgünler ve embriyoid benzeri yapılar oluşturmuştur. Kiraz kallusları BAP, HA ve NAA ile desteklenen Murashige-Skoog ortamında yetiştirildi. Sürgün oluşumunun sıklığı paralel olarak analiz edilen elma ağacınınkinden daha yüksekti. Rejenere bitkiler doku kültürü yoluyla çoğaltıldı ve toprağa nakledildi. Kiraz anaç kalluslarından elde edilen rejenere bitki fidelerinin fenotipi orijinal anaçlardan farklı olmamıştır.
Kiraz çeşitlerinde (Prunus cerasus L.) somatik embriyogenezin indüksiyonu, eksplantlar çeşitli oksin ve sitokinin kombinasyonları ile desteklenen Murashige-Skoog ortamında yetiştirildiğinde gözlemlendi. Somatik embriyogenez esas olarak 2,4-D ve kinetin kombinasyonu kullanıldığında meydana geldi. İndüktif ortama 0,1 mg/l IBA eklendiğinde somatik embriyogenezin indüksiyonu da kaydedildi. NAA veya 6-BAP kullanımı kiraz çeşitlerinde (Prunus cerasus L.) somatik embriyogenezin indüksiyonunu azaltmış ve dolaylı rejenerasyon sıklığını arttırmıştır.
Bugün, genetik olarak özdeş yavrular elde etmenin en güvenilir yolunun, somatik embriyogenez, adventif tomurcuklar ve dolaylı morfogenez ile karşılaştırıldığında, sert çekirdekli meyve mahsullerinin koltuk altı tomurcukları tarafından mikroklonal çoğaltılması olduğu düşünülmektedir.
1. Polevoy V.V., Chirkova T.V., Lutova L.A. ve diğerleri Bitki büyümesi ve dayanıklılığı üzerine çalıştay: Ders kitabı. St.Petersburg, 2001. S. 208.
2. Sorokina I.K., Starichkova N.I., Reshetnikova T.B., Grin N.A. Bitki biyoteknolojisinin temelleri. Bitki hücre ve doku kültürü: Ders kitabı. 2002. S. 45.
3. Chernets A.M., Abramenko N.M., Stakanova R.V. Meyve türlerinin ve çileklerin virüssüz klonlarının uzun süreli in vitro depolanması için bir yöntemin geliştirilmesi // Uluslararası konferansın özetleri: Kültürlenmiş hücrelerin biyolojisi ve biyoteknoloji. Novosibirsk, 1988.
4. Romanova N.P., Ulyanova E.K. Çilek meriklonlarının in vitro depolanması konusunda // N.I. Vavilov adını taşıyan Bitkisel Üretim Bilimsel Araştırma Enstitüsü'nün bilimsel ve teknik bülteni. L., 1990. Sayı. 204. s. 75-79.
5. Orlova S. Yu.Rusya'nın kuzeybatısındaki kiraz çeşitlerinin biyolojik özellikleri ve ıslah değeri: Yazarın özeti. dis. ...cand. biyol. Bilim. St.Petersburg, 2002. S. 20.
6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. İn vitro yetiştirilen kiraz ve tatlı kiraz sürgün uçlarının tek adımlı vitrifikasyonla dondurulması // Scientia Horticulturae. 1997. Cilt. 70. S. 155-163.
7. Vysotsky V. A. Meyve bitkilerinin izole edilmiş doku ve organlarının kültürü: şifa ve mikroklonal yayılım // Tarımsal biyoloji: Aylık bilimsel-teorik dergi. M., 1983. No. 7. S. 42-47.
8. Faustov V.V., Oleshko E.V., Zharkova I.V., Asadulaev Z.M., Sharafutdinov H.
B., İsmail H. Kirazların mikroklonal yayılımı // TSKhA Tutanakları. M., 1988. Sayı 5. s. 131-148.
9. Bitki biyoteknolojisi: hücre kültürü // Çev. İngilizceden V. I. Negruka / Ed. R. G. Butenko. M., 1989. S. 233.
10. Demenko V.I., Trushechkin V.G. İn vitro yöntemle kiraz yayılımı // Tarımsal biyoloji: Aylık bilimsel ve teorik dergi. M., 1983. No.7.
11. Kashin V.I., Borisova A.A., Prikhodko Yu.N., Surkova O.Yu., Upadyshev M.T. ve diğerleri Meyve ve meyve mahsullerinin virüssüz ekim malzemesinin elde edilmesine yönelik teknolojik süreç: Kılavuzlar. M., 2001. S. 97.
12. Shipunova A. A. Meyve bitkilerinin klonal mikro çoğaltılması: Yazarın özeti. dis. ...cand. tarım bilimleri. M., 2003. S. 24.
13. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Sert çekirdekli meyve bitkilerinin çeşitlerinin ve anaçlarının mikroklonal yayılımı: Kılavuzlar. M., 1983. S. 16.
14. Lane W. D. Armut bitkilerinin sürgün meristem uçlarından rejenerasyonu // Plant Sci. Edebiyat. 1979. Cilt. 16. Sayı 2/3. R.337-342.
15. FossardR. A., Bourne R. A. Ticari çoğaltma için doku kültürü maliyetlerinin azaltılması // Bahçecilik amaçlı doku kültürü. Acta Hort. 1977. Cilt. 78.R.37-44.
17. Oleshko E. V. Kiraz anaçlarının ve çeşitlerinin klonal mikro çoğaltılmasının özellikleri: Yazarın özeti. dis. ...cand. biyol. Bilim. M., 1985. S. 15.
18. Haak E.R., Nuust Yu.O. Sert çekirdekli meyve mahsullerinin klonal mikro çoğaltılması // Bahçecilik ve bağcılık. M., 1989. No. 1. S. 27-29.
19. Dudchenko O. P. İzole edilmiş erik meristemlerinin kültüründe rejenerasyon // Uluslararası "Kültürlenmiş Hücrelerin Biyolojisi ve Biyoteknoloji 2" Konferansının Özetleri. Novosibirsk, 1988. S. 358.
20. Kornatsky S.A., Vysotsky V.A., Trushechkin V.G. Sert çekirdekli meyve mahsullerinin klonal mikro çoğaltılmasının sorunları // RSFSR'nin Kara Toprak Dışı Bölgesinde meyve yetiştiriciliğindeki ilerlemeler: Toplama. ilmi İşler M., 1991.S.104-116.
21. Meyve ve meyve mahsullerinde morfogenezin ve doku seçiminin indüksiyonu: Metodolojik öneriler / Ed. V. E. Perfilyeva. 1996. S.73.
22. Svitaylo A. M., Bondarenko P. E., Shevchuk N. S. Anaçların ve meyve mahsulü çeşitlerinin klonal mikro çoğaltılması // Uluslararası "Kültiv Hücre Biyolojisi ve Biyoteknoloji 2" Konferansının Özetleri. Novosibirsk, 1988. S. 346.
23. Trushechkin V. G., Vysotsky V. A., Kornatsky S. A. Sağlıklı ekim materyali üretim sisteminde sert çekirdekli meyve bitkilerinin klonal mikro çoğaltılması // Uluslararası Konferansın Özetleri: Ekili Hücrelerin Biyolojisi ve Biyoteknoloji 2. Novosibirsk. 1988. s. 319-320.
24. Hammatt N., Grant N. J. Olgun İngiliz yabani kirazının mikro çoğaltılması // Bitki Hücresi, Doku ve Organ Kültürü. 1997. Cilt. 47. S.103-110.
25. Dzhigadlo M. I. Meyve ve meyve bitkilerinin seçimi ve çeşit ıslahında biyoteknolojik ve biyofiziksel yöntemlerin kullanılması: Tezin özeti. dis. ...cand. tarım bilimleri. Michurinsk, 2003. S. 25.
26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. Makroelementlerin konsantrasyonu, bunların alımı ve Gisela 5 kiraz anacının in vitro çoğalması arasındaki ilişki // Bitki Hücre Dokusu Organ Kültü. 2000. Cilt. 63. S. 9-14.
27. Kornatsky S. A. İyileştirilmiş ekim materyali sisteminde eriklerin klonal mikro çoğaltılmasının özellikleri: Tezin özeti. dis. ...cand. tarım bilimleri. M., 1991. S. 24.
28. Dzhigadlo M.I., Dzhigadlo E.N. Kirazların apikal meristem yöntemiyle çoğaltılması // Meyve ve meyve bitkilerinin yetiştirilmesinde çeşitliliğin ve ilerici yöntemlerin geliştirilmesi: Toplama. Tula, 1988. s. 65-68.
29. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Kirazların klonal mikro çoğaltılması için besin ortamının iyileştirilmesi // Meyve mahsullerinin agroteknik ve çeşitlilik çalışması: Toplama. ilmi İşler M., 1985. s. 72-76.
30. Chernets A. M. Mineral beslenmenin kiraz çeşitlerinin in vitro çoğalma yoğunluğu üzerindeki etkisi // Uluslararası “Ekili Hücrelerin Biyolojisi ve Biyoteknoloji 2” Konferansının Özetleri. Novosibirsk, 1988. S. 343.
31. Nedelcheva S., Ganeva D. Prunus // Rasten cinsinden üç bitkisel substrat üzerinde in vitro üreme. Bilimler. 1985. T. 22. No. 8. S. 98-104.
32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. İki Fransız kuru erik çeşidinin (Prunus Domestica L.) mikro çoğaltılması // Agronomie. 1984. Cilt. 4. No. 5. R. 473-477.
