Unter In-vitro-Bedingungen. Die Schlüsselphase der Pflanzenvermehrung IN VITRO. Immunologische Forschungsmethoden

V. V. Rogovaya, M. A. Gvozdev

Merkmale der mikroklonalen Vermehrung von Steinkulturen unter In-vitro-Bedingungen

Der Artikel präsentiert einen Überblick, der die Merkmale von Methoden zur mikroklonalen Vermehrung von Steinobstkulturen in einem In-vitro-System untersucht. Besonderes Augenmerk wird auf die Methode der Vermehrung durch Achselknospen und die Methode der Regeneration von Adventivtrieben aus Blattexplantaten von Kirschen, Süßkirschen, Pfirsichen und Aprikosen gelegt. Berücksichtigt werden die Fragen der Pflanzengesundheit durch verschiedene Krankheitserreger und die Prüfung des Pflanzenmaterials von Steinobstkulturen auf das Vorhandensein viraler Infektionen.

Die mikroklonale Vermehrung wurde erstmals in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts von dem französischen Wissenschaftler Georges Morel an Orchideen durchgeführt. In seiner Arbeit nutzte er die Technik der Kultivierung des Apikalmeristems von Pflanzen. Die so gewonnenen Pflanzen waren frei von Virusinfektionen.

In unserem Land begann die Forschung zur Pflanzengesundheit mit der Meristemmethode und der klonalen Mikrovermehrung in den 60er Jahren am gleichnamigen Institut für Pflanzenphysiologie. K. A. Timiryazev Akademie der Wissenschaften der UdSSR.

Unter mikroklonaler Vermehrung versteht man die In-vitro-Produktion von Pflanzen, die genetisch mit dem ursprünglichen Explantat identisch sind (eine Methode der vegetativen Vermehrung von Pflanzen in In-vitro-Kulturen). Die Mikrovermehrung basiert auf einer einzigartigen Eigenschaft einer somatischen Pflanzenzelle – der Totipotenz – der Fähigkeit der Zellen, das genetische Potenzial des gesamten Organismus vollständig auszuschöpfen.

Derzeit gewinnen verschiedene Methoden der mikroklonalen Vermehrung landwirtschaftlicher Nutzpflanzen (hauptsächlich vegetativ vermehrt) in einem In-vitro-System zunehmend an Bedeutung: Vermehrung durch Achsel- und Adventivknospen, indirekte Morphogenese, somatische Embryogenese.

Der Einsatz dieser Methoden ermöglicht Folgendes:

Beschleunigen Sie den Auswahlprozess, wodurch die Zeit bis zur Beschaffung marktfähiger Produkte auf 2-3 Jahre statt 10-12 verkürzt wird;

Erhalten Sie in kurzer Zeit eine große Menge an gesundem, virusfreiem Material, das genetisch mit der Mutterpflanze identisch ist;

Arbeiten Sie unter Laborbedingungen und pflegen Sie das ganze Jahr über aktiv wachsende Pflanzen.

Vermehrung von Pflanzen praktisch ohne Kontakt mit der äußeren Umgebung, wodurch die Auswirkungen ungünstiger abiotischer und biotischer Faktoren eliminiert werden;

Erzielen Sie die maximale Anzahl an Pflanzen pro Flächeneinheit.

Erhalten Sie in kurzer Zeit eine große Anzahl von Pflanzen, die sich nur schwer oder nicht vegetativ vermehren lassen;

Durch den Anbau von Pflanzen mit einer langen Jugendphase kann der Übergang von der Jugend- zur Fortpflanzungsphase beschleunigt werden;

Pflanzenmaterial über einen langen Zeitraum (1–3 Jahre) in vitro konservieren (ohne Übergang in frisches Medium),

Erstellen Sie Banken zur langfristigen Lagerung wertvoller Pflanzenformen und ihrer einzelnen Organe;

Entwickeln Sie Methoden zur Kryokonservierung von in vitro behandeltem Material.

Stadien der Mikrovermehrung von Steinobstkulturen und Prüfung auf das Vorhandensein von Virusinfektionen

Der Mikropropagationsprozess umfasst mehrere Stufen. Die wichtigsten sind:

Stufe 1 – Einführung des Explantats in die In-vitro-Kultur;

Stufe 2 – Mikrovermehrung;

Stufe 3 – der Prozess der Wurzelbildung von Mikrosprossen;

Stufe 4 – der Übergang der Wurzelpflanzen von sterilen zu nicht sterilen Bedingungen.

Ein wichtiger Schritt bei der Methode der Mikrovermehrung von Pflanzen in vitro ist die Kultivierung virusfreier Uterusformen von Pflanzen in Wachstumshäusern oder isolierten Kisten in Wintergewächshäusern unter Bedingungen, die für Virusträger unzugänglich sind. Explantierte Spenderpflanzen für die anschließende Einführung in eine In-vitro-Kultur müssen mithilfe von PCR-Diagnosemethoden oder molekularer Hybridisierung oder einem Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) auf das Vorhandensein von Virus-, Mykoplasmen- und bakteriellen Infektionen getestet werden.

Die ELISA-Methode ermöglicht den schnellen Nachweis der überwiegenden Mehrheit der Viren, die Steinfrüchte infizieren: Pflaumenzwergviren, nekrotische Ringfleckviren von Steinfrüchten, Pflaumen-Sharki-Potyvirus, Nicht-Poviren von Kirschblattkräutern. Klone, die durch ELISA als frei von Kontaktviren befunden wurden, werden anschließend einer Grunduntersuchung unterzogen, die serologische Tests in Kombination mit einem Test an Indikatorpflanzen umfasst. Pflanzen, die nachweislich frei von Viren und anderen regulierten Krankheitserregern sind, werden der Kategorie „virusfreie“ Basisklone zugeordnet. Wird ein Befall festgestellt, können die ursprünglichen Pflanzen rehabilitiert werden. Um die Gesundheit von Steinobstpflanzen vor Viren zu verbessern, ist es am ratsamsten, Methoden der Trockenluft-Thermotherapie und der In-vitro-Kultur zu kombinieren. Wenn es mit einer Kultur isolierter Apikalmeristeme nicht möglich ist, die getesteten Viren loszuwerden, werden Chemotherapiemethoden eingesetzt, die auf der Einführung von Chemikalien in das Nährmedium basieren, die die Entwicklung einer Virusinfektion in Pflanzen in vitro hemmen.

Um bakterielle Mikroflora aktiv nachzuweisen, werden die Medien manchmal mit verschiedenen organischen Zusatzstoffen angereichert, beispielsweise Kaseinhydrolysat, was die Entwicklung saprophytischer Mikroorganismen provoziert. Der Befall wird nach 7–10 Tagen visuell beurteilt. „Saubere“ Explantate werden zur weiteren Kultivierung auf Nährmedien gelegt. In dieser Phase wird auch praktiziert, Medien ohne Wachstumssubstanzen zu verwenden.

Einführung in die In-vitro-Kultur und Mikrovermehrung von Steinobstkulturen

Bei der klonalen Mikrovermehrung von Steinobstkulturen werden in der Regel Spitzen- und Seitenknospen sowie meristematische Spitzen als Quelle für Explantate verwendet. Die Isolierung des Apikalmeristems erfolgt nach allgemein anerkannten Methoden nach schrittweiser Sterilisation des Pflanzenmaterials.

Für die Mikrovermehrung von Steinobst werden verschiedene Medien verwendet: für die Mikrovermehrung von Kirschen – Pierik, Gautre, White, Heller, für Kirschen und Pflaumen – Rosenbergs Medium, modifiziert für Obstkulturen und für Pflaumen – Lepoivre und B5-Medium. Für die mikroklonale Vermehrung von Kirschen, Süßkirschen und Pflaumen eignet sich jedoch am besten das Nährmedium Murashige-Skoog (MS).

Abhängig vom Stadium der mikroklonalen Vermehrung von Steinobstkulturen wird den Nährmedien 6-Benzylaminopurin (6-BAP) in Konzentrationen von 0,2-2 mg/l zugesetzt. Im Stadium der Einführung in die In-vitro-Kultur wird eine niedrigere Konzentration an Cytokinin verwendet – 0,2 mg/l BAP. Um die Proliferation der Achselknospen zu induzieren und so die maximale Anzahl an Trieben zu erhalten, werden Kirsch-Mikropflanzen unter Zugabe von BAP in Konzentrationen von 0,5–2 mg/l und Pflaumen-Mikropflanzen mit 0,5–1 mg/l BAP kultiviert.

Der Prozess des Rootens von Mikrosprossen

Die Wurzelphase erfordert besondere Aufmerksamkeit. Der Prozess der In-vitro-Wurzelung von Trieben von Steinobstkulturen hängt von den Sortenmerkmalen, von der Anzahl der durchgeführten Passagen, von der Konzentration und Art des Auxins sowie von der Art seiner Anwendung ab. Um vollständig ausgebildete Mikropflanzen aus Steinobstkulturen zu erhalten, wird 6-BAP, das die Rhizogeneseprozesse stört, aus dem Medium ausgeschlossen und Auxine, hauptsächlich β-Indolyl-3-Buttersäure (IBA), in das Medium eingebracht. Es wurde festgestellt, dass die optimale IBA-Konzentration im Nährmedium im Bereich von 0,5-1 mg/l liegt. Das Vorhandensein von IBA im Medium in einer Konzentration von 2 mg/l führt zur Bildung hypertrophierter Wurzeln.

Die gemeinsame Einführung des Arzneimittels Ribav (1 ml/l) und der traditionellen Phytohormone Auxine [IBA und β-Indolylessigsäure (IAA) jeweils 0,5 mg/l] in das Wurzelmedium erhöht den Prozentsatz der Sprosswurzelung bei einer Reihe von Steinarten Obstkulturen.

In einer vergleichenden Studie der Wurzelbildungsinduktoren IAA, IAA und a-Naphthylessigsäure (NAA) wurde die hohe Wirksamkeit von IAA bei einer Konzentration von 6,0 mg/l festgestellt. Die größte Anzahl bewurzelter Kirsch-Mikrostecklinge wurde auf einem NAA-haltigen Medium erhalten. Allerdings kam es gleichzeitig zu einem intensiven Kalluswachstum im Basalbereich der Triebe, was die Überführung von Reagenzglaspflanzen mit Wurzeln in unsterile Bedingungen erschwerte.

Für eine effektive Wurzelbildung von Reagenzglas-Steinobstpflanzen ist nicht nur die Art des Stimulans, sondern auch die Art seiner Anwendung von großer Bedeutung. Zusätzlich zum Einbringen von Auxinen in das Nährmedium wird zur Auslösung der Rhizogenese ein vorläufiges Einweichen der Triebe in einer sterilen wässrigen Lösung von IBA (25–30) mg/l mit einer Expositionsdauer von 12–24 Stunden durchgeführt. Die Experimente zeigten, dass die Behandlung von Mikroschnitten mit einer wässrigen IBA-Lösung wirksamer ist als die Einführung dieses Regulators in das Kulturmedium. Das massive Auftreten der ersten Adventivwurzeln nach Anwendung einer Vorbehandlung mit einem Rhizogenese-Induktor wurde an den Tagen 20–25 festgestellt. Eine andere Möglichkeit, die Rhizogenese zu induzieren, besteht darin, die Triebe von Steinobstkulturen mit Talk-Auxin-haltigem Pulver IBA mit einer Konzentration von 0,125 %, 0,25 % und IAA mit einer Konzentration von 0,25 %, 0,5 % zu behandeln. Bei der Verwendung von Hormonpulver wurde eine hohe Effizienz und Herstellbarkeit der Verwendung von Rhizogenese-Induktoren festgestellt. Die Verwendung von IMC-Talkumpulver mit unterschiedlichen Auxinkonzentrationen zeigte jedoch eine Sortenspezifität bei der Bewurzelung von Pflaumen-Mikrostecklingen.