33. Vysotsky V. A., Oleshko E. V. Sert çekirdekli meyve bitkilerinin klonal mikro çoğaltılmasında mikro aşılamanın kullanımı // Tarımsal biyoloji. M., 1988. No. 4. S. 75-77.
34. Plaksina T.V. Altay'da kiraz yetiştiriciliğinde biyoteknolojinin kullanımı // Adını taşıyan NIISS'in 70. yıldönümüne adanan bilimsel ve pratik konferansın materyalleri. M. A. Li-savenko: Sibirya'da bahçeciliğin sürdürülebilir gelişiminin sorunları. Barnaul, 2003. s. 108-110.
35. Vysotsky V. A. Bazı büyüme düzenleyicilerin siyah frenk üzümünün izole meristematik tepeleri üzerindeki etkisi // Çernozem olmayan bölgenin meyve yetiştiriciliği ve meyve yetiştiriciliği: Toplama. M. 1979. Cilt IX. s. 101-107.
36.LutovaL. A. Yüksek bitkilerin biyoteknolojisi: Ders Kitabı. St.Petersburg, 2003. S. 227.
37. Vysotsky V. A. Meyve ve meyve bitkilerinin klonal mikro çoğaltılması sırasında genetik stabilite üzerine // Tarımsal biyoloji. 1995. No. 5. S. 57-63.
38. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Köklerin, sürgünlerin ve embriyoların yenilenmesi: fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler yönler // Biologia Plantarum. Cilt 39. No. 1. 1997. R. 53-66.
39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Tatlı ve vişne çeşitlerinin yapraklarından bitki rejenerasyonu // Scientia Horticulturae. 2002. Cilt. 93. S. 235-244.
40. Bhagwat B., David Lane W. Tatlı kiraz (Prunus avium) “Lapins” ve “Sweetheart” yapraklarından in vitro sürgün rejenerasyonu // Bitki Hücresi, Doku ve Organ Kültürü, Hollanda. 2004. Cilt 78. P. 173 -181.
41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Şeftalide maceracı sürgün rejenerasyonu // Bitki Hücre Raporları. 2002. Cilt. 20. S. 1011-1016.
42. Takashina T., Nakano H., Kato R. İn vitro yetiştirilen tatlı kirazın yaprak eksplantlarından verimli bitki rejenerasyon kültürü // Acta Horticulturae: XXVI Uluslararası Bahçıvanlık Kongresi: Ağaç Meyveleri ve Sert Kabuklu Yemişlerin Genetiği ve Islahı. R.622.
43. Burgos L., Alburquerque N. Etilen inhibitörleri ve düşük kanamisin konsantrasyonları, kayısı yapraklarından tesadüfi rejenerasyonu iyileştirir // Bitki Hücre Raporları. 2003. Cilt. 21. S. 1167-1174.
44. Hammatt N., Grant N. J. Prunus serotina Ehrh'nin yapraklarından sürgün rejenerasyonu. (kara kiraz) ve P. avium L. (yabani kiraz) // Bitki Hücre Raporları. 1998. Cilt. 17. S. 526-530.
45. Grant Neil J., Hammatt Neil. Yabani kiraz (Prunus avium L.) yapraklarından maceracı sürgün gelişimi // Yeni Ormanlar. Hollanda. 2000. Cilt. 20. S. 287-295.
46. James D. E., Possey A. J., Ma1hotro S. B. Elma ve kiraz anaçlarının kök ve yaprak dokularından elde edilen kalusta organogenez // Bitki Hücre Dokusu Organ Kültü. 1984. Cilt. 3. Hayır. 4.
47. Tyulenev V.M., Naftaliev N.M., Osipova L.V., Rastorguev S.L. Değerli meyve mahsulleri genotiplerinin klonal mikro çoğaltılması // Uluslararası Konferansın Özetleri “Ekili Hücrelerin Biyolojisi ve Biyoteknoloji 2”. Novosibirsk, 1988. S. 320.
48. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner ve Watkins R. Kiraz köklerinin Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) ve elma kökü stoğu M. 25'in (Malus pumila) kallus doku kültürlerinden bitki rejenerasyonu // The Journal of Bahçıvanlık Bilimi. İngiltere. 1984. Cilt. 59. No. 4. S. 463-467.
49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Üç vişne çeşidinin (Prunus cerasus L.) olgunlaşmamış embriyo kotiledonlarından somatik embriyogenez ve organogenez // Scientia Horticulturae. 2000. Cilt. 83. S. 109-126.
V. Rogovaia, M. Gvozdev
ÇEKİRDEKLİ MEYVE KÜLTÜRLERİNİN İN VITRO KLONAL MİKROOPAGASYONU
İnceleme, sert çekirdekli meyve kültürlerinin in vitro klonal mikro çoğaltılmasının ana aşamaları ve yöntemlerine odaklanmıştır. Yardımcı tomurcuk çoğaltma tekniği ve vişne, kiraz, şeftali ve kayısı yaprak eksplantlarından tesadüfi sürgün rejenerasyonu yöntemine özel önem verilmektedir. Virüs enfeksiyonlarına yönelik bitki materyali testinin bazı yönlerinin yanı sıra yayılma modeline bağlı olarak genetik stabilitenin korunmasına ilişkin bazı sorunlar da gözden geçirilmiştir.
Uzak hibridizasyonda in vitro fertilizasyon, embriyokültür (izole embriyoların yapay besin ortamında yetiştirilmesi), değerli hibritlerin klonal mikro çoğaltılması, in vitro haploid üretimi ve kriyoprezervasyon gibi izole doku kültürü yöntemleri kullanılmaktadır.
İn vitro fertilizasyon (programatik uyumsuzluğun aşılması) seçilen çiftler arasında doğal koşullar altında döllenmenin gerçekleştirilmesinin mümkün olmadığı durumlarda gerçekleştirilir. Bunun birkaç nedeni vardır: 1) fizyolojik (polen olgunlaşma zamanındaki tutarsızlık, vb.); 2) morfolojik (kısa polen tüpü veya gelişimin farklı aşamalarında büyümesinin engellenmesi, vb.). İn vitro fertilizasyon iki şekilde gerçekleştirilebilir: a) yumurtalığın, üzerine hazır polen uygulanmış yapay bir agar besin ortamı üzerinde yetiştirilmesi; b) yumurtalık açılır ve yumurtlu plasentanın parçaları, bitmiş polenin yakınında veya doğrudan plasental doku üzerinde yetiştirildiği besin ortamına aktarılır. Yumurtaların hızla artan boyutları sayesinde tüp bebek işleminin gerçekleşip gerçekleşmediğini görsel olarak tespit edebilirsiniz. Oluşan embriyo, kural olarak hareketsiz bir duruma girmez, ancak hemen filizlenir ve melez bir nesile yol açar. İn vitro plasental gübreleme, kültür tütün çeşitleri N. tabacum'un yabani türler N. rosulata ve N. debneyi ile melezlenmesindeki uyumsuzluğun üstesinden gelmeyi mümkün kıldı ve M. F. Ternovsky ve arkadaşlarının (1976) deneylerinde türler arası tütün hibritlerinin elde edilmesini mümkün kıldı. , Shinkareva (1986) .
Evlilik sonrası uyumsuzluğun üstesinden gelmek. Uzak hibridizasyon sırasında evlilik sonrası uyumsuzluk döllenmeden sonra ortaya çıkar. Bu genellikle cılız, çimlenmeyen tohumların oluşmasıyla sonuçlanır. Bunun nedeni embriyo ve endospermin gelişim zamanındaki bir tutarsızlık olabilir. Endospermin zayıf gelişimi nedeniyle embriyo normal çimlenme yeteneğine sahip değildir. Bu gibi durumlarda, olgun ve cılız bir taneden bir embriyo izole edilir ve besin ortamında büyütülür.
Embriyoların yapay besin ortamında yetiştirilmesine embriyokültür adı verilir. Olgun bir embriyonun yetiştirilmesi için ortam, fizyolojik olarak aktif maddeler (örneğin, White ortamı) veya mineral tuzları ve sakaroz içeren başka herhangi bir madde eklenmeden basit olabilir. Daha uzak geçişlerde, embriyonun gelişimindeki bozukluklar, farklılaşma eksikliği ve yavaş büyüme ile ifade edilen erken aşamalarda zaten gözlemlenebilir. Bu durumda, embriyo kültürü iki aşamadan oluşur - farklılaşmasının devam ettiği embriyonun embriyonik büyümesi ve büyüyen embriyonun çimlenmesi. İlk aşama, çeşitli amino asitlerin, vitaminlerin ve hormonların eklenmesiyle yüksek sakaroz içeriğine sahip daha karmaşık bir ortam gerektirir.
Üremede embriyokültürün kullanılması son zamanlarda tahılların, tahılların ve diğer tarımsal ürünlerin uzak melezlerinin elde edilmesinde büyük önem kazanmıştır. Olgunlaşmamış embriyoların yetiştirilmesi yoluyla buğday-çavdar hibritlerinin veriminin arttırılmasının yanı sıra, buğdayın çavdar çimi ile hibritlenmesi sırasında eşey sonrası uyumsuzluğun üstesinden gelmek için embriyokültür kullanılmasının mümkün olduğu gösterilmiştir.
Embriyokültür yöntemi, sebze bitkilerinin türler arası hibridizasyonunda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Soğanlar için, embriyogenezin farklı aşamalarındaki hibrit tohumlardan in vitro abortif embriyoların yetiştirilmesine ve kısmen verimli türler arası hibritlerden embriyoların yetiştirilmesine yönelik yöntemler geliştirilmiştir. İzole edilmiş embriyoların kültürü, domates ve diğer sebze bitkilerinin yetiştirilmesinde kullanılır.
İn vitro domates embriyolarının büyümesi ve gelişmesinin hormonal düzenlenmesi araştırıldı. Uzak ayçiçeği hibritleri elde etmek için embriyokültür kullanma olasılığı tartışılmış, tozlaşmadan sonra farklı zamanlarda izole edilen ayçiçeği embriyolarının in vitro büyüme ve gelişimini kontrol eden faktörler araştırılmıştır.
Uzak hibridizasyon için yardımcı bir yöntem olarak izole edilmiş embriyoların kültürü, yalnızca postgamous uyumsuzluğun üstesinden gelmek için değil, aynı zamanda değerli hibritlerin mikro çoğaltılması amacıyla da kullanılır. Bu durumda mikro çoğaltma, kallus oluşumu, morfojenezin uyarılması ve kallus dokusundan rejenere bitkilerin üretilmesi yoluyla gerçekleşir. Olgunlaşmamış embriyoların klonlanması tekniği, değerli bitki genotiplerinin yaşam döngüsünün erken aşamalarında çoğaltılmasını mümkün kılar. Embriyo kültürünün kullanılmasının bir diğer olasılığı hücre seçiminde kullanılmasıdır.
Uzak melezlerin klonal mikro çoğaltılması. Embriyokültür, kusurlu embriyolardan hibrit bitki yetiştirmeyi mümkün kılar. Ancak hibrit bitkilerin verimi düşüktür ve hibritler çoğunlukla kısırdır. Bazen, örneğin karabuğdayı yetiştirirken, mahsulün çapraz tozlaşması nedeniyle yavrularda benzersiz genotiplerin çoğaltılması zordur. Bu nedenle araştırmacılar sıklıkla ortaya çıkan bitkileri çoğaltma ve koruma göreviyle karşı karşıya kalıyor. Klonal mikro çoğaltma yöntemi buna yardımcı olur. Hibritler, özellikle embriyoların yetiştirilmesiyle elde edilen, koltuk altı tomurcuklarının (steril sürgünlerin kesilmesiyle), tesadüfi tomurcukların veya kallus dokusundan bitkilerin rejenerasyonunun meristeminin gelişimini aktive ederek çoğaltılır.
Haploidlerin in vitro elde edilmesi ve ıslahta kullanılması. Haploid bitkilerin üremedeki rolü çok önemlidir. Bunları kullanmak, istediğiniz kombinasyonu hızlı bir şekilde bulmanızı sağlar ve çeşitlilik oluşturma süresini azaltır. Haploidler stabil homozigot çizgiler üretmek için kullanılır. Mutajenez için haploidlerin kullanılması da daha uygundur çünkü haploid seviyede resesif mutasyonların seçimi daha kolaydır.
Diploid bitkilerde mutasyonlar nadiren homolog kromozomlar üzerindeki her iki alelik geni de etkiler. Birey genellikle heterozigottur (iki gen farklıdır) ve yalnızca baskın (ama resesif değil) gen etkilenir. Mutasyonlar baskın olmaktan çok resesif olduğundan, tespit edilmeleri oldukça zordur. Her homolog kromozom çiftinden yalnızca bir çift içeren haploid bitkilerde mutasyonlar hemen ortaya çıkar. Haploid seviyedeki seçilim, yalnızca baskın değil aynı zamanda resesif özelliklerin de doğrudan seçilmesine olanak tanır.
Haploid bireyler kısırdır, ancak kolşisin kullanılarak kromozom setlerini yapay olarak ikiye katlamak ve diploid homozigot bitkiler elde etmek mümkündür.
Haploidler kendiliğinden ortaya çıkabilir ancak bunların kendiliğinden oluşma sıklığı çok düşüktür. Yapay olarak in vitro yöntemler kullanılarak büyük miktarlarda haploid bitki elde etmek mümkündür. İzole doku kültürü yöntemini kullanarak haploid elde etmenin üç yolu vardır:
androjenez - izole edilmiş anterlerden ve mikrosporlardan yapay bir besin ortamında haploid bitkilerin üretimi.
gynogenez - izole edilmiş yumurtalıklardan yapay bir besin ortamında haploid bitkilerin üretimi;
partenogenez, ebeveyn kromozomlarının uyumsuzluğu nedeniyle baba kromozomlarının kaybolduğu hibrit bir embriyodan haploidlerin üretilmesidir.
Baba genomundaki kromozomların yok edilmesi sonucu oluşan haploid embriyoidler yapay besin ortamlarında yetiştirilerek haploid bitkiler elde edilir. Istok ve Odesskaya-15 arpa çeşitleri, partenogenetik yöntemin izole embriyo kültürüyle birleştirilmesiyle olağan 10-12 yıl yerine dört yılda elde edildi. NPO Elita Povolzhya, yumuşak ve makarnalık buğday çeşitlerinden ve melezlerinden anter kültürü yöntemini kullanarak dört yıl boyunca homojenlik ve stabilite ile karakterize edilen 2,5 binden fazla dihaploid hat üretti.
Buğday, arpa, mısır, kışlık çavdar ve patatesin anterlerinin yetiştirilmesi yoluyla haploidlerin elde edilmesine yönelik teknolojinin geliştirilmesi devam etmektedir. Anter kültüründe haploid bitki oluşumunun iki olası yolu vardır. Birincisi polen tanelerinde embriyogenez yoluyla bitkilerin oluşmasıdır. Bu durumda embriyoidler, anterlerin içindeki polen taneciklerinden ortaya çıkar. Haploid bitkiler çimlenir ve üretirler. İkincisi ise anter hücrelerinden kallus oluşmasıdır. Daha sonra morfogenez sonucunda bitkiler kallus hücrelerinden yenilenir. Bu durumda, ortaya çıkan bitkiler her zaman haploid değildir ve sıklıkla ploidi bakımından farklılık gösterir. Poliploidleşmiş haploid hücrelerden mi yoksa kaynaşmış hücrelerden mi oluştukları tam olarak belli değil.
İn vitro elde edilen haploidler yalnızca pratik seçimde değil aynı zamanda genetik mühendisliği ve hücre seçimi çalışmalarında da kullanılabilir. Polen taneleri bazı durumlarda genetik dönüşüm deneyleri için protoplastlardan daha uygun nesnelerdir.
Bitki kriyoprezervasyonu
Somatik bitki hücrelerinin sıvı nitrojende (sıcaklık – 196° C) dondurularak saklanması, biyoteknolojide 20. yüzyılın 70'li yılların başından beri yaygın olarak gelişmeye başlayan yeni bir yöndür. Bu teknolojinin amacı, in vitro kültürde gen havuzunu korumak ve yetiştiricilere herhangi bir zamanda istenen özelliklere sahip bir genotip sağlamaktır: hibridizasyon için gerekli polen; dehidrasyonu tolere edemeyenler de dahil olmak üzere benzersiz ve tek tohumlar; in vitro morfogenez yapabilen farklı bitki türlerinin dönüştürülmüş, mutant, hibrit hücreleri; zigotik ve somatik embriyolar vb. Şu anda, 30'dan fazla türden kültürlenmiş hücreler, kallus kültürleri (yaklaşık 10 tür), izole edilmiş protoplastlar (8 tür), meristemlerin (25 tür) ve gövde uçlarının (13 tür) korunması için kriyoprezervasyon koşulları geliştirilmiştir. Bu yönde öncelik, Rusya Bilimler Akademisi Bitki Fizyolojisi Enstitüsü'ne ve özellikle de prof. başkanlığındaki doku kültürü ve morfogenez bölümüne aittir. R. G. Butenko.
Kriyoprezervasyon çalışması yaparken, öncelikle bitki hücrelerinin özelliklerini dikkate almak gerekir: küçük vakuollü ve düşük su içeriğine sahip küçük hücreleri seçin; Her bir durumda bitki hücrelerinin dondurulması ve daha sonra çözülmesi için yaklaşımlar geliştirin. Kriyoprezervasyon sırasında, donmuş hücre ve dokuların ozmotik stresten korunması ve hücre içinde buz kristallerinin oluşması ve büyümesi sonucu yapıların mekanik olarak tahrip edilmesiyle ilgili bir takım zorluklarla karşılaşılmaktadır. Aynı zamanda çözme ve ıslah sırasında yüksek hücre hayatta kalmasını sağlayacak koşulların doğru seçilmesi gerekir.
Bu yöndeki çalışmaların çeşitliliğine rağmen, hala kriyoprezervasyonun altında yatan genel teknikleri özetlemektedirler: hücrelerin dondurulmadan önce işlenmesi, kriyoprotektanların kullanımı, 0 ila –40° C aralığında belirli bir dondurma rejimine bağlılık (nadir durumlarda, aşağı -70° C'ye kadar) ve nesnelerin çözülmesi sırasında özel önlemler alınmalıdır.
Kriyoprezervasyon süreci genellikle hücre kültürünün donmaya hazırlanmasıyla başlar. Bu, hücrelerin çeşitli ozmotik olarak aktif maddeler içeren besin ortamlarında yetiştirilmesini içeren çeşitli yollarla başarılabilir: %2-6 konsantrasyonda mannitol veya sorbitol, amino asitler ve bunların arasında, her şeyden önce önemi olan prolin. Bitki hücrelerindeki bağlayıcı suyun yanı sıra γ-aminobütirik asit de yaygın olarak bilinmektedir.