Der Prozess der Rhizogenese findet am intensivsten auf modifizierten MS- und White-Medien statt. Anderen Daten zufolge ist das beste Medium für die Wurzelbildung Medien mit Makroelementen nach Heller mit Zusatz von Vitaminen und einem halbverdünnten MS-Medium mit einem reduzierten Saccharosegehalt von 15 mg/l und mit Ausnahme von Meso-Inositol, das fördert die Bildung von Hornhautgewebe. In den meisten Studien werden jedoch Murashige- und Skoog-Medien zur Wurzelbildung in Mikrosprossen von Steinobstkulturen verwendet.

Mikropropagationsmethoden

Für die mikroklonale Vermehrung von Pflanzen in vitro gibt es mehrere Methoden:

Methoden der Vermehrung durch Achselknospen;

Methoden der Vermehrung durch Adventivknospen;

Indirekte Morphogenese;

Somatische Embryogenese.

Für jede Art der Regeneration in vitro können vier Gruppen von Faktoren unterschieden werden, die den Erfolg bestimmen: Genotyp und Zustand der ursprünglichen Mutterpflanze; Anbaubedingungen und -methoden; Zusammensetzung von Nährmedien; Merkmale der Einführung eines Explantats in eine sterile Kultur.

Der Einfluss des Genotyps auf die Effizienz der Mikrovermehrung

Der Genotyp hat den größten Einfluss auf die Effizienz der Mikrovermehrung. Die Reaktion von Pflanzen auf aseptische Anbaubedingungen hängt von den Sortenmerkmalen ab und wird durch die unterschiedliche Regenerationsfähigkeit der Obst- und Beerenkulturen erklärt. Als beispielsweise die klonale Mikrovermehrung zur Beschleunigung der Vermehrung neuer Kirschsorten eingesetzt wurde, erwiesen sich Sortenmerkmale als dominierende Faktoren für die Fähigkeit der Pflanzen zur Mikrovermehrung.

Sortenunterschiede traten sowohl im Proliferationsstadium als auch im Wurzelbildungsstadium auf.

Bei Explantaten verschiedener Sorten derselben Art von Obstpflanzen werden häufig unterschiedliche Reaktionsgrade auf im Medium enthaltene Wachstumsregulatoren beobachtet, was offenbar in gewissem Maße auf den endogenen Gehalt an Wachstumssubstanzen zurückzuführen ist, der ein genetisch bedingtes Merkmal von ist die Art oder Sorte. Gleichzeitig wurde die Realisierung des morphogenetischen Potenzials in der Embryokultur in vitro, in Hybriden zwischen den Arten Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa, hauptsächlich durch den Genotyp bestimmt und hing in geringerem Maße von der Zusammensetzung ab des Nährmediums.

Anbaubedingungen

Ein weiterer Faktor, der den Erfolg der Mikrovermehrung von Pflanzen bestimmt, sind ihre Anbaubedingungen. Die optimalen Bedingungen für den Anbau von Steinobst sind: Temperatur 22–26 °C für Kirschen und 26–28 °C für Pflaumen, Beleuchtung von 2000–5000 Lux für Kirschen und 3500 Lux für Pflaumen mit einer 16-stündigen Photoperiode. Mikropflanzen sollten in Klimakammern oder kontrollierten Räumen gezüchtet werden.

Es ist zu beachten, dass bei Kirschsorten im Vermehrungsstadium durch abwechselnde mineralische Zusammensetzungen der Nährmedien und den Einsatz von Blaulichtlampen (LP 1) eine Erhöhung des Reproduktionskoeffizienten und eine Erhöhung des Anteils bewurzelungsfähiger Triebe gewährleistet werden kann ). Bei horizontaler Ausrichtung der Regeneratoren kann eine große Anzahl von Trieben von Steinobstkulturen – bis zu 30 – gebildet werden. Um die Vermehrungsrate in den ersten Passagen zu erhöhen, können Konglomerate aus Knospen und Trieben von Steinobstkulturen nicht in einzelne Einheiten geteilt, sondern vollständig in ein frisches Nährmedium überführt werden. Bei dieser Technik steigt der Vermehrungsfaktor stark an und kann je nach Sorte 40-70 pro Durchgang erreichen.

Vermehrungsmethode durch Achselknospen: indirekte Morphogenese

Die zuverlässigste Methode der mikroklonalen Vermehrung ist die Methode der Pflanzenregeneration durch die Entwicklung von Achselknospen. Der Vorteil dieser Methode ist die relativ schnelle Reproduktion des ursprünglichen Genotyps bei gleichzeitiger Gewährleistung höchster phänotypischer und genotypischer Stabilität. Das Potenzial dieser Methode der In-vitro-Mikrovermehrung wird durch die Zugabe von Zytokininen zum Nährmedium ausgeschöpft, die die Entwicklung der apikalen Knospe des Stängels unterdrücken und die Bildung von Achselknospen stimulieren.

Der Prozess der mikroklonalen Vermehrung von Kirschen mithilfe der Kulturmethode isolierter Apikalmeristeme basiert auf dem Phänomen der Entfernung der Apikaldominanz, was die spätere Entwicklung bestehender Meristeme fördert und die genetische Homogenität des Pflanzmaterials gewährleistet.

Rial. Die Beseitigung der apikalen Dominanz wird durch die Zugabe von Zytokininen erreicht. Viele Kirschsorten zeichnen sich durch eine hohe mitotische Aktivität der Spitze aus, die zur Bildung eines verzweigten Konglomerats aus Knospen und seitlichen Mikrosprossen beiträgt.

Die genetische Stabilität des in vitro gewonnenen Materials hängt vom Reproduktionsmodell ab. Der Fortpflanzungsprozess von Steinobstpflanzen ist mit der Proliferation von Achselmeristemen verbunden. Die genetische Stabilität ist eine integrale Eigenschaft des Meristems, die in vitro erhalten bleiben kann, wenn das Meristem unter Bedingungen kultiviert wird, die die Kallusbildung hemmen. Bei der Verwendung von Medien, die die Kallusbildung stimulieren, kann es zu genetischer Variabilität kommen.

Um höhere Reproduktionsraten zu erzielen, werden Nährmedien neben Medikamenten mit Zytokin-Charakter häufig auch mit Substanzen aus der Auxin-Gruppe angereichert, die die Entwicklung von Kallusgewebe stimulieren. Kombinationen dieser beiden Medikamente werden verwendet, um die Organogenese in Kallusgeweben zu induzieren. Im Kallus-Spross-System kann die organisierte Struktur des Sprosses die Prozesse der Organogenese beeinflussen und die Meristematisierung von Kalluszellen stimulieren, wodurch Organe mit veränderten Eigenschaften entstehen können. Eine einfache Variation des Gehalts an Wachstumsregulatoren, die dem Kulturmedium zugesetzt werden, um eine maximale Zellproliferation zu erreichen, kann sich auf die genetische Stabilität des resultierenden Materials auswirken.

Methode der Vermehrung durch Adventivknospen und indirekte Morphogenese

Als Adventivknospen werden Knospen bezeichnet, die direkt aus den Geweben und Zellen von Pflanzenexplantaten entstehen, die diese normalerweise nicht bilden. Adventivknospen (oder Adventivknospen) werden aus Meristemzonen gebildet, meist sekundär aus Kallusgewebe. Adventivknospen können aus dem Meristem- und Nicht-Meristem-Gewebe (Blätter, Stängel) entstehen. Die Bildung von Adventivknospen wird bei vielen Pflanzenarten durch ein hohes Verhältnis von Zytokininen zu Auxinen im Nährmedium induziert.

Die Regeneration von Sprossen, Wurzeln oder Embryoiden aus somatischen Pflanzenzellen des Explantats kann durch indirekte Regeneration – Kallusbildung und Sprossbildung – oder durch „direkte“ Regeneration erfolgen, wenn Explantatzellen ohne die Bildung von Kallusgewebe zur Regeneration fähig werden.

Adventivtriebe können sich an Explantaten von Blättern, Blattstielen, Wurzeln und anderen Pflanzenorganen verschiedener Arten von Steinobst und Obstkulturen bilden. Die Gewinnung von Trieben direkt aus Explantaten wird in einigen Fällen zum Klonen von Pflanzen verwendet, was jedoch zu genetisch instabilen Pflanzen führen kann. Daher kann diese Pflanzenregenerationsmethode verwendet werden, um genetisch vielfältige Pflanzen zu induzieren.

Regenerative Triebe können an verschiedenen Stellen der Blattspreite induziert werden, aber Gewebe haben die größte Fähigkeit zur Regeneration

die Basis des Blattes, da sich in dieser Zone der Blattspreite die aktivsten meristematischen Zellen befinden. Es muss auch berücksichtigt werden, dass das morphogenetische Potenzial der Blätter zunimmt, je weiter sie sich zur Spitze des Stängels hin befinden. Adventivtriebe regenerieren sich besser aus dem jungen meristematischen Gewebe der sich entwickelnden Blätter. Bei der Verwendung älterer Blätter kommt es jedoch deutlich häufiger zu genetisch veränderten Trieben.

Zur Regeneration von Trieben von Steinobstkulturen wie Kirschen, Süßkirschen, Pfirsichen und Aprikosen aus anfänglichen Explantaten (ganze Blätter und deren Segmente) werden verschiedene Medien verwendet: Murashige-Skoog (MB), Lloyd und McCown (WPM), Driver und Kuniyuki (DKW), Kuren und Lepoiv-ra (QL).

Für Experimente zur zufälligen Regeneration von Kirschen wird am häufigsten Lloyd und McCowns Medium für Holzpflanzen – Woody Plant Medium (WPM), ergänzt mit verschiedenen Wachstumsstimulanzien – verwendet. Von den Cytokininen werden hauptsächlich 6-BAP, Thidiazuron (TDZ) und von den Auxinen NAA, IBA, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) verwendet.

Es ist wichtig anzumerken, dass unter ausländischen Forschern kein Konsens über die Wirksamkeit des Einsatzes von TDZ bei der Sprossregeneration im Vergleich zu BAP, über die Art des Explantats (ganze Blätter, mit Querschnitten oder segmentiert) und über die Kultivierungsmethode besteht Explantate (abaxiale oder adaxiale Oberfläche nach oben).

Ein hoher Prozentsatz der Regeneration wurde bei ganzen Kirschblattexplantaten (mit Querschnitten entlang der Mittelrippe des Blattes) beobachtet, die mit der abaxialen (unteren) Oberfläche nach oben auf WPM-Medium, ergänzt mit 2,27 oder 4,54 µM TDZ + 0,27 µM NUK, platziert wurden.

Andererseits zeigt die Arbeit, dass BAP bei der Regeneration von Pflanzen aus Kirsch- und Süßkirschblättern wirksamer ist als TDZ und dass BAP und NAA in einer Konzentration von 2 mg/l und 1 mg/l die optimale Kombination darstellen von Wachstumsregulatoren für Kirschpflanzen und Kirschen. Die höchste Regenerationsfrequenz wurde im WPM-Medium erzielt, obwohl es die Kallusogenese stärker stimulierte als in den MS-, QL- und DKW-Medien. Es wurde die Abhängigkeit der Effizienz der Kallusbildung von der Art der Blattsegmente aufgezeigt. So wurden die höchsten Kallusbildungsraten an den mittleren Blattsegmenten festgestellt; am niedrigsten war die Regeneration an den apikalen Segmenten, während an den Basissegmenten eine direkte Regeneration (ohne Kallusbildung) festgestellt wurde.

Eine zufällige Regeneration der Schwarzkirsche (Prunus serótina Ehrh.) trat häufiger auf, wenn Blattexplantate auf mit TDZ ergänztem WPM-Medium kultiviert wurden, im Vergleich zum modifizierten DKW-Medium.

Die Effizienz der zufälligen Regeneration von Wildkirschen (Prunus avium L.) wurde maßgeblich von der Größe des Explantats beeinflusst. Die Ergebnisse zeigten, dass die Größe des Blattexplantats für die Bildung von Adventivsprossen entscheidend ist; Blätter mit einer Länge von 3–5 mm bildeten die größte Anzahl von Adventivsprossen. Für die zufällige Regeneration von Wildkirschen wurde WPM-Medium, ergänzt mit 0,54 tM NAA und 4,4 tM TDZ, verwendet.

Eine spezielle Vorbehandlung vor der Kultivierung (Einweichen mit 5 mg/L 2,4-D für einen Tag) war wirksam bei der Induktion von Adventivsprossen aus Kirschblatt-Explantaten. Die anschließende Kultivierung von Blattexplantaten auf WP-Regenerationsagarmedium, ergänzt mit 5 mg/l TDZ, erhöhte die Effizienz der Adventivregeneration von Kirschen. Junge Kirschblattexplantate zeigten eine höhere Regenerationsfähigkeit als alte.

Zu beachten ist die signifikante Wirkung von Ethyleninhibitoren auf die zufällige Regeneration der Blätter verschiedener Aprikosensorten. Die Arbeit zeigte beispielsweise, dass der Einsatz von Ethyleninhibitoren (Silberthiosulfat oder Aminoethoxyvinylglycin) zusammen mit einem geringen Gehalt an Kanamycin die zufällige Regeneration um mehr als 200 % steigert. Die Verwendung von reinem Agar verbesserte auch die Regeneration von Aprikosenblättern im Vergleich zur Verwendung von Agargel oder Agarose. In dieser Arbeit wurden Studien zu LQ-, DKW-Medien durchgeführt, ergänzt durch TDZ und NUK. Die Methode der Blattkultivierung erfolgt mit der adaxialen Oberfläche zum Medium.

Italienische Forscher haben eine Methode zur zufälligen Regeneration aus ganzen Pfirsichblättern entwickelt, die im Dunkeln auf mit 6-BAP und NAA ergänzten Medien inkubiert wurden. Die Studien verwendeten Kombinationen von Makrosalzen und Mikrosalzen verschiedener Medien nach MS, Quoirin, Rugini und Muganu, beide Cytokinine – 6-BAP und TDZ, sowie die Methode der Blattkultivierung – adaxiale Oberfläche in Kontakt mit dem Regenerationsmedium. An der Basis der Blattstiele entwickelte sich Kallus. Nach der Übertragung auf ein auxinfreies Medium und der Kultivierung im Licht erschienen auf diesem Kallus Adventivsprossen. Die morphogenetische Fähigkeit des Kallus blieb über mehrere Monate erhalten. In diesen Studien entstanden durch indirekte Morphogenese Pfirsich-Adventivsprossen.

Die indirekte Morphogenese beinhaltet die sekundäre Differenzierung von Knospen aus Kallusgewebe. Um Kallus zu bilden, aus dem sich dann Triebe bilden, werden verschiedene Explantate verwendet. Um morphogenen Kallus aus mehrjährigen Pflanzen zu gewinnen, sollten Triebspitzen oder daraus isolierte meristematische Gewebeschnitte entnommen werden. Aufgrund der genetischen Instabilität wird dieses System nicht für die In-vitro-Mikrovermehrung von Pflanzen empfohlen. Die indirekte Morphogenese ist wichtig für die Untersuchung der somaklonalen Variabilität und die Gewinnung somaklonaler Varianten.

Im Vereinigten Königreich wurde in der Abteilung für Physiologie der Maidstone Experimental Station die Pflanzenregeneration aus Stängel- und Blattkallus am Wurzelstock der Colt-Kirsche untersucht. Die Kallusinitiierung wurde auf Mu-rasige-Skoog-Medium mit 2,0–10,0 mg/l NAA durchgeführt. Der resultierende Kallus wurde in ein Regenerationsmedium überführt, das BAP in einer Konzentration von 0,5 mg/l enthielt. Auf dieser Kirschunterlage war es möglich, Triebe aus Calli zu regenerieren.

Im nach I.V. Michurin benannten Zentralen Genetischen Labor wurde die Wurzelbildung in der Kultur passagierter Kallusgewebe beobachtet, die aus einjährigen Kirschsprossen gewonnen wurden. Bei der erneuten Aussaat auf einem Medium mit Wachstumsregulatoren wurde das Auftreten meristematischer Formationen beobachtet.

Somatische Embryogenese

Eine weitere Methode der mikroklonalen Vermehrung von Pflanzen in vitro ist die somatische Embryogenese – der Prozess der Bildung embryonaler Strukturen aus somatischen (nicht reproduktiven) Zellen. Ein somatischer Embryo ist eine unabhängige bipolare Struktur, die nicht physisch mit Gewebe verbunden ist und aus der eine Struktur entsteht, in der sich gleichzeitig Stamm- und Wurzelspitzen entwickeln.

Die Bildung somatischer Embryonen in der Kultur von Zellen, Geweben und Organen kann direkt oder indirekt erfolgen. Bei der direkten somatischen Embryogenese handelt es sich um die Bildung eines vegetativen Embryos aus einer oder mehreren explantierten Gewebezellen ohne das Stadium der Zwischenkallusbildung. Die indirekte Embryogenese besteht aus mehreren Phasen: Einbringen des Explantats in Kultur, anschließende Stimulierung des Kalluswachstums und der Bildung von Präembryonen aus Kalluszellen, Übertragung des Kallus in ein Nährmedium ohne Wachstumsfaktoren zur Bildung bipolarer Embryonen aus Präembryonen.

Die Arbeit untersuchte die Möglichkeit der Pflanzenregeneration durch Kalli, die aus den Wurzeln von Kirschunterlagen gewonnen wurden. Kallus wurde entweder aus geschnittenen Wurzeln oder aus ganzen Pflanzen gewonnen, die beim Mikroklonen von Kirschsprossen unter sterilen Bedingungen gezüchtet wurden. Im Wurzelstock der Colt-Kirsche bildete Kallus, der aus den Wurzeln intakter Pflanzen gewonnen wurde, Triebe und embryoidartige Strukturen. Kirschkalli wurden auf Murashige-Skoog-Medium, ergänzt mit BAP, HA und NAA, kultiviert. Die Häufigkeit der Sprossbildung war höher als beim parallel analysierten Apfelbaum. Regenerierte Pflanzen wurden durch Gewebekultur vermehrt und in Erde verpflanzt. Sämlinge regenerierter Pflanzen, die aus Calli von Kirschunterlagen gewonnen wurden, unterschieden sich im Phänotyp nicht von den ursprünglichen Unterlagen.

Die Induktion der somatischen Embryogenese bei Kirschsorten (Prunus cerasus L.) wurde beobachtet, als Explantate auf Murashige-Skoog-Medium, ergänzt mit verschiedenen Kombinationen von Auxinen und Zytokininen, kultiviert wurden. Die somatische Embryogenese fand hauptsächlich statt, wenn die Kombination von 2,4-D und Kinetin verwendet wurde. Eine Induktion der somatischen Embryogenese wurde auch beobachtet, wenn dem Induktionsmedium 0,1 mg/l IBA zugesetzt wurde. Der Einsatz von NAA oder 6-BAP reduzierte die Induktion der somatischen Embryogenese und erhöhte die Häufigkeit der indirekten Regeneration bei Kirschsorten (Prunus cerasus L.).

Als zuverlässigster Weg zur Gewinnung genetisch identischer Nachkommen gilt heute die mikroklonale Vermehrung von Steinobst durch Achselknospen im Vergleich zur somatischen Embryogenese, der Vermehrung durch Adventivknospen und der indirekten Morphogenese.

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V. Rogovaia, M. Gvozdev

IN VITRO KLONALE MIKROPAGATION VON STEINFRUCHTKULTUREN

Die Übersicht konzentriert sich auf die wichtigsten Phasen und Methoden der klonalen Mikrovermehrung von Steinobstkulturen in vitro. Besonderer Wert wird auf die Technik der Hilfsknospenvermehrung und die Methode der zufälligen Triebregeneration aus Blattexplantaten von Sauerkirsche, Kirsche, Pfirsich und Aprikose gelegt. Einige Aspekte der Prüfung von Pflanzenmaterial auf Virusinfektionen sowie bestimmte Probleme der Erhaltung der genetischen Stabilität je nach Vermehrungsmodell wurden überprüft.

Bei der Fernhybridisierung werden isolierte Gewebekulturmethoden wie In-vitro-Fertilisation, Embryokultur (Züchtung isolierter Embryonen auf künstlichen Nährmedien), klonale Mikrovermehrung wertvoller Hybriden sowie In-vitro-Produktion von Haploiden und Kryokonservierung eingesetzt.

In-vitro-Fertilisation (Überwindung programmatischer Inkompatibilität) wird durchgeführt, wenn eine Befruchtung zwischen ausgewählten Paaren unter natürlichen Bedingungen nicht möglich ist. Dies hat mehrere Gründe: 1) physiologisch (Diskrepanz im Zeitpunkt der Pollenreifung usw.); 2) morphologisch (kurzer Pollenschlauch oder Blockierung seines Wachstums in verschiedenen Entwicklungsstadien usw.). Die In-vitro-Fertilisation kann auf zwei Arten durchgeführt werden: a) Kultivierung des Eierstocks auf einem künstlichen Agar-Nährmedium mit darauf aufgetragenem fertigem Pollen; b) Der Eierstock wird geöffnet und Plazentastücke mit Eizellen werden in das Nährmedium überführt, in dessen Nähe oder direkt auf dem Plazentagewebe der fertige Pollen kultiviert wird. Anhand der schnell zunehmenden Größe der Eizellen können Sie optisch erkennen, ob eine In-vitro-Fertilisation stattgefunden hat oder nicht. Der gebildete Embryo geht in der Regel nicht in einen Ruhezustand über, sondern keimt sofort und bringt eine Hybridgeneration hervor. Die Plazenta-Fertilisation in vitro ermöglichte es, die Inkompatibilität bei der Kreuzung der kultivierten Tabaksorten N. tabacum mit den Wildarten N. rosulata und N. debneyi zu überwinden und in den Experimenten von M. F. Ternovsky et al. (1976) interspezifische Tabakhybriden zu erhalten. , Shinkareva (1986).

Postgame Inkompatibilität überwinden. Postgame Inkompatibilität während der Fernhybridisierung tritt nach der Befruchtung auf. Dies führt häufig zur Bildung von mickrigen, nicht keimenden Samen. Der Grund kann eine Diskrepanz in der Entwicklungszeit von Embryo und Endosperm sein. Aufgrund der schlechten Entwicklung des Endosperms ist der Embryo nicht in der Lage, normal zu keimen. In solchen Fällen wird ein Embryo aus einem reifen, kümmerlichen Korn isoliert und in einem Nährmedium gezüchtet.