Ozmotik ve mekanik stresten kaynaklanan hücre hasarını azaltan maddeler olan kriyoprotektörlerin seçimi, en az toksisite ve optimal etki ilkesine göre ampirik olarak gerçekleştirilir. Bilinen tüm kriyoprotektörler arasında, hücrelere kolayca nüfuz eden maddeler ayırt edilir: dimetil sülfoksit (DMSO, %5-10), gliserol (%10-20) ve ayrıca nüfuz etmeyen yüksek moleküler ağırlıklı polivinilpirolidon (PVP), dekstran, polietilen glikol (PEG) molekül ağırlığı 6000'dir.
Kriyoprezervasyon sırasında büyük önem taşıyan, 0 ila –40 ° C arasında doğru seçilmiş dondurma modudur. Kural olarak, tüm nesneler için donma hızı dakikada 0,5–1 ° C olarak ayarlanır ve tüm bu çalışmalar, özel ekipman üzerinde gerçekleştirilir. yazılımın donmasını sağlar. Bu tür cihazlar, Kriyobiyoloji ve Kriyotıp Enstitüsü'nde (Kharkov) pilot üretime sahip özel tasarımlı bir teknolojik büro tarafından üretilmektedir.
Böylece, yavaş dondurma ve kriyoprotektanların kullanılması, hücrenin serbest sudan arındırılmasını mümkün kılar ve -40° C'de hücreler tamamen dehidre olur, bu da daha fazla dondurmanın gerçekleştirilmesini, yani bitki materyali içeren ampullerin içine daldırılmasını mümkün kılar. sıvı nitrojen.
Malzemenin sıvı nitrojende depolanması pratik olarak sınırsızdır. Örneğin, Rusya Bilimler Akademisi Bitki Fizyolojisi Enstitüsü'nün kriyobankası, yaklaşık 20 yıldır sıvı nitrojende bulunan havuç hücrelerini, 10 yıldan fazla bir süredir patates meristemlerini vb. saklıyor.
Sıvı nitrojende depolamanın ardından hücre canlılığının çözülmesi ve test edilmesi, kriyoprezervasyon teknolojisinin son adımıdır. Dondurma yavaş yavaş, kademeli olarak yapılıyorsa, çözdürme mümkün olduğu kadar çabuk yapılmalıdır. Bunu yapmak için ampuller 40° ve bazen 60° C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirilir ve son buz kristali tamamen kaybolana kadar tutulur.
Çözüldükten sonra hücrelerin canlılığını belirlemek için en basit, en hızlı ve en tatmin edici yöntem kullanılır - hayati bir boyayla boyama (% 0,1 fenosafranin veya% 0,25 Evans mavisi çözeltisi), bunun sonucunda ölü hücreler boyanır, ancak canlı olanlar değiller. Son kriter, elbette, çözüldükten sonra yapay besin ortamında ıslah sırasında hücre büyümesinin ve bölünmesinin net bir şekilde yeniden başlamasıdır.
Sıvı nitrojende depolandıktan sonra hücrelerin bölünme yeteneğini kaybetmediği, bitki rejenerasyonunun, ikincil metabolitlerin (üretici hücreler) sentezinin üretkenliğinin vb. azalmadığı deneysel olarak gösterilmiştir. Böylece, Rusya Bilimler Akademisi Bitki Fizyolojisi Enstitüsü, patates yetiştiriciliğine yönelik STK'lar ile birlikte, dört patates çeşidinin meristemlerinin dondurularak saklanması için yöntemler geliştirdi ve depolanan meristemlerin %20'sinden bütün bitkilerin yeniden üretilme olasılığını gösterdi; alanda, büyüme oranları ve üretkenlik de dahil olmak üzere, geleneksel test tüpü bitkilerinden her bakımdan farklı değildi (S. Manzhulin ve diğerleri, 1982). A. S. Popov'un inceleme çalışmalarından kriyoprezervasyon tekniği hakkında daha fazla bilgi edinebilirsiniz.
Böylece bitki nesnelerinin dondurularak saklanmasına ilişkin teknoloji gelişmekte ve sürekli olarak iyileştirilmektedir. Kuşkusuz, bu teknolojinin bir geleceği var, çünkü bugün kriyobankalar yetiştiricilerin çalışmalarını önemli ölçüde kolaylaştırabilir ve onlara eski seleksiyon ve yabani türlerin yanı sıra nesli tükenmekte olan bitki türleri de dahil olmak üzere çeşit gen havuzunu yaygın olarak kullanma fırsatı verebilir.
İn vitro deneyler için, klinik olarak sağlıklı 11 insan gönüllünün ve termal yaralanması olan 36 hastanın tam kanı kullanıldı.
2.3. Araştırma Yöntemleri
2.3.1. İmmünolojik araştırma yöntemleri
2.3.1.1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin spontan ve indüklenmiş salgı aktivitesinin in vitro değerlendirilmesi
Çalışmanın amacı sağlıklı gönüllülerden ve termal yaralanması olan hastalardan sabah aç karnına alınan venöz kandı. Kan, 10 U/ml oranında heparin ile stabilize edildi. Mononükleer hücre fraksiyonu, Ficoll ve Verografin kullanılarak santrifüjleme (400 g, 45 dakika) yoluyla 1.077 g/ml yoğunluğa sahip bir gradyan yöntemi kullanılarak izole edildi. 1,077 g/cm3 yoğunluğa sahip bir ortam oluşturmak için %9'luk (ağırlık/hacim) Ficoll-400 (DiaM, Moskova) ve %60 resmi ürografin (Schering, Almanya) çözeltisi kullanıldı. Mononükleer hücrelerin yanardöner halkası, bir Pasteur pipeti ile ara fazdan alındı ve 689 g'de ortam 199 ile 5-7 dakika boyunca üç kez santrifüjleme yoluyla yıkandı. Yıkanan ve yeniden süspanse edilen hücreler, 1 107 hücre/ml konsantrasyonuna getirildi. Canlılıkları, %0,2'lik tripan mavisi çözeltisiyle boyanarak değerlendirildi; canlılığı en az %98'di.
Hücre kültivasyonu, 37 0 C sıcaklıkta, havada %5 karbondioksit içeren ortamda 1 saat süreyle gerçekleştirildi. Steril koşullar altında hücrelerin içerikleri aspire edildi, ardından yapışmayan hücrelerin Hanks solüsyonuyla çıkarılması için iki kez yıkandı. Daha sonra her kuyucuğa 250 µl %10 fetal sığır serumu ve 80 µg/ml gentamisin eklendi. Daha sonra hücreler, 37 0 C sıcaklıkta, havada %5 karbondioksit bulunan bir termostatta 72 saat boyunca kültürlendi ve süpernatandaki sitokinlerin konsantrasyonu belirlendi.
2.3.1.2. Doğuştan bağışıklık araştırması
Lökosit sayısının ve lökosit formülünün belirlenmesi. Periferik kandaki lökosit sayısı, Goryaev odasında genel kabul görmüş melanger yöntemiyle belirlendi. Lökosit formülü, metil alkol ile sabitlenmiş ve Romanovsky-Giemsa'ya göre azure II-eozin ile boyanmış kan yaymalarında hesaplandı. Eozinofiller, bazofiller, metamiyelositler, bant ve segmentli nötrofiller, lenfositler ve monositlerin farklılaşmasıyla 200 lökosit sayıldı. Miktarları bağıl (%) ve mutlak (109/l) değerlerle ifade edildi.
Fagositlerin fonksiyonel aktivitesi NCT testi ve fagositoza göre incelenmiştir.
Periferik kan fagositlerinin emilim kapasitesinin incelenmesi lateks parçacıklarının emilimi modeli üzerinde gerçekleştirildi. Fagositozu değerlendirmek için 200 ul kan, 20 ul monodispers (çap 1.7 um) polistiren lateks parçacıkları süspansiyonu ile karıştırıldı. 37 0 C sıcaklıkta 60 dakika inkübasyondan sonra kurutulan, metanol ile sabitlenen ve Romanovsky-Giemsa'ya göre Azur II - eozin ile boyanan süspansiyondan preparatlar hazırlandı. Daldırma mikroskobu kullanarak, fagositoz aktivitesini - en az bir lateks parçacığını yakalayan hücrelerin yüzdesi, fagositozun yoğunluğunu - sayılan 100 hücrede emilen lateks mikrokürelerin sayısını ve fagositik sayı - emilenlerin sayısını - hesaba kattık. fagosit başına lateks mikroküreler.
NST testi A.N.'nin yöntemine göre nitroblue tetrazolium'un (NBT) fagositler tarafından çözünmeyen formuna - diformazan'a indirgenmesinin yoğunluğu dikkate alınarak gerçekleştirildi. Mayasky ve M.E. Wixmann (1979). Spontan ve indüklenmiş NBT testleri yapıldı.
0,1 M fosfat tamponu (pH 7,4) içindeki standart olarak seyreltilmiş nitromavi tetrazolyumun 0,1 ml %0,2'lik çözeltisi, 0,2 ml kan içeren test tüplerine ilave edildi. İndüklenmiş NBT testini değerlendirmek için, her bir oyuğa 20 ul monodispers (çap 1,7 μm) polistiren lateks parçacıkları (indüklenmiş seri) veya 20 ul %0,9 NaCl (spontan seri) süspansiyonu ilave edildi. 37 0 C sıcaklıkta 30 dakikalık bir inkübasyonun ardından reaksiyonu durdurmak için reaksiyon karışımına 3 ml %0.1 hidroklorik asit ilave edildi. Tüpler 1000 devir/dakikada 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant sıvı atıldı ve çökeltiden yaymalar hazırlandı. Kurutulduktan sonra preparatlar metanol ile sabitlendi ve 5 dakika boyunca %0,1 sulu safranin çözeltisi ile boyandı. 90x10x1,5 büyütmede mikroskopi kullanılarak, NBT'yi geri yükleyen hücrelerin yüzdesi ve NBT restorasyonunun aktivitesine dayalı reaksiyonun yoğunluğu belirlendi; bunun için NBT-pozitif hücreler 3 gruba ayrıldı:
1 - toplam alanı nükleer alanın 1 / 3'ünden daha az olan sitoplazmada diformazan granülleri bulunan hücreler;
2 – sitoplazmada nükleer alanın 1/3'ünde diformazan granülleri bulunan hücreler;
3 – diformazan granülleri çekirdeğin boyutunu aşan hücreler.
Reaksiyon şiddet katsayısını elde etmek için birinci gruptaki yüzde olarak ifade edilen hücre sayısı 1 ile, ikinci gruptaki hücre sayısı 2 ile, üçüncü gruptaki hücre sayısı 3 ile çarpılarak sonuçlar toplanıp 100'e bölündü.
Hücreler sadece in vivo olarak değil aynı zamanda in vitro olarak da yaşlanır. Dahası, in vitro koşullar altında, bu koşullar altında yaşlanmalarında doğal ve görünüşe göre tek faktör olan hiperoksinin rolü özellikle açıkça ortaya çıkmaktadır.
1.8.1. Bilindiği gibi, hücrelerin vücut dışında yetiştirilmesi, özel kaplarda (şişeler) atmosferik basınçta ve dolayısıyla pO2'de normalde vücutta belirlenen değerleri önemli ölçüde aşarak gerçekleştirilir. Tipik olarak inkübasyon sıvısındaki pO2, havanın pO2'sine yakındır. O2 molekülleri, flakondaki ince bir besin ortamı tabakası aracılığıyla hücrelere serbestçe yayılır ve içlerinde yüksek bir pO2 oluşturulur; bu, in vivo olarak imkansızdır veya her durumda izin verilen değerleri aşar.
Yaşlanmanın oksijen-peroksit kavramı açısından bakıldığında, in vitro koşullar hücre yaşlanma sürecini incelemek için fazlasıyla uygun görünmektedir, çünkü bu koşullar altında yaşlanma daha yoğun, daha hızlı ve daha da önemlisi "bir" şekilde meydana gelir. saf” form, yani in vivo yaşlanma sırasında ortaya çıkan vücut sistemlerinin herhangi bir etkisinin tamamen yokluğunda. Bu durum, yaşlanmayla ilgili birçok teoriyi derhal ikincil veya tamamen spekülatif kategoriye sokar, çünkü yaşa bağlı değişiklikler, kendilerinde öne sürülen hükümlerin uygulanması olmadan meydana gelebilir veya meydana gelebilir. İn vitro hücre yaşlanması olgusuna verdiğimiz önem, yaşlanmanın fizikokimyasal temellerini ve genel olarak bu sürecin biyolojisinin özünü daha iyi anlamanın bu "basit" koşullar altında mümkün olacağı gerçeğinden kaynaklanmaktadır. hızlı ve daha az zorlukla.
Ancak şu anda, literatürdeki karşıt bakış açılarının da gösterdiği gibi, hücre kültürlerinin yaşlanması ve çok hücreli bir organizmada hücrelerin yaşlanmasının ortak nedenleri ve mekanizmaları hakkında bir fikir birliği yoktur (Kapitanov, 1986). Örneğin Kanungo (1982), bir organizmanın yaşlanmasının nedeninin hücrelerin yaşlanması olduğuna inansa da aynı zamanda şuna da inanmaktadır: “in vitro koşullar fizyolojik olanlarla örtüşmemektedir ve hücrelerin özellikleri farklı olabilir. değiştirilmeli. İn vitro çalışmalar hücrenin kendisi hakkında bazı yararlı bilgiler sağlarken, organizmanın bir bütün olarak yaşlanması söz konusu olduğunda değeri sınırlıdır." Yukarıdaki ifadeye ancak kısmen katılabiliriz. Gerçekten de, in vitro hücre yaşlanması, tüm organizmada her düzeyde meydana gelen yaşa bağlı değişikliklerin tüm karmaşık spektrumunu yansıtamaz ve dahası, büyük ölçüde geri bildirimler de dahil olmak üzere içindeki çeşitli bağlantıların sistemi tarafından belirlenir. İn vitro koşullara uygulandığında, organizma düzeyinde kendini gösteren bir dizi yaşlanma ilkesi anlamını yitirir (bkz. bölüm 1.1.2), ancak bunlardan bazıları hücre kültürlerinde işlemeye devam eder. Bunlar özellikle yaşlanma sürecinin çok odaklı doğasıdır; hücrenin farklı kısımlarında veya farklı moleküler döngülerinde hasarın gelişmesi ve aynı kültür tipindeki hücreler arasında yaşlanmanın heterokronisi. Ayrıca bu koşullar altında geri dönüşümsüzlük, düzensiz ve sürekli hücresel yaşlanma ilkelerinin de açıkça kendini göstermesi gerekir.
Gerontolojinin ana görevlerinden birinin, tüm canlı organizmaların yaşlanmasını önceden belirleyen ana birincil çevresel faktörü oluşturmak olduğunu akılda tutarsak, vücut dışındaki hücre yaşlanmasının incelenmesindeki yukarıdaki eksiklikler temel görünmüyor. Böyle bir faktörün dünya atmosferindeki hiperoksi olduğuna inanıyoruz, dolayısıyla hücrelerin in vitro yaşamı, bu özel fiziksel faktörün yaşlanma üzerindeki etkisini incelemek için uygun bir deneysel model olarak düşünülebilir. Havadaki olağan %18-21 O2 içeriği ve buna bağlı olarak yüksek seviyelerde dengesizlik Δ (PO - AO) ve peroksijenaz süreçleri, hücre altı elementler, normal fizyolojik ve metabolik süreçler üzerinde baskılayıcı bir etkiye sahiptir. Sonuç olarak, ikincisi yavaş yavaş kaybolur ve çoğu hücre, oksidatif sitoliz veya apoptozun oksijen-peroksit mekanizması nedeniyle ölür (bkz. Bölüm 7.1).
Aşırı pO2, ROS ve LPO'nun in vitro hücre sağkalımını azaltmada öncü rolünü ve çeşitli antioksidan faktörlerin koruyucu etkisini gösteren fazlasıyla kanıt vardır (Branton ve diğerleri, 1998; Drukarch ve diğerleri, 1998; Heppner ve diğerleri. 2004). , 1998). L-karnosin yakın zamanda ikincisinden biri olarak sınıflandırıldı. Standart ortamlara fizyolojik konsantrasyonlarının eklenmesi, insan fibroblastlarının in vitro ömrünü uzatır ve içlerindeki fizyolojik yaşlanma süreçlerini yavaşlatır. Karnosin içeren ortama aktarıldıktan sonra normal ortamda uzun süre bekletilen hücreler gençleştirici etki gösterdi. Optik izomer D-karnosin bu özelliklere sahip değildi (Halliday ve McFarland, 2000).Aynı zamanda, uzun süreli yetiştirme sırasında hücrelerin belirli bir yüzdesi yalnızca bozulmakla kalmaz, aynı zamanda toksik oksidatif koşullara uyum sağlayarak, Hücre içi parametre Δ (PO - AO)'nun yüksek ΔA2 veya ΔC değerlerine yükselmemesini, ancak malign dönüşümleri için gerekli olan biraz daha düşük bir ΔK seviyesinde durabileceğini "başarın". Kültürdeki hücrelerin “kendiliğinden” malignite vakaları ve bunun olası mekanizması Bölüm 4'te ayrıca tartışılmaktadır.
1.8.2. Yukarıdaki hususlar, in vitro hücre yaşlanmasının nedenleri ve sonuçlarına ilişkin teorik ilkelerimizin bir parçası olarak düşünülebilir. Bu hükümleri doğrulamak ve geliştirmek için, içeriği ve anlamı hücre yaşlanmasının oksijen-peroksit kavramına kolayca "uydurulabilecek", önceden bilinen bazı gerçeklerden yararlanmak doğaldır. Yukarıda açıklanan, kendileri için toksik olan hücrelerin kültürlenmesine yönelik geleneksel koşulların, gaz ortamındaki O2 konsantrasyonunun yapay olarak azaltılmasıyla hafifletilebileceği gerçeğiyle başlayalım. Aynı zamanda hiperoksinin engelleyici etkisi ve hücre yaşlanma hızı da azalmalıdır. Hayflick limiti gibi iyi bilinen bir biyolojik sabitin aslında gaz ortamındaki O2 içeriğine bağlı olarak değişken bir değer olduğu ve oksidatif stres koşulları altında bu limitin azaldığı ve pO2 azaldıkça tam tersine artar (Chen ve ark. 1995).