Das Züchten von Embryonen in einem künstlichen Nährmedium wird als Embryokultur bezeichnet. Das Medium zum Züchten eines reifen Embryos kann einfach sein, ohne Zusatz von physiologisch aktiven Substanzen (z. B. White-Medium) oder anderen, die Mineralsalze und Saccharose enthalten. Bei weiter entfernten Kreuzungen können bereits im Frühstadium Störungen in der Entwicklung des Embryos beobachtet werden, die sich in mangelnder Differenzierung und langsamem Wachstum äußern. In diesem Fall besteht die Kultur des Embryos aus zwei Phasen – dem embryonalen Wachstum des Embryos, in dem seine Differenzierung fortgesetzt wird, und der Keimung des gewachsenen Embryos. Die erste Stufe erfordert ein komplexeres Medium mit einem hohen Saccharosegehalt unter Zusatz verschiedener Aminosäuren, Vitamine und Hormone.

Der Einsatz der Embryokultur in der Züchtung hat in letzter Zeit eine große Bedeutung für die Gewinnung entfernter Hybriden aus Getreide, Getreide und anderen landwirtschaftlichen Nutzpflanzen erlangt. Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, den Ertrag von Weizen-Roggen-Hybriden durch die Züchtung unreifer Embryonen zu steigern und die postgame Inkompatibilität während der Hybridisierung von Weizen mit Weidelgras durch Embryokultur zu überwinden.

Die Embryokulturmethode wird zunehmend bei der interspezifischen Hybridisierung von Gemüsepflanzen eingesetzt. Für Zwiebeln wurden Methoden zur In-vitro-Züchtung abortiver Embryonen aus Hybridsamen aus verschiedenen Stadien der Embryogenese und zur Züchtung von Embryonen aus teilweise fruchtbaren interspezifischen Hybriden entwickelt. Die Kultur isolierter Embryonen wird bei der Züchtung von Tomaten und anderen Gemüsepflanzen verwendet.

Es wurde die hormonelle Regulierung des Wachstums und der Entwicklung von Tomatenembryonen in vitro untersucht. Es wird die Möglichkeit der Verwendung von Embryokultur zur Gewinnung entfernter Sonnenblumenhybriden diskutiert und Faktoren untersucht, die das Wachstum und die Entwicklung von Sonnenblumenembryonen, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestäubung isoliert wurden, in vitro steuern.

Die Kultur isolierter Embryonen als Hilfsmethode für die Fernhybridisierung wird nicht nur zur Überwindung postgamer Inkompatibilität, sondern auch zur Mikrovermehrung wertvoller Hybriden eingesetzt. In diesem Fall erfolgt die Mikrovermehrung durch Kallusogenese, Induktion der Morphogenese und Produktion regenerierter Pflanzen aus Kallusgewebe. Die Technik des Klonens unreifer Embryonen ermöglicht die Vermehrung wertvoller Pflanzengenotypen in frühen Stadien des Lebenszyklus. Eine weitere Möglichkeit der Nutzung der Embryokultur ist der Einsatz bei der Zellselektion.

Klonale Mikrovermehrung entfernter Hybriden. Die Embryokultur ermöglicht die Züchtung von Hybridpflanzen aus defekten Embryonen. Der Ertrag von Hybridpflanzen ist jedoch gering und die Hybriden sind oft steril. Manchmal, beispielsweise bei der Züchtung von Buchweizen, ist es aufgrund der Fremdbestäubung der Kulturpflanze schwierig, einzigartige Genotypen bei den Nachkommen zu reproduzieren. Daher stehen Forscher häufig vor der Aufgabe, die daraus resultierenden Pflanzen zu vermehren und zu konservieren. Dabei hilft die Methode der klonalen Mikrovermehrung. Die Vermehrung von Hybriden erfolgt durch Aktivierung der Entwicklung des Meristems von Achselknospen (durch Stecklinge steriler Triebe), Adventivknospen oder durch Regeneration von Pflanzen aus Kallusgewebe, das insbesondere durch die Kultivierung von Embryonen gewonnen wird.

Haploide in vitro gewinnen und in der Züchtung verwenden. Die Rolle haploider Pflanzen bei der Züchtung ist sehr wichtig. Mit ihnen können Sie schnell die gewünschte Kombination finden und die Zeit für die Erstellung einer Sorte verkürzen. Haploide werden verwendet, um stabile homozygote Linien zu erzeugen. Es ist auch bequemer, Haploide für die Mutagenese zu verwenden, da die Auswahl rezessiver Mutationen auf haploider Ebene einfacher ist.

In diploiden Pflanzen betreffen Mutationen selten beide Allelgene auf homologen Chromosomen. Das Individuum ist normalerweise heterozygot (die beiden Gene sind unterschiedlich) und nur das dominante (aber nicht das rezessive) Gen ist betroffen. Da Mutationen häufiger rezessiv als dominant sind, sind sie recht schwer zu identifizieren. In haploiden Pflanzen, die nur eines von jedem homologen Chromosomenpaar enthalten, treten Mutationen sofort auf. Die Selektion auf haploider Ebene ermöglicht die direkte Selektion nicht nur dominanter, sondern auch rezessiver Merkmale.

Haploide Individuen sind unfruchtbar, es ist jedoch möglich, ihren Chromosomensatz mit Colchicin künstlich zu verdoppeln und diploide homozygote Pflanzen zu erhalten.

Haploide können spontan entstehen, die Häufigkeit ihres spontanen Auftretens ist jedoch sehr gering. Künstlich ist es mit In-vitro-Methoden möglich, große Mengen haploider Pflanzen zu gewinnen. Es gibt drei Möglichkeiten, Haploide mit der Methode der isolierten Gewebekultur zu erhalten:

Androgenese – Produktion haploider Pflanzen auf einem künstlichen Nährmedium aus isolierten Staubbeuteln und Mikrosporen.

Gynogenese – Produktion haploider Pflanzen auf einem künstlichen Nährmedium aus isolierten Eizellen;

Parthenogenese ist die Produktion von Haploiden aus einem Hybridembryo, bei dem die väterlichen Chromosomen aufgrund der Inkompatibilität der elterlichen Chromosomen verloren gegangen sind.

Die durch die Eliminierung der Chromosomen des väterlichen Genoms entstandenen haploiden Embryoiden werden auf künstlichen Nährmedien kultiviert und es werden haploide Pflanzen gewonnen. Die Gerstensorten Istok und Odesskaya-15 wurden durch die Kombination der parthenogenetischen Methode mit der Kultivierung isolierter Embryonen in vier Jahren statt der üblichen 10–12 Jahre gewonnen. Mit der Methode der Staubbeutelkultur aus Sorten und Hybriden von Weich- und Hartweizen produzierte die NPO Elita Povolzhya über vier Jahre mehr als 2,5 Tausend dihaploide Linien, die sich durch Homogenität und Stabilität auszeichnen.

Die Entwicklung der Technologie zur Gewinnung von Haploiden durch den Anbau von Staubbeuteln aus Weizen, Gerste, Mais, Winterroggen und Kartoffeln wird fortgesetzt. In der Staubbeutelkultur gibt es zwei Möglichkeiten zur Bildung haploider Pflanzen. Die erste ist die Bildung von Pflanzen durch Embryogenese in Pollenkörnern. In diesem Fall entstehen Embryoide aus einzelnen Pollenkörnern im Inneren der Staubbeutel. Sie keimen und produzieren haploide Pflanzen. Die zweite ist die Bildung von Kallus aus Staubbeutelzellen. Anschließend werden Pflanzen durch Morphogenese aus Kalluszellen regeneriert. In diesem Fall sind die resultierenden Pflanzen nicht immer haploid und unterscheiden sich häufig in der Ploidie. Es ist nicht ganz klar, ob sie aus polyploidisierten haploiden Zellen oder aus fusionierten Zellen entstehen.

In vitro gewonnene Haploide können nicht nur für die praktische Selektion, sondern auch für Arbeiten zur Gentechnik und Zellselektion verwendet werden. Pollenkörner sind in einigen Fällen geeignetere Objekte für Experimente zur genetischen Transformation als Protoplasten.

Kryokonservierung von Pflanzen

Die Kryokonservierung somatischer Pflanzenzellen in flüssigem Stickstoff (Temperatur – 196 °C) ist eine neue Richtung in der Biotechnologie, die sich seit den frühen 70er Jahren des 20. Jahrhunderts weit verbreitet zu entwickeln begann. Der Zweck dieser Technologie besteht darin, den Genpool in der In-vitro-Kultur zu erhalten und den Züchtern jederzeit einen Genotyp zur Verfügung zu stellen, der die gewünschten Eigenschaften aufweist: den notwendigen Pollen für die Hybridisierung; einzigartige und einzelne Samen, auch solche, die keine Austrocknung vertragen; transformierte, mutierte Hybridzellen verschiedener Pflanzenarten, die zur Morphogenese in vitro fähig sind; zygotische und somatische Embryonen usw. Derzeit wurden Kryokonservierungsbedingungen für kultivierte Zellen von mehr als 30 Arten, Kalluskulturen (etwa 10 Arten), isolierte Protoplasten (8 Arten), die Konservierung von Meristemen (25 Arten) und Stammspitzen (13 Arten) entwickelt. Die Priorität in dieser Richtung liegt beim Institut für Pflanzenphysiologie der Russischen Akademie der Wissenschaften und insbesondere bei der Abteilung für Gewebekultur und Morphogenese unter der Leitung von Prof. R. G. Butenko.

Bei der Durchführung von Kryokonservierungsarbeiten müssen zunächst die Besonderheiten pflanzlicher Zellen berücksichtigt werden: Auswahl kleiner Zellen mit kleiner Vakuole und geringem Wassergehalt; entwickeln Ansätze zum Einfrieren und anschließenden Auftauen von Pflanzenzellen im Einzelfall. Bei der Kryokonservierung treten eine Reihe von Schwierigkeiten auf, von denen eine mit dem Schutz gefrorener Zellen und Gewebe vor osmotischem Stress und mechanischer Zerstörung von Strukturen durch die Bildung und das Wachstum von Eiskristallen im Inneren der Zelle zusammenhängt. Gleichzeitig ist es notwendig, die Bedingungen richtig auszuwählen, die ein hohes Überleben der Zellen während des Auftauens und der Rekultivierung gewährleisten.

Trotz der Vielfalt der Arbeiten in dieser Richtung skizzieren sie dennoch die allgemeinen Techniken, die der Kryokonservierung zugrunde liegen: Behandlung von Zellen vor dem Einfrieren, Verwendung von Kryoschutzmitteln, Einhaltung eines bestimmten Einfrierregimes im Bereich von 0 bis –40 °C (in seltenen Fällen bis hinunter). bis -70° C) sowie besondere Vorsichtsmaßnahmen beim Auftauen von Gegenständen.

Der Kryokonservierungsprozess beginnt normalerweise mit der Vorbereitung der Zellkultur zum Einfrieren. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden, indem Zellen auf Nährmedien kultiviert werden, die verschiedene osmotisch aktive Substanzen enthalten: Mannit oder Sorbit in einer Konzentration von 2–6 %, Aminosäuren und darunter vor allem Prolin, dessen Bedeutung für Die Bindung von Wasser in Pflanzenzellen ist weithin bekannt, ebenso wie γ-Aminobuttersäure.

Die Auswahl von Kryoprotektoren, Substanzen, die Zellschäden durch osmotischen und mechanischen Stress reduzieren, erfolgt empirisch nach dem Prinzip der geringsten Toxizität und optimalen Wirkung. Unter allen bekannten Kryoprotektoren werden Substanzen unterschieden, die leicht in Zellen eindringen: Dimethylsulfoxid (DMSO, 5–10 %), Glycerin (10–20 %), sowie nicht penetrierendes hochmolekulares Polyvinylpyrolidon (PVP), Dextran, Polyethylenglykol (PEG) mit Molekulargewicht 6000.

Von großer Bedeutung bei der Kryokonservierung ist der richtig gewählte Gefriermodus von 0 bis –40 °C. In der Regel wird für alle Objekte die Gefrierrate auf 0,5–1 °C pro Minute eingestellt und alle diese Arbeiten werden auf speziellen Geräten durchgeführt Bietet Software-Einfrieren. Solche Geräte werden von einem speziellen Design-Technologiebüro mit Pilotproduktion am Institut für Kryobiologie und Kryomedizin (Kharkov) hergestellt.

Durch langsames Einfrieren und die Verwendung von Kryoschutzmitteln ist es somit möglich, die Zelle von freiem Wasser zu befreien, und bei –40 °C werden die Zellen vollständig dehydriert, was ein weiteres Einfrieren ermöglicht, nämlich das Eintauchen von Ampullen mit Pflanzenmaterial Flüssigstickstoff.

Die Lagerung von Material in flüssigem Stickstoff ist praktisch unbegrenzt. In der Kryobank des Instituts für Pflanzenphysiologie der Russischen Akademie der Wissenschaften werden beispielsweise Karottenzellen aufbewahrt, die sich seit etwa 20 Jahren in flüssigem Stickstoff befinden, Kartoffelmeristeme seit mehr als 10 Jahren usw.

Das Auftauen und Testen der Zelllebensfähigkeit nach der Lagerung in flüssigem Stickstoff ist der letzte Schritt in der Kryokonservierungstechnologie. Wenn das Einfrieren langsam und schrittweise erfolgt, sollte das Auftauen so schnell wie möglich erfolgen. Dazu werden die Ampullen in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 40° und teilweise 60° C gestellt und dort aufbewahrt, bis der letzte Eiskristall vollständig verschwunden ist.

Um die Lebensfähigkeit von Zellen nach dem Auftauen zu bestimmen, wird die einfachste, schnellste und zufriedenstellendste Methode verwendet – die Färbung mit einem Vitalfarbstoff (0,1 % Phenosafranin oder 0,25 % Evans-Blau-Lösung), wodurch tote, aber lebende Zellen gefärbt werden sind nicht. Das letzte Kriterium ist natürlich die eindeutige Wiederaufnahme des Zellwachstums und der Zellteilung bei der Rekultivierung auf künstlichen Nährböden nach dem Auftauen.

Es wurde experimentell gezeigt, dass Zellen nach der Lagerung in flüssigem Stickstoff ihre Teilungsfähigkeit nicht verlieren, die Pflanzenregeneration, die Produktivität der Synthese von Sekundärmetaboliten (Produzentenzellen) usw. nicht abnimmt. So entwickelte das Institut für Pflanzenphysiologie der Russischen Akademie der Wissenschaften zusammen mit NGOs für den Kartoffelanbau Methoden zur Kryokonservierung von Meristemen von vier Kartoffelsorten und demonstrierte die Möglichkeit, ganze Pflanzen aus 20 % der gelagerten Meristeme zu regenerieren, die bei der Pflanzung im Feld, unterschied sich nicht in jeder Hinsicht, einschließlich Wachstumsraten und Produktivität, von herkömmlichen Reagenzglasanlagen (S. Manzhulin et al., 1982). Weitere Informationen zur Kryokonservierungstechnik finden Sie in den Übersichtsarbeiten von A. S. Popov.

Daher entwickelt sich die mit der Kryokonservierung von Pflanzenobjekten verbundene Technologie ständig weiter und wird ständig verbessert. Zweifellos hat diese Technologie Zukunft, da Kryobanken heute die Arbeit der Züchter erheblich erleichtern können, indem sie ihnen die Möglichkeit geben, den Genpool von Sorten, einschließlich alter Selektions- und Wildarten sowie gefährdeter Pflanzenarten, umfassend zu nutzen.

Für In-vitro-Experimente wurde Vollblut von 11 klinisch gesunden Freiwilligen und 36 Patienten mit thermischer Verletzung verwendet.

2.3. Forschungsmethoden

2.3.1. Immunologische Forschungsmethoden

2.3.1.1. Bewertung der spontanen und induzierten sekretorischen Aktivität mononukleärer Zellen des peripheren Blutes in vitro

Gegenstand der Studie war venöses Blut, das gesunden Freiwilligen und Patienten mit thermischer Verletzung morgens auf nüchternen Magen entnommen wurde. Das Blut wurde mit Heparin in einer Menge von 10 U/ml stabilisiert. Die mononukleäre Zellfraktion wurde mithilfe eines Gradientenverfahrens mit einer Dichte von 1,077 g/ml durch Zentrifugation (400 g 45 Minuten) unter Verwendung von Ficoll und Verografin isoliert. Um ein Medium mit einer Dichte von 1,077 g/cm3 zu bilden, wurden eine 9 %ige (w/v) Lösung von Ficoll-400 (DiaM, Moskau) und 60 % offizielles Urografin (Schering, Deutschland) verwendet. Der opaleszierende Ring mononukleärer Zellen wurde mit einer Pasteurpipette aus der Interphase entnommen und dreimal durch 5–7-minütige Zentrifugation mit Medium 199 bei 689 g gewaschen. Gewaschene und resuspendierte Zellen wurden auf eine Konzentration von 1·10 7 Zellen/ml gebracht. Ihre Lebensfähigkeit wurde durch Anfärben mit einer 0,2 %igen Trypanblau-Lösung beurteilt; die Lebensfähigkeit betrug mindestens 98 %.

Die Zellkultivierung erfolgte bei 5 % Kohlendioxid in Luft bei einer Temperatur von 37 °C für 1 Stunde. Unter sterilen Bedingungen wurde der Inhalt der Zellen abgesaugt und anschließend zweimal mit Hanks-Lösung gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Dann wurden 250 μl 10 % fötales Rinderserum und 80 μg/ml Gentamicin in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurden die Zellen 72 Stunden lang in einem Thermostat bei 5 % Kohlendioxid in der Luft und bei einer Temperatur von 37 °C kultiviert und die Konzentration der Zytokine im Überstand bestimmt.

2.3.1.2. Forschung zur angeborenen Immunität

Bestimmung der Leukozytenzahl und Leukozytenformel. Die Anzahl der Leukozyten im peripheren Blut wurde mit der allgemein anerkannten Melanger-Methode in der Goryaev-Kammer bestimmt. Die Leukozytenformel wurde in mit Methylalkohol fixierten und mit Azure II-Eosin gefärbten Blutausstrichen nach Romanovsky-Giemsa berechnet. Es wurden 200 Leukozyten mit Differenzierung von Eosinophilen, Basophilen, Metamyelozyten, Band- und segmentierten Neutrophilen, Lymphozyten und Monozyten gezählt. Ihre Menge wurde in relativen (%) und absoluten (109/l) Werten ausgedrückt.

Die funktionelle Aktivität von Phagozyten wurde anhand des NCT-Tests und der Phagozytose untersucht.

Untersuchung der Absorptionsfähigkeit peripherer Blutphagozyten durchgeführt am Modell der Absorption von Latexpartikeln. Zur Beurteilung der Phagozytose wurden 200 µl Blut mit 20 µl einer Suspension monodisperser (Durchmesser 1,7 µm) Polystyrol-Latexpartikel vermischt. Nach 60-minütiger Inkubation bei einer Temperatur von 37 0 C wurden aus der Suspension Präparate hergestellt, die getrocknet, mit Methanol fixiert und mit Azur II – Eosin nach Romanovsky-Giemsa angefärbt wurden. Mithilfe der Immersionsmikroskopie berücksichtigten wir die Aktivität der Phagozytose – den Prozentsatz der Zellen, die mindestens ein Latexpartikel einfingen, die Intensität der Phagozytose – die Anzahl der absorbierten Latex-Mikrokügelchen in 100 gezählten Zellen und die Phagozytosezahl – die Anzahl der absorbierten Latex-Mikrokügelchen pro Phagozyten.

NST-Test wurde unter Berücksichtigung der Intensität der Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT) durch Phagozyten in seine unlösliche Form - Diformazan nach der Methode von A.N. durchgeführt. Mayansky und M.E. Wixman (1979). Es wurden spontane und induzierte NBT-Tests durchgeführt.

0,1 ml einer 0,2 %igen Lösung von standardmäßig verdünntem Nitroblautetrazolium in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) wurden in Reagenzgläser mit 0,2 ml Blut gegeben. Zur Auswertung des induzierten NBT-Tests wurden in jede Vertiefung 20 μl einer Suspension monodisperser (Durchmesser 1,7 μm) Polystyrol-Latexpartikel (induzierte Serie) oder 20 μl 0,9 % NaCl (spontane Serie) gegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei einer Temperatur von 37 °C wurden 3 ml 0,1 %ige Salzsäure zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und aus dem Sediment wurden Ausstriche hergestellt. Nach dem Trocknen wurden die Präparate mit Methanol fixiert und 5 Minuten lang mit einer 0,1 %igen wässrigen Safraninlösung angefärbt. Mittels Mikroskopie bei einer Vergrößerung von 90 x 10 x 1,5 wurden der Prozentsatz der Zellen, die NBT wiederherstellen, und die Intensität der Reaktion basierend auf der Aktivität der NBT-Wiederherstellung bestimmt, wobei NBT-positive Zellen in drei Gruppen eingeteilt wurden:

1 – Zellen mit Diformazan-Granula im Zytoplasma mit einer Gesamtfläche von weniger als 1/3 der Kernfläche;

2 – Zellen mit Diformazan-Granula im Zytoplasma über 1/3 der Kernfläche;

3 – Zellen mit Diformazan-Körnchen, die die Größe des Zellkerns überschreiten.

Um den Reaktionsintensitätskoeffizienten zu erhalten, wurde die Anzahl der Zellen in der ersten Gruppe, ausgedrückt als Prozentsatz, mit 1 multipliziert, die der zweiten Gruppe mit 2, die dritte mit 3, die Ergebnisse wurden summiert und durch 100 dividiert.