Aslında, bir fibroblast kültürünü düşük O2 içeriğine sahip (%10) bir atmosferde tutmak, ömrünü %20-30 oranında uzatır. Aynı şey insan ve fare akciğer hücrelerinde de olur (Packer ve Walton, 1977). Ortamdaki O2 içeriği %1,6 veya %12'ye düştüğünde, farklı başlangıç popülasyon seviyelerine sahip insan diploid fibroblastları IMR90'ın proliferatif canlılık periyodu iki katına çıkar. %1 O2'deki bu süre %22 artar ve kültürlerin %1 O2'li ortamdan %20 O2'li ortama dönüşü hızla yaşlanmasını geliştirir. Werner sendromlu (erken yaşlanma) bir hastadan alınan diploid fibroblast kültüründe, replikatif canlılığın süresi de pO2'deki azalmayla birlikte artar (Saito ve diğerleri, 1995). Kontrole (%18) kıyasla atmosferdeki %8 O2 içeriğinde kültürlenmiş civciv embriyosu kondrositlerinin yaşlanmasında bir yavaşlama olduğu gösterildi ve deney hücreleri "genç" özelliklerini daha uzun süre korudu ve daha yüksek bir çoğalma oranına sahipti (Nevo) ve diğerleri, 1988). Çeşitli antioksidanların etkisi altında, hücre kültürlerinin çoğalma hızı da artar ve yaşlanmaları yavaşlar (Packer ve Walton, 1977; Obukhova, 1986), bu da yukarıda söylenenleri doğrular: oksidanların açıkça aşırı etkisi baskılar. Hücre proliferasyonu ve onların daha hızlı yaşlanmasına neden olur.
Hücre kültürleri ile yapılan deneylerde, solunum enzimlerinin (Murphy ve diğerleri, 1984; Suzuki ve diğerleri, 1998) ve mitokondrinin (Ozernyuk, 1978) sayısını düzenlemek için O2'ye bağlı mekanizmanın etkisini test etmek de nispeten kolaydır. . Bu mekanizmaya göre, hiperoksi seviyesindeki yumuşak ve yavaş bir artışla, bu tür enzimlerin içeriği ve mitokondri sayısı giderek artmalı, hipoksi ile ise tam tersine düşmelidir. Aslında, bir fibroblast kültürü azaltılmış O2 içeriğine sahip bir ortamda büyütüldüğünde sitokrom konsantrasyonu önemli ölçüde azalır (Pius, 1970). Burada elbette solunum sisteminin hücre içi pO2 seviyesine adaptasyonunun objektif süreci söz konusudur. Bununla birlikte, bu fenomende, kültürlenmiş hücrelerin yaşlanma yoğunluğunun bağlı olacağı adaptasyon hızı daha az önemli değildir. Çok hücreli bir organizmanın, biyolojik evrim sürecinde, dünya atmosferindeki pO2'nin kademeli artışına da kademeli olarak uyum sağladığı açıktır. Aynı zamanda hücrelerin içindeki "mitokondriyal" adaptasyon mekanizmasının en etkili olduğu düşünülebilir: Solunum zincirindeki enzimlerin sayısı ve mitokondri kendi kendini organize eden bir sisteme göre değişir, böylece bütünlüğü ve nispeten normal işleyişi sağlar. hücre içi pO2 evrimsel olarak kanıtlanmış belirli sınırlar dahilinde değiştiğinde hücrelerin.
Hücreler canlı bir organizmadan in vitro koşullara hızlı bir şekilde aktarıldığında tamamen farklı bir durum ortaya çıkar. Bunların bir hiperoksi durumuna keskin bir şekilde aktarılması, onlara genel olarak hazırlıklı olmadıkları önemli bir ani rahatsızlık vermekle eşdeğerdir. Birincil hücre kültürü böyle bir rahatsızlığa nasıl tepki verir? Görünüşe göre, belirli bir başlangıç döneminde kültür ortamı hücreler için "streslidir" ve hücrelerin bu dönemdeki durumu şoktur. Daha sonra bu aşırı koşullarda mümkün olan antioksidan nitelikteki uyarlanabilir "olayların" hazırlanması ve gerçekleştirilmesi için biraz zaman harcanır. Muhtemelen, ikincisinden dolayı, ilk başta sadece oksidatif bozulmayı önlemek değil, aynı zamanda proliferatif süreci uyarmak için koşullar yaratmak, başlangıçta yüksek, açıkça "sitotoksik" hücre içi dengesizliği ΔC'yi (PO - AO) gerekli olana azaltmak mümkündür. Oksidatif mitogenez için. Bununla birlikte, birincil kültürün yaşamının bu aşaması, onu sürekli baskılayan hiperoksik ortamla sınırlı kalmaktan başka bir şey olamaz. Bu durumda adaptif mekanizmanın kendisi etkisiz hale gelmeye başlar, buna bağlı olarak antioksidan sistemin büyümesi azalır ve ardından ikincisinin gerilemesi meydana gelir. Yüksek düzeyde LPO'da öncelikle mitokondri hasar görür (bkz. bölüm 1.3), gaz ortamında pO2'nin kademeli olarak artması durumunda adaptif bir hareket olarak mitokondrilerin sayısı artmaya devam eder.
Bir yandan hücrenin adaptif mekanizmalarının aniden ortaya çıkan hiperoksiyi hızla ve tamamen nötralize edememesi, diğer yandan mitokondriyal ünitenin peroksidatif stres altında yüksek hassasiyeti, "bir" olaydan sonra geri dönüşü olmayan hücre dejenerasyonu sürecini belirler. içlerinde kritik düzeyde hasar var. Burada bir kez daha belirtmekte fayda var: O2'nin ana tüketicisi olan ve bu anlamda hücrenin antioksidan sistemindeki ana anti-oksijen koruma seviyesi olan mitokondrideki yıkıcı değişiklikler, zorlu koşullar altında çoğu hücre için hayatta kalma umudu bırakmaz. vitro, çünkü bu durumda adaptasyonun kendisi bozulur - hücre içi pO2 ve LPO seviyelerini azaltmaya yönelik aktif mekanizma. Yukarıdaki düşünceler, in vitro kültürlenen fibroblastlarla ilgili olarak ileri sürülen yaşlanma mekanizmasının başlatılmasında mitokondrideki değişikliklerin birincil rolü ile tamamen tutarlıdır (Kanungo, 1980).
Peroksidatif stres ve in vitro toksik etki, Fe2+ veya Cu2+ iyonları gibi LPO katalizörlerinin kültür ortamına dahil edilmesi durumunda daha da arttırılabilir. Aslında, yetiştirme ortamına 60 mg/l konsantrasyonda bakır sülfatın eklenmesi, rotiferlerin ortalama ömründe %9 oranında önemli bir azalmaya ve aynı zamanda MDA miktarında, ekim ortamına kıyasla önemli ölçüde daha belirgin bir artışa yol açmıştır. kontrol. Bu deneyin yazarları (Enesco ve diğerleri, 1989) mantıksal olarak yaşam beklentisindeki azalmanın bakır iyonları tarafından serbest radikal üretim süreçlerinin hızlandırılmasından kaynaklandığına inanmaktadır. Belirtilen bakır sülfat konsantrasyonunun optimal olduğu ortaya çıktı, çünkü daha yüksek konsantrasyonlar (90 ve 180 mg/l) rotiferler için çok toksikti ve daha düşük konsantrasyonlar (30 mg/l) etkisizdi.
Bu nedenle, ortamda in vivodan in vitroya keskin bir değişiklik sırasında hücrelerin geri dönüşü olmayan hızlandırılmış yaşlanması ve oksidatif bozulması, ciddi olumsuz sonuçlar olmadan oksijen maruziyetindeki bu kadar dik bir artışı kabul etmeye yetersiz hazırlıklarının bir sonucudur. Yeni koşullara bu kadar keskin bir geçişin yerini "yumuşak" bir geçiş alırsa, örneğin çok aşamalı ve zamanla uzatılırsa, bu durumda hücrelerin giderek artan hiperoksiye uyum sağlama konusundaki doğal yeteneğinin tam olarak olmasını bekleyebiliriz. gerçekleştirilmiş. Üstelik prensip olarak bu şekilde, yalnızca atmosferdeki olağan% 18-21 O2 seviyesine değil, aynı zamanda onu önemli ölçüde aşan yapay olarak oluşturulan hiperoksik ortamlara da hücre adaptasyonu sağlamak mümkündür. Söylenenleri desteklemek için Welk ve arkadaşları tarafından elde edilen oldukça ikna edici gerçeklere atıfta bulunuyoruz. (Valk ve diğerleri, 1985). Artan O2 konsantrasyonlarına kademeli adaptasyonun bir sonucu olarak, yüksek O2 içeriğine dirençli ve atmosferdeki %99 O2'de bile çoğalabilen bir Çin hamsteri yumurtalık hücresi dizisi elde ettiler. Savunmanın tüm aşamalarının (anti-oksijen, anti-radikal ve anti-peroksit) bu kadar belirgin hiperoksiye ve buna bağlı süreçlere adapte olduğu ortaya çıktı (bu sonuçlar hakkında daha fazla ayrıntı için Bölüm 4'e bakın).