Zellen altern nicht nur in vivo, sondern auch in vitro. Darüber hinaus zeigt sich unter In-vitro-Bedingungen besonders deutlich die Rolle der Hyperoxie, eines natürlichen und offenbar einzigen Faktors für ihr Altern unter diesen Bedingungen.
1.8.1. Bekanntlich erfolgt die Kultivierung von Zellen außerhalb des Körpers in speziellen Gefäßen (Flaschen) bei Atmosphärendruck und damit bei pO2, der deutlich über den normalerweise im Körper herrschenden Werten liegt. Typischerweise liegt der pO2 in der Inkubationsflüssigkeit nahe am pO2 von Luft. O2-Moleküle diffundieren frei durch eine dünne Nährmediumschicht im Fläschchen zu den Zellen und es stellt sich in ihnen ein hoher pO2 ein, der in vivo nicht möglich ist oder auf jeden Fall die zulässigen Werte überschreitet.
Aus der Sicht des Sauerstoff-Peroxid-Konzepts der Alterung scheinen In-vitro-Bedingungen für die Untersuchung des Prozesses der Zellalterung mehr als geeignet zu sein, da er unter diesen Bedingungen intensiver, schneller und, was sehr wichtig ist, in einem „ reine“ Form, d.h. in völliger Abwesenheit jeglicher Beeinflussung durch Körpersysteme, die beim Altern in vivo auftritt. Dieser Umstand ordnet viele Alterungstheorien sofort in die Kategorie der sekundären oder rein spekulativen Theorien ein, da altersbedingte Veränderungen ohne die Umsetzung der darin postulierten Bestimmungen auftreten oder eintreten können. Die Bedeutung, die wir dem Phänomen der Zellalterung in vitro beimessen, beruht auf der Tatsache, dass es unter diesen „einfachen“ Bedingungen möglich sein wird, die physikalisch-chemischen Grundlagen des Alterns und das Wesen der Biologie dieses Prozesses im Allgemeinen besser zu verstehen schnell und mit weniger Schwierigkeiten.
Derzeit besteht jedoch kein Konsens über die gemeinsamen Ursachen und Mechanismen der Alterung von Zellkulturen und der Alterung von Zellen in einem vielzelligen Organismus, was durch gegensätzliche Standpunkte in der Literatur belegt wird (Kapitanov, 1986). Kanungo (1982) zum Beispiel glaubt zwar, dass der Grund für die Alterung eines Organismus in der Alterung seiner Zellen liegt, glaubt aber gleichzeitig: „In-vitro-Bedingungen entsprechen nicht den physiologischen und die Eigenschaften von Zellen können es sein.“ verändert sein. Während In-vitro-Studien einige nützliche Informationen über die Zelle selbst liefern, sind sie für die Alterung des Organismus als Ganzes nur von begrenztem Wert.“ Der obigen Aussage kann man nur teilweise zustimmen. Tatsächlich kann die Zellalterung in vitro nicht das gesamte komplexe Spektrum altersbedingter Veränderungen widerspiegeln, die im gesamten Organismus auf allen Ebenen auftreten und darüber hinaus weitgehend durch das System verschiedener Verbindungen darin, einschließlich Rückkopplungen, bestimmt werden. Bei der Anwendung auf In-vitro-Bedingungen verlieren einige Prinzipien des Alterns, die sich auf der Ebene des Organismus manifestieren, ihre Bedeutung (siehe Abschnitt 1.1.2), einige von ihnen wirken jedoch weiterhin in Zellkulturen. Dies sind insbesondere die multifokale Natur des Alterungsprozesses, d.h. die Entwicklung von Schäden in verschiedenen Teilen der Zelle oder in ihren unterschiedlichen molekularen Zyklen und die Heterochronie des Alterns zwischen Zellen desselben Kulturtyps. Darüber hinaus sollten sich unter diesen Bedingungen die Prinzipien der Irreversibilität, der unregulierten und kontinuierlichen Zellalterung offensichtlich deutlicher manifestieren.
Die oben genannten Mängel bei der Untersuchung der Zellalterung außerhalb des Körpers scheinen nicht grundlegend zu sein, wenn man bedenkt, dass eine der Hauptaufgaben der Gerontologie darin besteht, den wichtigsten primären Umweltfaktor zu ermitteln, der die Alterung aller lebenden Organismen vorgibt. Wir glauben, dass ein solcher Faktor die Hyperoxie in der Erdatmosphäre ist, sodass das Leben von Zellen in vitro als geeignetes experimentelles Modell zur Untersuchung der Auswirkung dieses besonderen physikalischen Faktors auf deren Alterung angesehen werden kann. Der übliche O2-Gehalt der Luft von 18–21 % und die entsprechend hohen Ungleichgewichtswerte Δ (PO – AO) und Peroxygenaseprozesse wirken sich dämpfend auf subzelluläre Elemente sowie auf normale physiologische und metabolische Prozesse aus. Infolgedessen verblassen letztere allmählich und die meisten Zellen sterben aufgrund der oxidativen Zytolyse oder des Sauerstoffperoxid-Mechanismus der Apoptose (siehe Abschnitt 7.1).
Es gibt mehr als genug Beweise, die auf die führende Rolle von überschüssigem pO2, ROS und LPO bei der Verringerung des Zellüberlebens in vitro und auf die schützende Wirkung verschiedener antioxidativer Faktoren hinweisen (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner et al. , 1998). L-Carnosin wurde kürzlich als eines der letzteren eingestuft. Die Zugabe physiologischer Konzentrationen davon zu Standardmedien erhöht die Lebensdauer menschlicher Fibroblasten in vitro und verlangsamt die physiologischen Alterungsprozesse in ihnen. Zellen, die über einen langen Zeitraum in regulären Medien passagiert wurden, zeigten nach der Übertragung auf ein Carnosin-haltiges Medium eine verjüngende Wirkung. Das optische Isomer D-Carnosin hatte diese Eigenschaften nicht (Halliday und McFarland, 2000). Gleichzeitig kommt es während der Langzeitkultivierung zu einem bestimmten Prozentsatz der Zellen, der nicht nur nicht abgebaut wird, sondern sich auch an toxische oxidative Bedingungen anpasst. „erreichen“, dass der intrazelluläre Parameter Δ (PO – AO) nicht auf hohe Werte von ΔA2 oder ΔC ansteigt, sondern bei einem etwas niedrigeren Wert von ΔK stoppen kann, der für ihre maligne Transformation notwendig ist. Fälle von „spontaner“ Malignität von Zellen in Kultur und deren möglicher Mechanismus werden in Kapitel 4 gesondert besprochen.
1.8.2. Die obigen Überlegungen können als Teil unserer theoretischen Grundlagen über die Ursachen und Folgen der Zellalterung in vitro betrachtet werden. Um diese Bestimmungen zu bestätigen und weiterzuentwickeln, ist es selbstverständlich, auf einige bereits bekannte Fakten zurückzugreifen, deren Inhalt und Bedeutung leicht in das Sauerstoff-Peroxid-Konzept der Zellalterung „eingepasst“ werden können. Beginnen wir mit der Tatsache, dass die oben beschriebenen herkömmlichen Bedingungen für die Zellkultivierung, die für sie toxisch sind, durch eine künstliche Reduzierung der O2-Konzentration in der Gasumgebung abgemildert werden können. Gleichzeitig soll die hemmende Wirkung der Hyperoxie und die Geschwindigkeit der Zellalterung abnehmen. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass sich herausstellte, dass eine so bekannte biologische Konstante wie die Hayflick-Grenze tatsächlich ein variabler Wert war, der vom O2-Gehalt in der Gasumgebung abhängt, und dass diese Grenze unter oxidativen Stressbedingungen abnimmt, und zwar mit a Der pO2-Wert sinkt, im Gegenteil, er steigt (Chen et al., 1995).
Tatsächlich verlängert die Aufbewahrung einer Fibroblastenkultur in einer Atmosphäre mit niedrigem O2-Gehalt (10 %) ihre Lebensdauer um 20–30 %. Das Gleiche passiert mit Lungenzellen von Menschen und Mäusen (Packer und Walton, 1977). Der Zeitraum der proliferativen Lebensfähigkeit menschlicher diploider Fibroblasten IMR90 mit unterschiedlichen Anfangsniveaus der Populationsverdoppelung verlängert sich, wenn der O2-Gehalt im Medium auf 1,6 oder 12 % sinkt. Dieser Zeitraum verlängert sich bei 1 % O2 um 22 %, und die Rückkehr von Kulturen aus einer Umgebung mit 1 % O2 in eine Umgebung mit 20 % O2 führt zu einer schnellen Alterung. In einer Kultur diploider Fibroblasten eines Patienten mit Werner-Syndrom (frühes Altern) erhöht sich auch die Dauer der replikativen Lebensfähigkeit mit einer Abnahme des pO2 (Saito et al., 1995). Eine Verlangsamung der Alterung kultivierter Chondrozyten von Hühnerembryonen wurde bei einem O2-Gehalt in der Atmosphäre von 8 % im Vergleich zur Kontrolle (18 %) gezeigt, und die experimentellen Zellen behielten die Eigenschaften „junger“ länger bei und hatten eine höhere Proliferationsrate (Nevo et al., 1988). Unter dem Einfluss verschiedener Antioxidantien erhöht sich auch die Proliferationsrate von Zellkulturen und ihre Alterung verlangsamt sich (Packer und Walton, 1977; Obukhova, 1986), was bestätigt, was oben bereits gesagt wurde: Die deutlich übermäßige Wirkung von Oxidationsmitteln unterdrückt Zellproliferation und beschleunigt deren Alterung.
In Experimenten mit Zellkulturen lässt sich zudem relativ einfach die Wirkung des O2-abhängigen Mechanismus zur Regulierung der Anzahl von Atmungsenzymen (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) und Mitochondrien (Ozernyuk, 1978) testen. . Nach diesem Mechanismus sollten bei einem sanften und langsamen Anstieg des Hyperoxieniveaus der Gehalt an solchen Enzymen und die Anzahl der Mitochondrien allmählich zunehmen, bei Hypoxie hingegen sollten sie sinken. Tatsächlich nimmt die Konzentration der Cytochrome erheblich ab, wenn eine Fibroblastenkultur in einem Medium mit reduziertem O2-Gehalt gezüchtet wird (Pius, 1970). Hierbei handelt es sich natürlich um den objektiven Prozess der Anpassung des Atmungssystems an den intrazellulären pO2-Wert. Bei diesem Phänomen ist jedoch die Geschwindigkeit der Anpassung nicht weniger wichtig, von der die Intensität der Alterung kultivierter Zellen abhängt. Es scheint offensichtlich, dass sich im Laufe der biologischen Evolution ein vielzelliger Organismus auch nach und nach an den allmählichen Anstieg des pO2 in der Erdatmosphäre angepasst hat. Gleichzeitig kann im Inneren der Zellen der „mitochondriale“ Anpassungsmechanismus als der wirksamste angesehen werden: Die Anzahl der Enzyme der Atmungskette und der Mitochondrien selbst variiert durch ein selbstorganisierendes System, sodass die Integrität und ein relativ normales Funktionieren gewährleistet sind von Zellen, wenn sich der intrazelluläre pO2 innerhalb bestimmter evolutionär nachgewiesener Grenzen ändert.
Eine völlig andere Situation ergibt sich, wenn Zellen schnell von einem lebenden Organismus auf In-vitro-Bedingungen übertragen werden. Ein plötzlicher Übergang in einen Zustand der Hyperoxie kommt einer erheblichen abrupten Störung gleich, auf die sie im Allgemeinen nicht vorbereitet sind. Wie reagiert die primäre Zellkultur auf eine solche Störung? Anscheinend ist das Kulturmedium während einer bestimmten Anfangsphase „stressig“ für die Zellen, und der Zustand der Zellen selbst während dieser Zeit ist ein Schock. Dann wird einige Zeit damit verbracht, adaptive „Ereignisse“ antioxidativer Natur vorzubereiten und durchzuführen, die unter diesen extremen Bedingungen möglich sind. Wahrscheinlich ist es aufgrund letzterer zunächst möglich, nicht nur den oxidativen Abbau zu vermeiden, sondern auch Bedingungen für die Stimulierung des Proliferationsprozesses zu schaffen und das anfänglich hohe, eindeutig „zytotoxische“ intrazelluläre Ungleichgewicht ΔC (PO - AO) auf das erforderliche Maß zu reduzieren für die oxidative Mitogenese. Diese Phase im Leben einer Primärkultur kann jedoch nur durch die hyperoxische Umgebung begrenzt werden, die sie ständig unterdrückt. In dieser Situation beginnt der adaptive Mechanismus selbst inaktiviert zu werden, das Wachstum des antioxidativen Systems nimmt entsprechend ab und anschließend kommt es zu dessen Rückbildung. Bei einem hohen LPO-Gehalt werden zunächst Mitochondrien geschädigt (siehe Abschnitt 1.3), deren Zahl bei einem allmählichen Anstieg des pO2 in der Gasumgebung als adaptiver Akt weiter zunehmen würde.
Die Unfähigkeit der adaptiven Mechanismen der Zelle, plötzlich auftretende Hyperoxie schnell und vollständig zu neutralisieren, einerseits und die hohe Anfälligkeit der mitochondrialen Einheit unter peroxidativem Stress andererseits bestimmen den irreversiblen Prozess der Zelldegeneration nach dem Auftreten einer „ „kritisches Niveau“ des Schadens in ihnen. Hier ist es noch einmal wichtig anzumerken: Zerstörerische Veränderungen in den Mitochondrien als Hauptverbraucher von O2 und in diesem Sinne als wichtigster Anti-Sauerstoff-Schutzniveau im Antioxidationssystem der Zelle lassen für die meisten Zellen unter rauen Bedingungen keine Hoffnung auf Überleben vitro, da in diesem Fall der Adapt selbst gestört ist – aktiver Mechanismus zur Senkung der intrazellulären pO2- und LPO-Spiegel. Die obigen Überlegungen stimmen voll und ganz mit der primären Rolle von Veränderungen in Mitochondrien bei der Auslösung des Alterungsmechanismus überein, die jedoch in Bezug auf in vitro kultivierte Fibroblasten postuliert wird (Kanungo, 1980).
Peroxidativer Stress und die toxische Wirkung in vitro können noch verstärkt werden, wenn LPO-Katalysatoren wie Fe2+- oder Cu2+-Ionen in das Kulturmedium eingebracht werden. Tatsächlich führte die Zugabe von Kupfersulfat in einer Konzentration von 60 mg/l zum Kulturmedium zu einer deutlichen Verkürzung der durchschnittlichen Lebensdauer von Rädertierchen um 9 % sowie zu einem deutlich deutlicheren Anstieg der MDA-Menge als bei die Kontrolle. Die Autoren dieses Experiments (Enesco et al., 1989) gehen logischerweise davon aus, dass die Verringerung der Lebenserwartung auf die Beschleunigung der Prozesse der Erzeugung freier Radikale durch Kupferionen zurückzuführen ist. Die angegebene Konzentration an Kupfersulfat erwies sich als optimal, da höhere Konzentrationen (90 und 180 mg/l) zu giftig für Rädertiere waren und niedrigere Konzentrationen (30 mg/l) wirkungslos waren.
Somit sind die irreversible beschleunigte Alterung und der oxidative Abbau von Zellen während eines starken Wechsels der Umgebung von in vivo zu in vitro eine Folge ihrer unzureichenden Bereitschaft, einen derart starken Anstieg der Sauerstoffexposition ohne schwerwiegende negative Folgen zu akzeptieren. Wenn ein so abrupter Übergang zu neuen Bedingungen durch einen „weichen“, beispielsweise mehrstufigen und über die Zeit ausgedehnten Übergang ersetzt wird, können wir davon ausgehen, dass die inhärente Fähigkeit der Zellen, sich an eine allmählich zunehmende Hyperoxie anzupassen, in diesem Fall voll zur Geltung kommt erkannte. Darüber hinaus ist es auf diese Weise grundsätzlich möglich, eine Zellanpassung nicht nur an den üblichen O2-Gehalt in der Atmosphäre von 18–21 % zu erreichen, sondern auch an künstlich geschaffene hyperoxische Umgebungen, die diesen deutlich überschreiten. Zur Untermauerung des Gesagten verweisen wir auf die sehr überzeugenden Fakten von Welk et al. (Valk et al., 1985). Durch die allmähliche Anpassung an steigende O2-Konzentrationen erhielten sie eine Linie von Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, die gegen einen hohen O2-Gehalt resistent ist und sich selbst bei 99 % O2 in der Atmosphäre vermehren kann. Es stellte sich heraus, dass alle Abwehrstufen – Anti-Sauerstoff, Anti-Radikal und Anti-Peroxid – an eine solch signifikante Hyperoxie und die davon abhängigen Prozesse angepasst waren (weitere Einzelheiten zu diesen Ergebnissen finden Sie in Kapitel 4).
1.8.3. Die vorgestellten Überlegungen zu den Besonderheiten von Veränderungen des Prooxidantien-Antioxidantien-Ungleichgewichts in kultivierten Zellen als Hauptwirkfaktor bei deren Alterung und Transformation lassen sich grob grafisch darstellen (siehe Abb. 11). Kurve 1, die diese Veränderungen während der schnellen Bewegung von Zellen in ein In-vitro-Medium widerspiegelt, unterscheidet drei zeitlich aufeinanderfolgende Stadien, die der in der Literatur bekannten Anpassungsphase (latent), der logarithmischen Wachstumsphase und der stationären Phase zu entsprechen scheinen . In diesem Fall ist die Alterung von Zellkulturen normalerweise mit Prozessen in der stationären Phase verbunden, wo sie im Laufe der Zeit verschiedene Veränderungen durchlaufen, die denen ähneln, die in Zellen innerhalb eines alternden Organismus beobachtet werden (Kapitanov, 1986; Khokhlov, 1988). Insbesondere während der Zellalterung in vitro verändern sich Enzyme und es kommt zu ihrer Aneu- und Polyploidisierung (Re-macle, 1989). Wie Zellen in vivo akkumulieren kultivierte Zellen mit zunehmendem Alter Lipofuszinkörnchen (Obukhova und Emanuel, 1984), was auf das offensichtliche Auftreten von Peroxidationsprozessen und oxidativen Störungen in der Struktur von Lipiden und Proteinen hinweist. Diese und eine Reihe anderer Tatsachen können auf die eine oder andere Weise mit der Hypothese über den Sauerstoffperoxid-Mechanismus (freie Radikale) des Alterns übereinstimmen. Dieser Mechanismus wird vor allem durch die Daten gestützt, dass bei einer Erhöhung der Antioxidantienkonzentration die Lebensdauer der Zellen in vitro länger ist und bei einer Verringerung kürzer als bei der Kontrolle. Solche Ergebnisse wurden beispielsweise durch Veränderung des Gehalts an GSH in menschlichen Fibroblasten (Shuji, Matsuo, 1988), Katalase und SOD in kultivierten Neuronen (Drukarch et al., 1998) erzielt.
Was die flachen und relativ gleichmäßig ansteigenden Kurven 2 in Abb. 11, dann wird ihre solche Natur durch die Tatsache erklärt, dass auf jeden kleinen künstlich erzeugten Anstieg der prooxidativen Komponente des Ungleichgewichts Δ (PO - AO) in der Zelle mit einer gewissen Verzögerung ein entsprechender adaptiver Anstieg des Antioxidans folgt Komponente darin. Die wiederholte Wiederholung dieser Aktion gewährleistet die Anpassung und das Überleben der Zellen mit einem allmählichen, schrittweisen Anstieg des Hyperoxieniveaus.
Achten wir in beiden Fällen auf die Varianten, die zur sogenannten „spontanen“ Malignität von Zellen führen (siehe Kapitel 4). Dieses Phänomen kann aus unserer Sicht nur in den Zellen realisiert werden, in denen das Ungleichgewicht ΔK-Werte erreicht, die die Ungleichung stabil erfüllen (siehe Abschnitt 1.1.2).
ΔP (PO – AO), oder genauer, unter Berücksichtigung „apoptotischer“ Ungleichgewichte, – das Verhältnis (siehe Abschnitt 7.1.1)
ΔA1 (PO - AO) Mit Hilfe solcher Verfahren werden letztendlich kontinuierliche Linien transformierter Zellen und Tumorzellen gebildet, die für eine langfristige Existenz außerhalb des Körpers fähig sind. Im Kontext der von uns betrachteten Probleme ist es wichtiger, sich für einen Ansatz zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Alterung und Karzinogenese zu entscheiden. Eine davon, nämlich die Untersuchung des Entstehungsprozesses von Tumorzellen während der Alterung normaler Zellkulturen (Witten, 1986), scheint die natürlichste und daher vorzuziehende zu sein

Ansatz. Wenn im Intervall zwischen ΔK und ΔC ein Ungleichgewicht von Δ (PO – AO) festgestellt wird, können Zellen eine Apoptose vom Typ A2 durchlaufen (siehe Abschnitt 7.1.1).
Nach der Telomertheorie ist die replikative Alterung von Zellen, auch in vitro, mit einer Verkürzung der Telomere nach jeder Mitose bis zu einer bestimmten Mindestlänge verbunden, was zum Verlust der Teilungsfähigkeit dieser Zellen führt (siehe Abschnitte 1.4. 3 und 1.4 .4). Eine Analyse der bekannten Literatur zu diesem Thema zeigt, dass dieses Postulat in einigen Fällen nicht bestätigt wird. Dies wird durch die Studien von Carman et al. veranschaulicht. (Carman et al., 1998), durchgeführt an diploiden embryonalen Zellen des Syrischen Hamsters (SHE). Diese Zellen hörten nach 20–30 Verdoppelungszyklen auf, sich zu vermehren und verloren die Fähigkeit, nach Stimulation mit Serum in die S-Phase einzutreten. Gleichzeitig exprimierten SHE-Zellen während des gesamten Replikationslebenszyklus Telomerase und die durchschnittliche Telomergröße nahm nicht ab. Es stellt sich heraus, dass in vitro Zellen manchmal durch Mechanismen altern können, die nicht mit dem Telomerverlust zusammenhängen.
Es scheint uns, dass in diesem Fall die Hyperoxie-Bedingungen in der Kultivierungsumgebung ihre eigenen Anpassungen vornehmen. Wenn in einem Zustand mäßig erhöhter Werte ROS und Peroxidation häufig positive Funktionen erfüllen und einzelne Stufen des mitogenen Signals, der Replikation, der Transkription und anderer Prozesse aktivieren (dies wurde in mehreren vorherigen Absätzen besprochen und wird in einigen folgenden Abschnitten erwähnt), Dann sind bei starkem oxidativem Stress auch negative Folgen vorprogrammiert. Beispielsweise können einige Makromoleküle, einschließlich derjenigen, die an der Mitogenese beteiligt sind, verändert werden, was unabhängig von der Telomeraseaktivität und der Telomerlänge die Proliferation hemmen und/oder andere Störungen hervorrufen sollte, die sogar zum Zelltod führen sollten.
Wie dem auch sei, zwei Gründe für die Zellalterung in vitro – die Anhäufung von Fehlern unter den Bedingungen ihrer Kultur und die Verkürzung der Telomere – bleiben immer noch die wahrscheinlichsten. Es wird angenommen, dass in beiden Fällen die Proteinsysteme p53 und Rb aktiviert werden und wenn ihre Funktion gestört wird, kommt es zu einer Zelltransformation (Sherr und DePinho, 2000). Im allgemeineren Sinne sehen wir Folgendes: Unter toxischen hyperoxischen Kultivierungsbedingungen unterliegen normale Zellen, die altern, höchstwahrscheinlich einer A1-Apoptose und Tumorzellen einer A2-Apoptose. Bei Problemen im Apoptosemechanismus unterliegen die ersteren einer neoplastischen Transformation, während die letzteren einer oxidativen Zytolyse unterliegen (siehe Abschnitt 7.1.1).
Ein weiterer Grund, der zur Intensivierung der Prozesse der oxidativen Zerstörung in Zellen in vitro beiträgt, kann als Wärme als ständig wirkender Umweltfaktor angesehen werden. Tatsächlich wurde mithilfe einer hochempfindlichen Methode (beschrieben von den Autoren Bruskov et al., 2001) gezeigt, dass ROS in wässrigen Lösungen unter dem Einfluss von Wärme erzeugt werden. Durch die thermische Aktivierung des in Wasser gelösten atmosphärischen O2 kommt es zu einer Abfolge von Reaktionen
О2 → 1О2 → О → HO2˙ → H2O2 → OH˙.
Die entstehenden ROS tragen offenbar durch ihre „Autoxidation“ zur thermischen Schädigung von DNA und anderen biologischen Molekülen bei.
Abschließend weisen wir auf eine weitere Möglichkeit hin, den Prozess der Zellalterung in vitro mithilfe des Anoxieverfahrens zu intensivieren – die Reoxygenierung, deren Ergebnisse unserer Meinung nach die Essenz des Sauerstoff-Peroxid-Alterungsmodells am deutlichsten widerspiegeln. Die Grundlage des Alterungsmechanismus bilden in diesem Fall zwei grundlegende Effekte: adaptive Reduktion (Schwächung) der mitochondrialen Basis während der Zeit der Anoxie oder Hypoxie (siehe oben); ein signifikanter Anstieg von LPO und anderen Prozessen der oxidativen Zerstörung während der anschließenden Reoxygenierung aufgrund eines starken Anstiegs des pO2 (im Verhältnis zum Zustand der Anoxie) und der Unmöglichkeit einer schnellen Nutzung von überschüssigem O2 durch „anoxische“ Mitochondrien. Der Grad des peroxidativen Stresses und damit die Geschwindigkeit der Zellalterung hängen von der Dauer ihres Aufenthalts im Anoxiezustand ab: Je länger dieser Zeitraum, desto besser kann sich die mitochondriale Basis an niedrige pO2-Werte anpassen und desto bedeutender ist die Zelle Der Schaden wird nach der Beseitigung der Ischämie eintreten.
Ein Beispiel für die Umsetzung der Zellalterung gemäß dem angegebenen „Szenario“ ist die folgende Tatsache. Aus Ratten unterschiedlichen Alters isolierte Hepatozyten wurden einer zweistündigen Anoxie und einer einstündigen Reoxygenierung unterzogen. Es wurde festgestellt, dass Hepatozyten in der Reoxygenierungsphase eine große Menge an Sauerstoffradikalen produzieren, die für Schäden an ihren Membranen und für andere strukturelle und funktionelle Veränderungen im Zusammenhang mit dem Altern verantwortlich sind, und dass alte Zellen empfindlicher auf Reperfusionsschäden reagieren (Gasbarrini et al ., 1998). Ähnliche Fakten betrachten wir auch in Kapitel 4 im Zusammenhang mit der Diskussion des Mechanismus der Alterung und der „spontanen“ Malignität von Zellen in Kultur.