1.8.3. Yaşlanmalarında ve dönüşümlerinde ana aktif faktör olarak kültürlenmiş hücrelerdeki prooksidan-antioksidan dengesizliğindeki değişikliklerin özellikleri hakkında sunulan düşünceler kabaca grafiksel olarak gösterilebilir (bkz. Şekil 11). Hücrelerin in vitro ortama hızlı hareketi sırasındaki bu değişiklikleri yansıtan Eğri 1, literatürde bilinen adaptasyon (gizli) fazına, logaritmik büyüme fazına ve sabit faza karşılık gelen üç ardışık zaman aşamasını birbirinden ayırır. . Bu durumda hücre kültürlerinin yaşlanması genellikle durağan fazdaki süreçlerle ilişkilidir; burada zamanla yaşlanan bir organizma içindeki hücrelerde gözlenenlere benzer çeşitli değişikliklere uğrarlar (Kapitanov, 1986; Khokhlov, 1988). Özellikle in vitro hücre yaşlanması sırasında enzimler değişir ve bunların aneu- ve poliploidizasyonu meydana gelir (Re-macle, 1989). İn vivo hücreler gibi, kültürlenmiş hücreler de yaşlandıkça lipofusin granülleri biriktirir (Obukhova ve Emanuel, 1984), bu da lipitlerin ve proteinlerin yapısında peroksidasyon süreçlerinin ve oksidatif bozuklukların açık bir şekilde ortaya çıktığını gösterir. Bunlar ve diğer bazı gerçekler, yaşlanmanın oksijen-peroksit (serbest radikal) mekanizması hakkındaki hipotezle şu veya bu şekilde tutarlı olabilir. En önemlisi, bu mekanizma, antioksidan konsantrasyonu arttığında hücrelerin in vitro ömrünün daha uzun olduğu, azaldığında ise kontrole göre daha kısa olduğu verileriyle desteklenmektedir. Bu tür sonuçlar, örneğin insan fibroblastlarındaki GSH içeriğinin (Shuji, Matsuo, 1988), kültürlenmiş nöronlardaki katalaz ve SOD içeriğinin değiştirilmesiyle elde edildi (Drukarch ve diğerleri, 1998).
Şekil 2'deki düz ve nispeten düzgün şekilde artan eğrilere (2) gelince. Şekil 11'de gösterildiği gibi, bu tür doğaları, hücredeki dengesizliğin Δ (PO - AO) pro-oksidan bileşeninde yapay olarak oluşturulan her küçük artışın, biraz gecikmeyle antioksidandaki karşılık gelen adaptif bir artışın takip ettiği gerçeğiyle açıklanmaktadır. içindeki bileşen. Bu eylemin tekrar tekrar tekrarlanması, hiperoksi seviyesinde kademeli, adım adım bir artışla hücrelerin adaptasyonunu ve hayatta kalmasını sağlar.
Her iki durumda da hücrelerin "kendiliğinden" malignitesine yol açan varyantlara dikkat edelim (bkz. Bölüm 4). Bizim bakış açımıza göre bu fenomen, yalnızca dengesizliğin eşitsizliği istikrarlı bir şekilde karşılayan ΔK değerlerine ulaştığı hücrelerde gerçekleştirilebilir (bkz. Bölüm 1.1.2)
ΔP (PO – AO), veya daha kesin olarak “apoptotik” dengesizlikler dikkate alınarak – oran (bkz. paragraf 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) Bu tür prosedürlerin yardımıyla, vücut dışında uzun süre var olma kapasitesine sahip, sürekli dönüştürülmüş ve tümör hücreleri hatları oluşturulur. Düşündüğümüz sorunlar bağlamında yaşlanma ile karsinogenez arasındaki ilişkiyi incelemeye yönelik bir yaklaşıma karar vermek daha önemlidir. Bunlardan biri, yani normal hücre kültürlerinin yaşlanması sırasında tümör hücrelerinin ortaya çıkma sürecinin incelenmesi (Witten, 1986), en doğal ve bu nedenle tercih edilebilir gibi görünmektedir.
yaklaşmak. ΔK ve ΔC arasındaki aralıkta Δ (PO - AO) dengesizliği oluştuğunda, hücreler A2 tipi apoptozise uğrayabilir (bkz. bölüm 7.1.1).
Telomer teorisine göre, in vitro da dahil olmak üzere hücrelerin replikatif yaşlanması, her mitozdan sonra telomerlerin belirli bir minimum uzunluğa kadar kısalması ile ilişkilidir, bu da bu tür hücrelerin bölünme yeteneğinin kaybıyla sonuçlanır (bkz. bölüm 1.4.1). 3 ve 1.4 .4). Bu konuyla ilgili bilinen literatürün analizi, bu varsayımın bazı durumlarda doğrulanmadığını göstermektedir. Bu, Carman ve ark.'nın çalışmaları ile örneklendirilmiştir. (Carman ve diğerleri, 1998), diploid Suriye hamsteri embriyonik (SHE) hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Bu hücreler, 20-30 ikiye katlama döngüsünden sonra çoğalmayı durdurdu ve serumla uyarıldıktan sonra S fazına girme yeteneğini kaybetti. Aynı zamanda SHE hücreleri replikatif yaşam döngüsü boyunca telomeraz eksprese etti ve ortalama telomer boyutu azalmadı. İn vitro hücrelerin bazen telomer kaybıyla ilgili olmayan mekanizmalarla yaşlanabildiği ortaya çıktı.
Bize öyle geliyor ki bu durumda yetiştirme ortamındaki hiperoksi koşulları kendi ayarlamalarını yapıyor. Orta düzeyde artan seviyelerde ROS ve peroksidasyon sıklıkla pozitif işlevler gerçekleştiriyorsa, mitojenik sinyalin, replikasyonun, transkripsiyonun ve diğer süreçlerin ayrı ayrı aşamalarını aktive ediyor (bu, önceki birkaç paragrafta tartışıldı ve sonraki bazı paragraflarda bahsedildi) Daha sonra yoğun oksidatif stres durumunda olumsuz sonuçlar da kaçınılmazdır. Örneğin, mitogenezde rol oynayanlar da dahil olmak üzere bazı makromoleküller, telomeraz aktivitesi ve telomer uzunluğundan bağımsız olarak proliferasyonu inhibe edecek ve/veya bazı başka bozuklukları tetikleyecek, hatta hücre ölümüne yol açacak şekilde modifiye edilebilir.
Her ne olursa olsun, in vitro hücre yaşlanmasının iki nedeni (kültürde saklanma koşulları altında hataların birikmesi ve telomerlerin kısalması) hâlâ en olası neden olmaya devam ediyor. Her iki durumda da p53 ve Rb protein sistemlerinin aktive edildiğine ve fonksiyonları bozulduğunda hücre transformasyonunun meydana geldiğine inanılmaktadır (Sherr ve DePinho, 2000). Daha genel anlamda şunu görüyoruz: toksik hiperoksik yetiştirme koşulları altında, normal hücreler, yaşlanırken büyük olasılıkla A1 apoptozuna uğrar ve tümör hücreleri A2 apoptozuna uğrar. Apoptoz mekanizmasında sorun olması durumunda, ilki neoplastik dönüşüme uğrarken, ikincisi oksidatif sitolize uğrar (bkz. bölüm 7.1.1).
Hücrelerde in vitro oksidatif yıkım süreçlerinin yoğunlaşmasına katkıda bulunan ek bir neden, sürekli çalışan bir çevresel faktör olarak ısı olarak düşünülebilir. Aslında, oldukça hassas bir yöntem kullanılarak (yazarlar Bruskov ve diğerleri, 2001 tarafından açıklanmıştır), ROS'un ısının etkisi altında sulu çözeltilerde üretildiği gösterilmiştir. Suda çözünmüş atmosferik O2'nin termal aktivasyonu sonucunda bir dizi reaksiyon meydana gelir.
О2 → 1О2 → О 
→ HO2˙ → H2O2 → OH˙.
Ortaya çıkan ROS, görünüşe göre "oto-oksidasyon" yoluyla DNA'ya ve diğer biyolojik moleküllere termal hasara katkıda bulunuyor.
Son olarak, anoksi - reoksijenasyon prosedürünü kullanarak in vitro hücre yaşlanma sürecini yoğunlaştırmanın başka bir yoluna dikkat çekiyoruz; bunun sonuçları, bize göre, yaşlanmanın oksijen-peroksit modelinin özünü en açık şekilde yansıtıyor. Bu durumda yaşlanma mekanizmasının temeli iki temel etkiden oluşur: anoksi veya hipoksi döneminde mitokondriyal bazın uyarlanabilir azalması (zayıflaması) (yukarıya bakın); pO2'deki keskin bir artış (anoksi durumuna göre) ve aşırı O2'nin "anoksik" mitokondri tarafından hızlı kullanımının imkansızlığı nedeniyle sonraki reoksijenasyon sırasında LPO ve diğer oksidatif yıkım süreçlerinde önemli bir artış. Peroksidatif stresin derecesi ve dolayısıyla hücre yaşlanmasının hızı, anoksi durumunda kalma süresine bağlı olacaktır: bu süre ne kadar uzun olursa, mitokondriyal baz düşük pO2 seviyelerine o kadar iyi uyum sağlayabilir ve hücre o kadar önemli olur. hasar iskeminin ortadan kaldırılmasından sonra olacaktır.
Belirtilen “senaryoya” göre hücre yaşlanmasının uygulanmasına bir örnek aşağıdaki gerçektir. Farklı yaşlardaki sıçanlardan izole edilen hepatositler, 2 saatlik anoksiye ve 1 saatlik reoksijenasyona tabi tutuldu. Reoksijenasyon aşamasında hepatositlerin, membranlarının hasar görmesinden ve yaşlanmayla ilgili diğer yapısal ve fonksiyonel değişikliklerden sorumlu olan büyük miktarda oksijen radikali ürettiği ve eski hücrelerin reperfüzyon hasarına karşı daha duyarlı olduğu bulunmuştur (Gasbarrini ve ark. ., 1998). Benzer olguları Bölüm 4'te yaşlanma mekanizmasının ve kültürdeki hücrelerin "kendiliğinden" malignitesinin tartışılmasıyla bağlantılı olarak ele alacağız.
Tarım Bilimleri Adayı biyoteknolojinin olanaklarını anlatıyor. Tüm Rusya Patates Yetiştiriciliği Araştırma Enstitüsü'nden Dmitry Kravchenko.
Büyüme ve gelişme kontrol altında:
Patates biyoteknolojisi fırsatları içinde vitro
Bitki büyüme ve gelişiminin düzenlenmesi modern biyolojinin önemli bir görevidir. Bir bitkinin temel hayati fonksiyonlarını kontrol eden hücresel düzeydeki düzenleyici mekanizmaların, fizyolojik süreçleri kontrol etme yollarının ve bir bitki hücresinin düzenleyici mekanizmalarının incelenmesi, potansiyel fırsatların kullanılması için geniş umutlar açar.
Neden bir işe ihtiyacın var? laboratuvar ortamında ?
Koşullar altında yetiştirme ile ilgili biyoteknolojik yöntemleriçinde vitro orijinal patates tohumu üretimi için kaynak bitkilerin çoğaltılmasına yönelik teknolojik sürecin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Apikal meristem yöntemleri ve hızlandırılmış kültür yayılımı kullanılarak sağlığın iyileştirilmesi içiniçinde vitro Tohum üretim sürecinin daha ileri düzeyde yürütülmesi için mümkün olan en büyük miktarda sağlıklı başlangıç materyali elde etmek amacıyla, patates bitkilerinin her iki koşulda da büyüme ve gelişme süreçlerini optimize etmek ve yoğunlaştırmak gerekir.içinde vitro ve sağlıklı mini yumrular alırken.
Büyüme süreçlerini neden yönetmeniz gerekiyor? Patates mahsulleriyle çalışmanın ana yönlerini adlandıralımiçinde vitro :
- patates çeşitlerinin viral ve diğer enfeksiyonlardan iyileştirilmesi (çeşitli kombinasyonlarda ve modifikasyonlarda apikal meristem yöntemi);
- kültüre girişiçinde vitro tamamen sağlıklı bir patates bitkisinden elde edilen eksplantlar;
- orijinal tohum üretimi sürecinde patates çeşitlerinin mikroklonal çoğaltılması;
- patates mikro yumrularının elde edilmesi;
— patates genotiplerinin koleksiyonlarının uzun vadeli bakımı;
- uygulanması için materyal gerektiren seçilim genetiği ve diğer araştırma çalışmalarıiçinde vitro .
Iona Skulachev
Bitki büyüme süreçlerini kontrol etme olanaklarını düşünelimiçinde vitro iyileşme ve mikroklonal yayılma aşamalarında.
Meristematik eksplantlardan rejenerantların elde edilmesi aşamasında, nesnelerin hayatta kalma oranının göstergeleri, morfogenez süreçlerinin yoğunluğu ve yenilenme süresi belirleyici öneme sahiptir. Bu parametreleri iyileştirmek için, geroprotektif özelliklere sahip yeni bir nanoürün sınıfı olan Skulachev iyonlarını kullanmanızı öneririz. A.N.'nin adını taşıyan Fiziksel ve Kimyasal Biyoloji Araştırma Enstitüsü'nde sentezlendi. Belozersky (M.V. Lomonosov'un adını taşıyan MSU) hazırlıklarıSkQ (Skulachev iyonları), trifenildesilfosfonyum katyonlarının ve kloroplast plastokinon analoglarının bileşikleridir. Reaktif oksijen türlerinin hücre içi dengesini düzenlerler ve nüfuz etme yetenekleri ve anti- ve prooksidaz aktivite oranları bakımından farklılık gösterirler.
İlaç eklemekSkQ1 2,5 nM'lik bir nanokonsantrasyonda yapay bir besin ortamına eklenmesi, büyüme mevsimi daha kısa olan çeşitlerin meristem eksplantlarının hayatta kalma oranını %16-43 ve daha uzun büyüme mevsimi olan çeşitlerin hayatta kalma oranını %7-13 artırır.
Aynı zamanda, eksplantların morfojenik aktivitesinde ve büyüme yoğunluğunda önemli bir artış gözlenir, bunun sonucunda mikrobitkilerin meristem dokularından yenilenme süresi 24 saat azalır.– 30 gün.
Yeni bir besin ortamına transplantasyondan sonra, kullanılarak elde edilen rejenantlardan mikro bitkilerSkQ1 , daha hızlı büyüme ve daha iyi biyometrik parametrelerle karakterize edildi. Bir dizi gösterge açısından ortamda elde edilen bitkiler başı çekiyordu: meristemlerin ilk büyümesi ve daha fazla bitki büyümesi açısından.
Daha hızlı
Böylece ilacı kullanırken meristemlerin izolasyonundan 50 gün sonraSkQ1 ELISA yöntemini kullanarak daha fazla kesime ve virüslerle gizli enfeksiyonun test edilmesine uygun tam teşekküllü bitkiler elde edildi. Ve kesimlerden 15-20 gün sonra, yeniden yetiştirilen bitkiler, çeşit tipikliğini değerlendirmek ve mini yumrular elde etmek için bir seranın veya açık zeminin toprağına ekilebilir. Sonuç olarak meristemin izole edilmesinden toprağa sağlıklı bitkilerin ekilmesine kadar geçen toplam süre 65-80 güne indirilebilir. Hatların niceliksel çıktısı da artıyor, bu da başarılı bir iyileşme olasılığı anlamına geliyor.
Fitotron TF 600 otomatik sistemi, ek büyüme uyarıcı maddeler kullanılmadan benzer sonuçlar elde etmenizi sağlar ve bunlarla birlikte rejenerantların morfojenik aktivitesi% 12-21 artar, başlangıçtaki sağlıklı bitkileri elde etme süresi kısalır. 7-14 gün.
Ek olarak, çeşitli spektral bileşimlerdeki ışık radyasyonunun bitkilerde viral enfeksiyonun azaltılması üzerindeki etkisi üzerine araştırmalar yürütülmektedir.içinde vitro .
Hızlandırılmış kesimler
Başlangıçta sağlıklı yenilenmiş bitkiler alındıktan sonra, üremenin bir sonraki önemli aşaması bunların daha da çoğaltılmasıdır. Buradaki zorluk, yüksek potansiyel büyüme enerjisi ve üretkenliğin yanı sıra patojensiz durumu korurken başlangıç malzemesinin hacmini hızla artırmaktır.
Mikroklonal yayılım süreci 2 aşamaya ayrılmalıdır: hızlanan kesimler ve ekimden önceki son kesim.in vivo . Çeliklerin hızlandırılması, tohum üretim programının belirlediği zaman dilimi içerisinde maksimum çoğalma oranının sağlanmasını gerçekten sağlamalıdır. Son aşamada, topraktaki büyüme koşullarına en iyi şekilde uyum sağlayacak ve yüksek verimde standart mini yumrular üretecek bitkilerin oluşturulması gerekmektedir. Bu nedenle mikro çoğaltımın farklı aşamalarında, farklı kimyasal düzenleyiciler ve farklı fiziksel yetiştirme koşulları kullanılabilir.
Koşulları sağlayın
Önceki çalışmaların sonuçlarına dayanarak, epin ilacının kesimleri hızlandırmak için kullanılmasını önerdik. (bitki sapı morfogenezini hızlandıran sentetik epibrassinolit)içinde vitro ve üreme oranını arttırır. Çeliklerin son aşamasında, patates bitkilerinde rizogenezi uyaran ve daha sonraki etkide uzun süreli olumlu etki yaratan, tarla fidanlıklarındaki patates verimini %9-15 oranında artıran ilaç fumar (aminofumarik asit dimetil ester) önerildi.
Son yıllarda sentezlenen yeni nesil büyüme düzenleyici maddelerin dikkatli bir şekilde incelenmesiyle, yapay bir besin ortamına eklendiğinde patates mikro bitkilerinin yaprak sayısını ve dolayısıyla üreme katsayısını 9-9'a çıkaran bir ilaç tespit edildi. 15 adet. çeşitliliğe bağlı olarak.
Ancak benzer sonuçlar bitki yetiştirilerek de elde edilebilir.içinde vitro Fitotron TF 600 kurulumuyla sağlanabilen yetiştirmenin tüm fiziksel parametrelerini optimize ederken standart bir Murashige-Skoog besin ortamında.
Mümkün ama dikkatli olun
Bu nedenle, kültürdeki nesnelerin manipülasyonu için cephanelikte etkili bir araçlaboratuvar ortamında fizyolojik süreçler ve hücre içi metabolizmanın düzenlenme mekanizmaları üzerinde hedeflenen etkiye sahip biyolojik olarak aktif maddelerin kullanımına başlandı. Bununla birlikte, birçok biyolojik olarak aktif maddenin az çok belirgin mutajenik etkiye sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Kültürlü çalışma alanları için özel dikkat ve dikkatle seçilmelidirler.laboratuvar ortamında Patates çeşit özelliklerinin stabilitesi en büyük risk altındadır.
Öte yandan, kontrollü fiziksel koşullara sahip odalar (Phytotron TF 600 ve analogları) gibi modern teknolojik çözümlerin orijinal patates tohumu üretimi uygulamasına dahil edilmesi, bitki büyüme süreçlerinin kontrol edilmesi sorununu kısmen çözmemize olanak tanır.laboratuvar ortamında kimyasal düzenleme kullanılmadan.
(1 ortalama olarak derecelendirmeler: 5,00 5 üzerinden) 
Yükleniyor...