Kandidat der Agrarwissenschaften spricht über die Möglichkeiten der Biotechnologie. Dmitry Kravchenko vom Allrussischen Forschungsinstitut für Kartoffelanbau.

Wachstum und Entwicklung unter Kontrolle:

Möglichkeiten der Kartoffelbiotechnologie In vitro

Die Regulierung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung ist eine wichtige Aufgabe der modernen Biologie. Die Untersuchung regulatorischer Mechanismen auf zellulärer Ebene, die die grundlegenden Vitalfunktionen einer Pflanze steuern, Möglichkeiten zur Steuerung physiologischer Prozesse und regulatorischer Mechanismen einer Pflanzenzelle eröffnet breite Perspektiven für die Nutzung potenzieller Chancen.

Warum brauchst du einen Job? in vitro ?

Biotechnologische Methoden im Zusammenhang mit der Kultivierung unter BedingungenIn vitro sind zu einem integralen Bestandteil des technologischen Prozesses der Vermehrung von Ausgangspflanzen für die ursprüngliche Kartoffelsamenproduktion geworden. Zur Verbesserung der Gesundheit durch apikale Meristemmethoden und beschleunigte KulturvermehrungIn vitro Um eine größtmögliche Menge an gesundem Ausgangsmaterial für die weitere Durchführung des Saatgutproduktionsprozesses zu erhalten, ist es notwendig, die Wachstums- und Entwicklungsprozesse der Kartoffelpflanzen unter beiden Bedingungen zu optimieren und zu intensivierenIn vitro , und wenn Sie gesunde Miniknollen erhalten.

Warum müssen Sie Wachstumsprozesse steuern? Nennen wir die Hauptrichtungen der Arbeit im KartoffelanbauIn vitro :

— Verbesserung der Kartoffelsorten vor viralen und anderen Infektionen (apikale Meristemmethode in verschiedenen Kombinationen und Modifikationen);

— Einführung in die KulturIn vitro Explantate aus einer völlig gesunden Kartoffelpflanze;

— mikroklonale Vermehrung von Kartoffelsorten im Rahmen der ursprünglichen Saatgutproduktion;

— Gewinnung von Kartoffel-Mikroknollen;

— langfristige Pflege der Sammlungen von Kartoffelgenotypen;

— selektionsgenetische und andere Forschungsarbeiten, für deren Umsetzung Material erforderlich istIn vitro .

Iona Skulachev

Betrachten wir die Möglichkeiten zur Steuerung von PflanzenwachstumsprozessenIn vitro in den Stadien der Heilung und mikroklonalen Vermehrung.

Im Stadium der Gewinnung von Regenerationsmitteln aus meristematischen Explantaten sind die Indikatoren der Überlebensrate von Objekten, die Intensität der Prozesse ihrer Morphogenese und der Zeitpunkt der Regeneration von entscheidender Bedeutung. Um diese Parameter zu verbessern, empfehlen wir die Verwendung einer neuen Klasse von Nanoprodukten mit geroprotektiven Eigenschaften – Skulachev-Ionen. Synthetisiert am Forschungsinstitut für physikalische und chemische Biologie, benannt nach A.N. Belozersky (MSU benannt nach M.V. Lomonosov) VorbereitungenSkQ (Skulachev-Ionen) sind Verbindungen von Triphenyldecylphosphonium-Kationen und Chloroplasten-Plastochinon-Analoga. Sie regulieren das intrazelluläre Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies und unterscheiden sich in der Penetrationsfähigkeit und dem Verhältnis von Anti- und Prooxidase-Aktivität.

Ein Medikament hinzufügenSkQ1 In ein künstliches Nährmedium mit einer Nanokonzentration von 2,5 nM verbessert sich die Überlebensrate von Meristem-Explantaten von Sorten mit kürzerer Vegetationsperiode um 16–43 % und von Sorten mit längerer Vegetationsperiode um 7–13 %.

Gleichzeitig wird ein deutlicher Anstieg der morphogenen Aktivität und Wachstumsintensität von Explantaten beobachtet, wodurch die Regenerationszeit von Mikropflanzen aus Meristemgewebe um 24 % verkürzt wird– 30 Tage.

Nach der Transplantation in ein neues Nährmedium werden Mikropflanzen aus Regeneraten gewonnenSkQ1 , zeichneten sich durch schnelleres Wachstum und bessere biometrische Parameter aus. In Bezug auf eine Reihe von Indikatoren waren in Medien gewonnene Pflanzen führend: beim anfänglichen Wachstum von Meristemen und beim weiteren Pflanzenwachstum.

Noch schneller

Somit 50 Tage nach der Isolierung der Meristeme bei Verwendung des ArzneimittelsSkQ1 Es wurden vollwertige Pflanzen erhalten, die für weitere Stecklinge und Tests auf latente Infektionen mit Viren mit der ELISA-Methode geeignet waren. Und weitere 15–20 Tage nach dem Steckling könnten die nachgewachsenen Pflanzen in die Erde eines Gewächshauses oder Freilandes gepflanzt werden, um die Sortentypizität zu beurteilen und Miniknollen zu erhalten. Dadurch kann die Gesamtzeit von der Isolierung des Meristems bis zum Einpflanzen gesunder Pflanzen in den Boden auf 65–80 Tage verkürzt werden. Auch die quantitative Leistung der Linien steigt und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Sanierung.

Mit dem automatisierten System Fitotron TF 600 können Sie ähnliche Ergebnisse ohne den Einsatz zusätzlicher wachstumsstimulierender Substanzen erzielen. In Kombination mit diesen erhöht sich die morphogene Aktivität der Regenerationsmittel um 12–21 %, und die Zeit bis zum Erhalt erster gesunder Pflanzen wird verkürzt 7–14 Tage.

Darüber hinaus wird derzeit die Wirkung von Lichtstrahlung unterschiedlicher spektraler Zusammensetzung auf die Reduzierung von Virusinfektionen in Pflanzen erforschtIn vitro .

Beschleunigen von Stecklingen

Nach Erhalt gesunder, zunächst regenerierter Pflanzen ist der nächste wichtige Schritt der Fortpflanzung deren weitere Vermehrung. Die Herausforderung besteht darin, das Volumen des Ausgangsmaterials schnell zu erhöhen und gleichzeitig eine hohe potenzielle Wachstumsenergie und Produktivität sowie einen pathogenfreien Status aufrechtzuerhalten.

Der Prozess der mikroklonalen Vermehrung sollte in zwei Phasen unterteilt werden: Beschleunigung der Stecklinge und letzter Steckling vor dem Einpflanzen unter Bedingungenin vivo . Beschleunigungsstecklinge sollten wirklich die maximale Vermehrungsrate innerhalb des im Saatgutproduktionsprogramm festgelegten Zeitrahmens gewährleisten. Im letzten Durchgang gilt es, Pflanzen zu formen, die sich anschließend optimal an die Wachstumsbedingungen im Boden anpassen und einen hohen Ertrag an Standard-Miniknollen produzieren. Daher können in verschiedenen Stadien der Mikrovermehrung unterschiedliche chemische Regulatoren und unterschiedliche physikalische Kultivierungsbedingungen verwendet werden.

Bedingungen bereitstellen

Basierend auf den Ergebnissen früherer Studien empfehlen wir die Verwendung des Arzneimittels Epin zur Beschleunigung des Stecklings (synthetisches Epibrassinolid), das die Morphogenese von Pflanzenstängeln beschleunigtIn vitro und erhöht die Reproduktionsrate. In der letzten Stecklingsphase wurde der Wirkstoff Fumar (Aminofumarsäure-Dimethylester) empfohlen, der die Rhizogenese bei Kartoffelpflanzen stimulierte und in der Nachwirkung einen anhaltenden positiven Effekt hatte, der die Kartoffelerträge in Feldgärtnereien um 9–15 % steigerte.

Durch eine sorgfältige Untersuchung der neuen Generation wachstumsregulierender Substanzen, die in den letzten Jahren synthetisiert wurden, wurde ein Medikament identifiziert, das bei Zugabe zu einem künstlichen Nährmedium die Anzahl der Blätter von Kartoffel-Mikropflanzen und damit den Reproduktionskoeffizienten auf 9–9 erhöht. 15 Stück. je nach Sorte.

Ähnliche Ergebnisse können jedoch auch durch den Anbau von Pflanzen erzielt werdenIn vitro auf einem Standard-Murashige-Skoog-Nährmedium bei gleichzeitiger Optimierung aller physikalischen Parameter der Kultivierung, die mit der Fitotron TF 600-Anlage bereitgestellt werden können.

Es ist möglich, aber seien Sie vorsichtig

Somit ein wirksames Werkzeug im Arsenal der Manipulation von Objekten in der Kulturin vitro begann mit dem Einsatz biologisch aktiver Substanzen, die gezielt auf physiologische Prozesse und Regulationsmechanismen des intrazellulären Stoffwechsels einwirken. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass viele biologisch aktive Substanzen eine mehr oder weniger ausgeprägte mutagene Wirkung haben. Für die Bereiche der Kulturarbeit sollten sie mit besonderer Sorgfalt und Umsicht ausgewählt werdenin vitro , bei dem die Stabilität der Kartoffelsortenmerkmale am stärksten gefährdet ist.

Andererseits ermöglicht die Einführung moderner technologischer Lösungen in die Praxis der ursprünglichen Kartoffelsaatgutproduktion, wie z. B. Kammern mit kontrollierten physikalischen Bedingungen (Phytotron TF 600 und seine Analoga), eine teilweise Lösung des Problems der Kontrolle von Pflanzenwachstumsprozessenin vitro ohne den Einsatz chemischer Regulierung.